趙格，黎昌學(xué)，郭超，朱慧

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，新疆維吾爾自治區(qū) 石河子（832000）

口腔癌為全球第九大惡性腫瘤，約90%以上的口腔癌是口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），雖然近年來治療OSCC的手術(shù)和放化療技術(shù)有了一定進(jìn)步，但5年生存率仍僅為50%左右［1］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究顯示微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮了重要的作用［2］。miR-135b-5p在胰腺癌［3］、胃癌［4］、結(jié)直腸癌［5］等惡性腫瘤中異常高表達(dá)，但miR-135b-5p在OSCC中的表達(dá)情況尚不明確。本研究通過對(duì)公開發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)、基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，輔以新鮮組織樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討miR-135b-5p在OSCC患者中的表達(dá)水平及其與臨床特征的關(guān)系。同時(shí)采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-135b-5p的靶基因并進(jìn)行通路富集分析。

1 資料和方法

1.1 研究資料

腫瘤與癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）中下載與OSCC相關(guān)的miR-135b-5p表達(dá)數(shù)據(jù)（247例癌組織，17例癌旁組織）及其完整的臨床資料（222例）；與OSCC相關(guān)的mRNA表達(dá)信息（240例癌組織，17例癌旁組織）?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）下載OSCC相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE45238（40例癌與癌旁配對(duì)組織）。收集石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2017年1月至2020年6月手術(shù)切除的30例口腔鱗癌組織和癌旁組織（距癌組織邊緣≥2 cm）。所有OSCC患者手術(shù)前均未接受放療或化療。所有手術(shù)取材標(biāo)本離體后立即放置在液氮中，后儲(chǔ)存在-80℃冰箱中。本研究由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（文件編號(hào)：AF/SC-08/01.0），本研究收集的標(biāo)本已取得患者的書面知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 公共數(shù)據(jù)庫中miR-135b-5p表達(dá)分析 TCGA、GEO官網(wǎng)下載OSCC組織及癌旁組織中miR-135b-5p原始表達(dá)數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化處理后行差異分析。將miR-135b-5p表達(dá)信息與臨床信息合并，用于后續(xù)臨床相關(guān)性分析。使用R語言edgeR包篩選出TCGA下載的mRNA表達(dá)譜中的差異表達(dá)的mRNA。

1.2.2 新鮮組織中miR-135b-5p表達(dá)分析 依據(jù)Biospin miRNA Extraction Kit試劑盒說明完成組織中miRNA提取，測量OD260/280值在1.8～2.0之間。使用miRNA ALL-IN-One cDNA Synthesis Kit將總miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以U6為內(nèi)參（表1），使用EvaGreen miRNA qPCR Master Mix-Low ROX試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃10 min，1個(gè)循環(huán)；變性95℃10 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔以減少加樣等造成的誤差影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后分析溶解曲線，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在非特異性擴(kuò)增。分析擴(kuò)增曲線，采用2-△△Ct計(jì)算miR-135b-5p在OSCC組織中的相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-135b-5p的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequence of miR-135b-5p qRT-PCR amplification

1.2.3 miR-135b-5p靶基因預(yù)測及功能富集分析 從miRTarBase、targetScan和miRDB三個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-135b-5p的靶基因，選取至少2個(gè)數(shù)據(jù)庫中預(yù)測到的靶基因與TCGA數(shù)據(jù)庫下載分析的差異mRNA取交集。通過R語言對(duì)這些交叉基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2.4 miR-135b-5p關(guān)鍵靶基因篩選 通過STRING數(shù)據(jù)庫繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）用于揭示靶基因之間的關(guān)系，置信度參數(shù)為0.400。使用Cytoscape3.6.1及其插件cytoHubba篩選出前10個(gè)關(guān)鍵靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R語言3.6.3及其附屬包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。兩組間差異采用Wilcoxon檢驗(yàn)?？ǚ綑z驗(yàn)分析miR-135b-5p表達(dá)情況與OSCC患者臨床病理特征關(guān)系。通過受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析評(píng)價(jià)miR-135b-5p表達(dá)對(duì)于OSCC患者診斷的準(zhǔn)確性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 miR-135b-5p在OSCC組織及癌旁組織中的表達(dá)差異

TCGA、GEO官網(wǎng)下載OSCC組織原始表達(dá)數(shù)據(jù)，以及本研究中新鮮組織中miR-135b-5p的qRTPCR結(jié)果的分析顯示，OSCC組織中miR-135b-5p表達(dá)量高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1。

Figure 1 miR-135b-5p is frequently increased in oral squamous cell carcinoma cancer tissues圖1 miR-135b-5p在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)

2.2 miR-135b-5p表達(dá)水平與臨床病理關(guān)系

TCGA中下載與OSCC相關(guān)的miR-135b-5p表達(dá)數(shù)據(jù)及其完整的臨床資料（222例），χ2檢驗(yàn)表明miR-135b-5p表達(dá)水平與腫瘤組織病理分級(jí)相關(guān)（P＝0.011），但與年齡、性別、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況不相關(guān)（P＞0.05）（表2）。miR-135b-5p對(duì)OSCC具有較好的輔助診斷效能（AUC＝0.960，P＜0.001）（圖2）。

表2 miR-135b-5p表達(dá)與臨床病理相關(guān)性Table 2 miR-135b-5p expression associated with clinical pathological characteristics

2.3 miR-135b-5p靶基因預(yù)測及功能分析

3個(gè)軟件預(yù)測的靶基因數(shù)分別為804、83、537，取任意兩軟件預(yù)測結(jié)果的交集（共503個(gè)）（圖3）。為了進(jìn)一步提高生物信息學(xué)分析的可靠性，與TCGA下載分析出的差異mRNA取交集，最終篩選出與miR-135b-5p表達(dá)相反的靶基因共60個(gè)。對(duì)60個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG通路富集研究，富集集中在與腫瘤相關(guān)的鈣離子信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路和cAMP信號(hào)通路中（表3）（P＜0.05）。

表3 miR-135b-5p靶基因KEGG信號(hào)通路顯著性富集分析結(jié)果Table 3 Significantly enriched KEGGpathways of target genes of miR-135b-5p

2.4 miR-135b-5p關(guān)鍵靶基因篩選

上述得到的60個(gè)預(yù)測靶基因中，共有35個(gè)被過濾到靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)中，篩選得到10個(gè)關(guān)鍵靶基因（圖4），分別為大同源物2（discs-large homolog 2，DLG2）、錨蛋白重復(fù)序列3（ankyrin repeat 3，ANK3）、Erb-B2受體酪氨酸激酶4（Erb-B2receptor tyrosine kinase 4，ERBB4）、電壓門控性鈉通道二型beta亞單位（sodium channel voltage-gated type II beta，SCN2B）、蛋白激酶錨定蛋白（neurobeachin，NBEA）、γ-氨基丁酸β2亞基（γ-aminobutyric acid neurotransmitter receptor β2 subunit gene，GABRB2）、質(zhì)膜鈣ATP酶異構(gòu)體2（plasma membrane calcium ATPase 2，ATP2B2）、α-互養(yǎng)蛋白（α-syntrophin，SNTA1）、鈣電壓門控通道亞單位α1D（calcium voltage-gated channel subunit alpha1 D，CACNA1D）、血影蛋白β非紅細(xì)胞4（spectrin beta nonerythrocytic 4，SPTBN4）。

3討論

OSCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多步驟、多基因、多通路調(diào)控的復(fù)雜過程［6］。miRNA表達(dá)異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，深入研究miRNA與腫瘤的相關(guān)性將有望為腫瘤的診斷及靶向治療提供新的思路。miR-135b位于1號(hào)染色體上，有miR-135b-5p和miR-135b-3p兩種剪切成熟體［7］。miR-135b作為一種促癌因子，在多種腫瘤中均有著重要的作用，控制著癌細(xì)胞的生物學(xué)行為并影響耐藥，如：高表達(dá)的miR-135b-5p可通過靶向NR3C2促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［3］，可抑制胃癌細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)順鉑耐藥［4］；抑制miR-135b的表達(dá)能夠抑制結(jié)大腸癌細(xì)胞的增殖，提高患者對(duì)奧沙利鉑的敏感性［8］，降低鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［9］。

Figure 2 Receiver operating characteristic curve of miR-135b-5p in the diagnosis of oral squamous cell carcinoma圖2 miR-135b-5p診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的受試者工作曲線

Figure 3 Venn diagram of predicted target genes of miR-135b-5p圖3 miR-135b-5p的預(yù)測靶基因數(shù)目韋恩圖

目前miR-135b-5p在OSCC中的表達(dá)情況仍存在爭議。有研究表明，微陣列實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-135b在OSCC中呈低表達(dá)；而另有研究證明miR-135b-5p在OSCC中呈高表達(dá)［10］。為了進(jìn)一步明確miR-135b-5p在OSCC中的表達(dá)情況，本研究首先基于TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫大樣本優(yōu)勢分析了OSCC組織中miR-135b-5p的表達(dá)情況，后輔以新鮮組織進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明miR-135b-5p在OSCC組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且miR-135b-5p表達(dá)量對(duì)于OSCC具有良好的診斷效能。此外OSCC組織中miR-135b-5p表達(dá)與病理分級(jí)相關(guān)，低分化程度患者組織中miR-135b-5p表達(dá)量高于高中分化患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kademani等［11］發(fā)現(xiàn)每升高一個(gè)組織學(xué)等級(jí)，患者生存率降低44%，組織學(xué)等級(jí)是預(yù)測生存率的獨(dú)立因素。研究表明低分化的細(xì)胞由于缺乏凝聚力，具有單細(xì)胞侵襲模式，隨著細(xì)胞分化程度的降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)會(huì)增加［12］。因此筆者推測，作為診斷標(biāo)志物的miR-135b-5p的高表達(dá)可能預(yù)示著不良預(yù)后。

Figure 4 Hub genes of protein-protein interaction network圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶基因

miRNAs是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵分子。KEGG富集分析結(jié)果顯示，miR-135b-5p的預(yù)測靶基因集中富集在與腫瘤密切相關(guān)的3個(gè)通路中：鈣離子、cGMP-PKG、cAMP信號(hào)通路。這些通路都是與腫瘤增殖、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)的信號(hào)通路［13-15］。這與前述的關(guān)于miR-135b-5p影響多種腫瘤細(xì)胞不良生物學(xué)行為和耐藥的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論相一致［3-4］。構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出10個(gè)重要的中樞蛋白：DLG2、ANK3、ERBB4、SCN2B、NBEA、GABRB2、ATP2B2、SNTA1、CACNA1D、SPTBN4。其 中CACNA1D和ATP2B2均參與了上述3個(gè)癌癥相關(guān)通路。乳腺癌中miR-135b低表達(dá)，ATP2B2高表達(dá)，ATP2B2減少了腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)而抑制了細(xì)胞凋亡［16］。這與筆者預(yù)測的ATP2B2參與調(diào)控鈣離子通路的結(jié)果一致。CACNA1D在腎癌和肺癌中均低表達(dá)［17］，前列腺癌中低表達(dá)的CANCA1D提示腫瘤的惡性程度更高，侵襲性更強(qiáng)［18］，有望成為癌癥治療的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析，得到的miR-135b-5p的關(guān)鍵靶基因及癌癥相關(guān)的靶向調(diào)控的信號(hào)通路，為后續(xù)機(jī)制研究提供方向。