李昱錕，宋春麗，任 健

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心，黑龍江齊齊哈爾161006；3.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

黑豆是營養(yǎng)價值很高的雜糧作物[1]，富含蛋白質(zhì)[2]、纖維素及人體所需氨基酸，是我國極具開發(fā)潛力的特色植物資源[3-4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，食源性蛋白肽具有抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]等生物活性功能，且不會對機(jī)體產(chǎn)生毒副作用，受到了學(xué)者們的關(guān)注[8-11]。目前，植物源蛋白肽研究主要以玉米肽和大豆肽為主。有研究表明，玉米肽-鋅螯合物可以提高細(xì)胞免疫和體液免疫功能[12]，大豆肽具有免疫調(diào)節(jié)作用[13]，能夠顯著促進(jìn)人體淋巴細(xì)胞亞群的增殖，提高人體免疫能力[14]，而目前黑豆肽免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的研究仍鮮有報道。因此，試驗(yàn)通過分析黑豆肽對正常小鼠的免疫臟器指數(shù)、血清中細(xì)胞因子、免疫球蛋白、脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)等指標(biāo)的影響來評價其免疫調(diào)節(jié)作用，以便為黑豆源免疫肽的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）、RPMI-1640培養(yǎng)液、MTT溶液（5 mg/mL）、胎牛血清，北京默飛生物科技有限公司提供；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司提供；雄性ICR小鼠，長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供[生產(chǎn)許可證：SCXX（吉）2018-0007]。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；LXJ-2B型臺式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；BPN-80CH型二氧化碳培養(yǎng)箱，天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Enspire型全波長多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默企業(yè)有限公司產(chǎn)品；UV5100型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，上海暄泓科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黑豆肽的制備

調(diào)節(jié)黑豆蛋白分散液（10%，W/W）pH值至8.5±0.1，然后按照蛋白基添加堿性蛋白酶（4%，W/W），在60℃條件下反應(yīng)70 min，反應(yīng)過程中通過添加1 mol/L NaOH維持pH值恒定。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)物于90℃下滅酶10 min，然后快速冷卻至室溫，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)噴霧干燥制得黑豆肽產(chǎn)品。

2.2 氨基酸組成分析

稱取60 mg黑豆肽粉置于容積為20 mL的安瓿管中，加入6.67 mol/L HCl溶液9 mL進(jìn)行酸水解，充氮封管后在110℃下水解24 h。用pH值2.2的檸檬酸緩沖液定容過膜，然后使用氨基酸自動分析儀進(jìn)行分析。

2.3 試驗(yàn)動物分組與設(shè)計(jì)

健康的雄性ICR小鼠100只，飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，室溫24±2℃，相對濕度45%±3%，光照12 h/d，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后稱質(zhì)量，隨機(jī)分為4組，正常對照組、黑豆肽劑量組（100，200，400 mg/kg·bw）。每日均在同一時間灌胃黑豆肽，且正常對照組小鼠每天給予等量的0.9%生理鹽水溶液，連續(xù)灌胃21 d。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 免疫臟器指數(shù)測定

小鼠末次給藥后，禁食12 h稱質(zhì)量，各組小鼠眼球采血后斷頸處死，取脾臟和胸腺組織稱量濕質(zhì)量后按照公式（1）計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

2.4.2 血清中細(xì)胞因子和免疫球蛋白水平測定

連續(xù)灌胃21 d后，眼球采血處死小鼠，血樣于4℃下靜置2 h后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中細(xì)胞因子（IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-6)和免疫球蛋白（IgA，IgM，IgG）的含量。

2.4.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖測定

在無菌環(huán)境下取小鼠脾臟，經(jīng)研磨后通過200目篩網(wǎng)過濾，置于無菌PBS液中制成單細(xì)胞懸液。離心后將細(xì)胞沉淀置于3 mL裂解緩沖液中并輕輕振動2～3 min除去紅細(xì)胞。用PBS液洗3次，每次以轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心5 min。調(diào)整細(xì)胞含量為3×106個/mL。將細(xì)胞懸液分為2孔加入24孔培養(yǎng)板中，一孔加75 μL ConA，另一孔作為對照，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，同時每孔加入50 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，結(jié)束后每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后分裝到96孔板中，每孔做3個平行孔，用酶標(biāo)儀于波長570 nm處測定[15]ConA刺激孔和細(xì)胞對照孔。結(jié)果按照公式（2）計(jì)算脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)。

2.4.4 小鼠NK細(xì)胞活力測定

取生長良好的Yac-1細(xì)胞，用含10%胎牛血清RPMⅠ-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞含量2×105個/mL，作為靶細(xì)胞應(yīng)用液，備用。取上述制備好的脾細(xì)胞懸液50 μL加入96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞含量調(diào)整為1×107個/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞，將脾細(xì)胞懸液設(shè)6個復(fù)孔，其中3孔再加入50 μL靶細(xì)胞液作為試驗(yàn)孔，剩余3孔加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為效應(yīng)細(xì)胞對照孔，另取6個復(fù)孔，分為3個靶細(xì)胞對照孔（50 μL靶細(xì)胞懸液+50 μL含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基）和3個空白對照孔（加入100 μL 10%胎牛血清RPMⅠ-1640培養(yǎng)基）。將培養(yǎng)板放至37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，每孔分別加入MTT（5 mg/mL）20 μL。再培養(yǎng)4 h，每孔加入酸性異丙醇100 μL，于5% CO2培養(yǎng)箱中放置過夜后，通過酶標(biāo)儀于波長570 nm處測各孔光密度[16]。結(jié)果按照公式（3）計(jì)算NK細(xì)胞活力。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用X±s表示，p＜0.05具有顯著差異，p＜0.01具有極顯著差異，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 黑豆肽的氨基酸組成分析

黑豆肽氨基酸含量見表1。

表1 黑豆肽氨基酸含量/g·（100 g）-1

由表1可知，黑豆肽的氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸占總含量的34.39%，支鏈氨基酸（BCAA）占總含量的14.59%。已有研究證明，支鏈氨基酸具有改善機(jī)體的營養(yǎng)及代謝的功能，可增強(qiáng)免疫功能[17]。表明黑豆肽具有增強(qiáng)免疫功能的作用。

3.2 黑豆肽對小鼠免疫臟器指數(shù)的影響

脾臟作為重要的淋巴器官之一，可廣泛地參與到體液和細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)當(dāng)中。胸腺作為機(jī)體主要的免疫器官，對T細(xì)胞的成熟與分化起到一定的作用。因此，藥物對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響可作為研究動物模型免疫機(jī)制的初步指標(biāo)。

黑豆肽對小鼠免疫臟器指數(shù)的影響見圖1。

圖1 黑豆肽對小鼠免疫臟器指數(shù)的影響

由圖1可知，與正常對照組相比，給予黑豆肽后，各劑量組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)雖有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。表明黑豆肽對正常小鼠的免疫臟器無明顯影響。

3.3 黑豆肽對正常小鼠血清中免疫因子的影響

3.3.1 黑豆肽對正常小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響

細(xì)胞因子（Cytokine，CK）是免疫細(xì)胞的組織細(xì)胞所合成與分泌的小分子多肽。它能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答和參與炎癥反應(yīng)。試驗(yàn)選用IFN-γ，IL-2，TNF-α和IL-6作為細(xì)胞因子的研究指標(biāo)。IFN-γ和IL-2主要是由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的[18-19]，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性并促進(jìn)吞噬功能[20-21]，而TNF-α和IL-6在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面具有重要的作用，并參與炎癥反應(yīng)[22]和免疫反應(yīng)[23]。

黑豆肽對正常小鼠血清中IL-2，IFN-γ，IL-6和TNF-α含量的影響圖2。

圖2 黑豆肽對正常小鼠血清中IL-2，IFN-γ，IL-6和TNF-α含量的影響

由圖2可知，與正常對照組小鼠比較，黑豆肽劑量組小鼠血清中IFN-γ和IL-2的含量隨著黑豆肽劑量濃度的增加而逐漸升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。而黑豆肽劑量組小鼠在灌胃劑量為200 mg/kg和400 mg/kg時，IL-6含量差異顯著（p＜0.05），在灌胃劑量為400 mg/kg時，TNF-α含量也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。經(jīng)黑豆肽干預(yù)后，刺激活化了T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖，分泌了抗體，并且與相應(yīng)的受體結(jié)合，導(dǎo)致血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量增加[24]，從而達(dá)到對機(jī)體免疫能力的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明，黑豆肽對正常小鼠血清TNF-α和IL-6分泌具有促進(jìn)作用，但是黑豆肽對IFN-γ和IL-2的分泌無顯著影響。

3.3.2 黑豆肽對正常小鼠血清中免疫球蛋白含量的影響

免疫球蛋白在體液免疫中發(fā)揮著重要的作用，免疫球蛋白含量的大小可以反映出機(jī)體免疫能力的高低[25-26]，并且具有強(qiáng)大的殺菌和免疫調(diào)理作用[27]。

黑豆肽對正常小鼠血清中IgM，IgA和IgG含量的影響見圖3。

圖3 黑豆肽對正常小鼠血清中IgM，IgA和IgG含量的影響

由圖3可知，與正常對照組小鼠相比，黑豆肽劑量組小鼠血清IgM，IgA和IgG含量分別增加了6.8%～8.6%，4.60%～16.62%和10.8%～20.5%。當(dāng)黑豆肽灌胃劑量為200 mg/kg時，IgG含量具有極顯著性差異（p＜0.01），IgA含量具有顯著性差異（p＜0.05）；在400 mg/kg時，IgA含量具有極顯著性差異（p＜0.01），IgG含量具有顯著性差異（p＜0.05）；在灌胃劑量為100，200，400 mg/kg時，IgM含量具有顯著性差異（p＜0.05），且隨著劑量濃度的增加而升高。經(jīng)黑豆肽的干預(yù)后，B細(xì)胞上的抗原受體與抗體相結(jié)合后，能夠特異性的識別抗原分子，誘導(dǎo)免疫球蛋白含量增加，從而調(diào)控機(jī)體的免疫功能[28]。試驗(yàn)結(jié)果同樣表明，黑豆肽可以提升免疫球蛋白的分泌能力，因此證明黑豆肽可以通過促進(jìn)免疫球蛋白的分泌，達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的效果。

3.4 黑豆肽對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活力的影響

脾淋巴細(xì)胞中含有的T淋巴細(xì)胞是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞，其增殖是反映細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)[29]，而T淋巴細(xì)胞對ConA反應(yīng)的大小可以反映出機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。NK細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力有關(guān)[30]。

黑豆肽對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和NK細(xì)胞活力的影響見圖4。

圖4 黑豆肽對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和NK細(xì)胞活力的影響

由圖4可知，與正常對照組相比，黑豆肽劑量組小鼠在200 mg/kg時脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），在灌胃劑量為200 mg/kg時，NK細(xì)胞活力具有極顯著差異（p＜0.01）；在400mg/kg時，NK細(xì)胞活力差異顯著（p＜0.05）。當(dāng)黑豆肽進(jìn)入機(jī)體后，由于受到抗原的刺激，使T淋巴細(xì)胞與ConA反應(yīng)增強(qiáng)[31]；NK細(xì)胞經(jīng)過抗原活化，其表面分子對NK的殺傷細(xì)胞變得更敏感，從而使NK細(xì)胞含量得以提升[32]。試驗(yàn)結(jié)果同樣表明，黑豆肽可以提升脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和NK細(xì)胞的活力，從而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的效果。

4 結(jié)論

黑豆肽可以通過提高正常小鼠血清中細(xì)胞因子（TNF-α，IL-6）、免疫球蛋白（IgM，IgA，IgG）的含量，以及脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)和NK細(xì)胞活力，從而一定程度上增強(qiáng)正常小鼠的免疫調(diào)控作用。