龔競，尚杉，鄭茜，于新波，朱勇

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南大學(xué) 蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

滯育是生物體發(fā)育到某一特定階段停滯生長發(fā)育來抵抗外界不利環(huán)境的一種生理現(xiàn)象，普遍發(fā)生在線蟲、昆蟲、魚類甚至哺乳動物上[1-5]．當(dāng)生物體受到光照、溫度等外界信號誘導(dǎo)時(shí)，機(jī)體會發(fā)生一系列變化：呼吸減弱、代謝降低、抗逆性增強(qiáng)、發(fā)育逐漸停滯進(jìn)入滯育．不同于休眠，滯育通常發(fā)生在不利條件來臨前，在滯育過程中即使適宜的條件到來也不會立即打破滯育，需要經(jīng)歷一定時(shí)間或受到某一因子刺激后，生物體才能解除滯育．家蠶是典型的卵滯育昆蟲，在胚胎早期進(jìn)入滯育[6]，根據(jù)滯育程度的差異可以劃分為一化性品種，自然條件下1年只孵化1次； 二化性品種，自然條件下1年只孵化2次； 多化性品種，自然條件下1年孵化多次．其中，二化性家蠶可以通過對其母代家蠶催青時(shí)期條件進(jìn)行設(shè)置來控制子代家蠶的滯育性[7]，即高溫長光照催青獲得子代滯育卵，低溫黑暗獲得子代非滯育卵。

熱激蛋白(heat shock proteins，Hsps)是一種高度保守的蛋白，可防止底物蛋白的不可逆變性，從而增強(qiáng)生物體的抗逆性，廣泛存在于各種原核和真核生物中．根據(jù)Hsps的分子量和同源關(guān)系可以分為4種[8]，分別為Hsp90，Hsp70，Hsp60和sHsps(small Hsps，sHsps)．其中，sHsps的相對分子質(zhì)量在1.2×104～4.2×104之間，通常在3.0×104以下，有一個(gè)α-晶體區(qū)域包含約100個(gè)氨基酸殘基的保守序列[8-9]．Hsps最初是在果蠅的研究中被發(fā)現(xiàn)[10]，是對高溫有應(yīng)激反應(yīng)的一種蛋白，并因此得名．隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Hsps可以在寒冷、干燥、缺氧和化學(xué)藥品等應(yīng)激條件下上調(diào)表達(dá)[11]。

熱激蛋白廣泛參與到生物生長發(fā)育的調(diào)控過程中．在昆蟲滯育過程中，麥紅吸漿蟲Sitodiplosismosellana的Hsp70和Hsp90在幼蟲滯育和一定范圍的冷熱脅迫下表達(dá)上調(diào)，而Hsp70在滯育之前和滯育期間豐度相當(dāng)[11]； 蛀莖夜蛾Sesamianonagrioides滯育幼蟲中Hsp90 的表達(dá)量增加，而Hsp70在滯育過程中減少[13]； 非洲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera滯育期間腦中Hsp20.7和Hsp90的表達(dá)量下降，而Hsp21.4和Hsp70表達(dá)量升高[14]．熱激蛋白在滯育過程中含量的變化，暗示其可能在當(dāng)中發(fā)揮了重要作用，在滯育過程和應(yīng)急反應(yīng)時(shí)可能具有相似功能。

目前，有多個(gè)家蠶Hsps被研究鑒定：Fan等[15]采用鳥槍蛋白組學(xué)法對蠶卵進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)Hsp蛋白； Li等[16]通過全基因組分析鑒定了16個(gè)家蠶sHsp基因，并發(fā)現(xiàn)昆蟲sHSPs顯示出與脊椎動物完全不同的進(jìn)化模式．在我們前期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中[17]，通過對產(chǎn)后32 h的滯育卵和發(fā)育蠶卵進(jìn)行RNASeq測序分析，發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)的家蠶Hsp基因．本文中我們選取BmHsp19.5基因(BGIBMGA013545)進(jìn)行進(jìn)一步分析，完成了克隆鑒定和生物信息學(xué)分析，并對該基因在滯育卵和非滯育卵中產(chǎn)后時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了調(diào)查分析．這些結(jié)果將為揭示家蠶滯育過程中Hsps基因的表達(dá)特征及功能提供重要的研究信息，也為研究其他昆蟲的Hsps提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的家蠶二化性品種‘大造’由西南大學(xué)家蠶基因資源庫提供，母代家蠶通過高溫25 ℃、長光照條件下催青產(chǎn)下滯育卵，低溫15 ℃、短日照條件下催青產(chǎn)下非滯育卵為實(shí)驗(yàn)材料．按照常規(guī)方法飼養(yǎng)家蠶，取子代蠶卵作為實(shí)驗(yàn)材料．將蠶卵置于1.5 mL離心管中，用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得的家蠶BmHsp19.5基因序列，通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫Silkdb 3.0(http：//silkworm.swu.edu.cn/silkdb/) Blast檢索，采用Primer 5.0軟件在預(yù)測序列上設(shè)計(jì)克隆引物．基因鑒定后，為調(diào)查BmHsp19.5基因在產(chǎn)后時(shí)期的表達(dá)情況設(shè)計(jì)了qPCR引物序列(表1)。

表1 引物序列

1.3 基因克隆

PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性1.5 min； 94 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，28個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min．?dāng)U增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有氨芐抗性的平板篩選后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.4 BmHsp19.5生物信息學(xué)分析

利用ProtParm在線程序(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)分析家蠶BmHsp19.5蛋白理化參數(shù)； 應(yīng)用Mega 7.0軟件、BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和(http：//silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)程序?qū)mHsp19.5蛋白序列做同源性比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹．采用SignalP在線程序(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析BmHsp19.5蛋白信號肽的功能； 使用 TMHMM在線程序(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Expasy Protscale在線程序(http：// web.expasy.org / protscale /l)進(jìn)行BmHsp19.5蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測和疏水性分析； 使用SMART軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)對蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.5 家蠶BmHsp19.5在蠶卵產(chǎn)后不同時(shí)期的檢測

qPCR采用ABI Step One儀器進(jìn)行兩步法反應(yīng)．反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸40 s，30個(gè)循環(huán)．每個(gè)時(shí)期設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，根據(jù)熒光定量所得到的Ct值，采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPadPrism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)采用多重T-test方法來比較不同樣品的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶BmHsp19.5克隆

目的基因以家蠶產(chǎn)下32 h的蠶卵cDNA為模板，用克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)(圖1a)，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小在504 bp，與預(yù)測編碼區(qū)序列大小一致．隨后進(jìn)行凝膠回收并驗(yàn)證(圖1b)，并將回收片段連接到載體上(圖1c)．測序結(jié)果在Silkdb 3.0網(wǎng)站比對分析后，表明BmHsp19.5基因沒有內(nèi)含子，全長為732 bp，其中ORF為504 bp，編碼的氨基酸序列為167個(gè)氨基酸(圖1d)，與預(yù)測序列結(jié)果一致。

a.M：2.0×103 Marker，1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，b. M：2.0×103 Marker； 1：凝膠回收產(chǎn)物，c. M：2.0×103 Marker，1-3：pMD19- BmHsp19.5 重組克隆，d. CDS(Coding DNA Sequence)區(qū)及相應(yīng)的氨基酸序列．圖1 家蠶BmHsp19.5電泳圖和測序序列

2.2 家蠶BmHsp19.5序列分析

利用Protparam軟件對家蠶BmHsp19.5基因所編碼的目的蛋白進(jìn)行預(yù)測分析，其理論相對分子質(zhì)量為1.95×104，等電點(diǎn)為5.21．不穩(wěn)定指數(shù)(II)為38.29，說明蛋白質(zhì)穩(wěn)定．利用SignalP 4.1Server軟件分析預(yù)測 BmHsp19.5 蛋白的信號肽，結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)有信號肽結(jié)構(gòu)，可能該目的蛋白為非分泌蛋白．利用 TMHMM在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測家蠶BmHsp19.5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，可知該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白。

利用SMART軟件對BmHsp19.5蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該目的蛋白65-157位氨基酸為Hsp20功能結(jié)構(gòu)域(圖2a)，故該蛋白屬于小分子熱激蛋白家族．利用ProtScale軟件對家蠶BmHsp19.5蛋白進(jìn)行蛋白親疏水性預(yù)測(圖2b)，圖2b中橫坐標(biāo)表示氨基酸序列位置； 縱坐標(biāo)表示氨基酸的標(biāo)度值； 通過標(biāo)度值判定氨基酸的親疏水性，標(biāo)度值大于0表示疏水性，標(biāo)度值小于0表示親水性．從圖2b中可知最低值為-2.522，最高值為0.989，且大部分峰值位于0值以下，該目的蛋白為親水性蛋白。

圖2 BmHsp19.5蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析(a)和蛋白的疏水性預(yù)測(b)

2.3 家蠶BmHsp19.5同源基因分析判定

使用家蠶BmHsp19.5蛋白序列在NCBI(National center for biotechnology information)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastP搜索，檢索發(fā)現(xiàn)多個(gè)鱗翅目的同源物，最終選擇6個(gè)具有代表性的序列進(jìn)行同源序列比對分析．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmHsp19.5與柞蠶ApHsp19.5(GenBank登錄號：APX61064.1)、小木蠹蛾EhHsp20.1(GenBank登錄號：AYA93247.1)和東方果蛾GmHsp19.6(GenBank登錄號：AKS40076.1)的氨基酸序列相似性較高，分別為94%，93%和92%，同源性分別為83%，85%和79%．BmHsp19.5與桑螟GpHsp19.5(GenBank登錄號：QGZ00457.1)、云杉芽蟲CfHsp19.8(GenBank登錄號：AAZ14792.1)和蘋果蠹蛾CpHsp19.8(GenBank登錄號：ADX96000.1)的氨基酸序列相似性分別為62%，50%和50%，同源性分別為48%，39%和38%．所有氨基酸序列都含有一個(gè)典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域(圖3)。

雙下劃線表示α-晶體區(qū)域，方框表示二聚體界面位點(diǎn)，深色區(qū)域表示高度保守的氨基酸．圖3 BmHsp19.5與其他6種同源鱗翅目昆蟲的氨基酸序列比對

利用Mega 7.0軟件對家蠶、柞蠶、小菜夜蛾等11種不同物種的小分子熱激蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示物種序列形成兩個(gè)大的分支，其中云杉蚜蟲單獨(dú)為一支，其他10個(gè)物種序列為一支．家蠶與黑脈金斑蝶、沙棘蛾這兩類首先聚在一起(圖4)，然后再與親緣關(guān)系最近的柞蠶聚在一起，之后與梨小食心蟲、夏威夷紅蛺蝶、小菜蛾等聚為一支。

圖4 BmHsp19.5與其他物質(zhì)小分子熱激蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 家蠶BmHsp19.5在蠶卵產(chǎn)后的表達(dá)分析

利用qPCR技術(shù)檢測BmHsp19.5基因在滯育卵與非滯育卵不同時(shí)期的表達(dá)量(圖5)．在滯育卵中，1～3 d呈上升趨勢，在3 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，此時(shí)胚胎形態(tài)經(jīng)歷了由產(chǎn)后第1 d梨形的頭葉分化，到第2 d胚胎明顯拉長、尾節(jié)分化，在產(chǎn)后第3 d不再有明顯變化，整個(gè)滯育期保持不變進(jìn)入滯育Ⅰ期[18]．通常認(rèn)為蠶卵在產(chǎn)后2～3 d開始進(jìn)入滯育期，由此推斷BmHsp19.5基因可能在蠶卵進(jìn)入滯育的準(zhǔn)備階段發(fā)揮了重要作用。

從圖5中我們還可以看到，BmHsp19.5基因在滯育卵的表達(dá)量顯著高于非滯育卵的表達(dá)量．在非滯育卵中產(chǎn)后1 d表達(dá)量最高，到第5 d呈持續(xù)下將的趨勢，在第6 d蠶卵點(diǎn)青的時(shí)候表達(dá)量又小幅升高，孵化前第8 d略微下降； 點(diǎn)青期蟻蠶頭部黑色素開始附著，這時(shí)蠶體充滿了卵殼，為孵化做著最后的準(zhǔn)備．這期間蠶卵需氧量大幅度增加[19]，同時(shí)活性氧(ROS)含量也增加[20]，BmHsp19.5基因的小幅升高似乎與這些變化有關(guān)。

圖5 家蠶BmHsp19.5在滯育卵(a)與非滯育卵中(b)的表達(dá)量分析

3 結(jié)論與討論

根據(jù)克隆測序，我們鑒定了一個(gè)新的家蠶BmHsp19.5基因，相對分子質(zhì)量為1.95×104，預(yù)測顯示該蛋白在 65-157位氨基酸為Hsp20功能結(jié)構(gòu)域，符合小熱激蛋白家族結(jié)構(gòu)特征．同源性分析顯示該序列與其他鱗翅目昆蟲的小熱激蛋白具有較高的保守性，都含有一個(gè)典型的α-晶體區(qū)域．BmHsp19.5基因和大多數(shù)sHsp基因一樣也只有一個(gè)內(nèi)含子，前人的研究認(rèn)為由于無內(nèi)含子就可以避免 mRNA剪接過程和當(dāng)中可能出現(xiàn)的障礙，從時(shí)間上優(yōu)先于其他基因，因此有利于應(yīng)激或抗逆反應(yīng)基因的及時(shí)表達(dá)[21]．家蠶的sHsp基因sHsp19.9，sHsp20.1，sHsp20.4，sHsp20.8，sHsp21.4和sHsp23.7，僅有含有內(nèi)含子的sHsp21.4在熱激反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄物沒有增加[22]．據(jù)此我們推測本實(shí)驗(yàn)中BmHsp19.5基因可能在應(yīng)急反應(yīng)和滯育發(fā)育較早時(shí)期發(fā)揮作用。

熱激蛋白的上調(diào)似乎是昆蟲在不同滯育階段的一個(gè)共同特點(diǎn)．紅尾肉蠅Sarcophagacrassipalpis在蛹滯育期間，大部分Hsp基因會在滯育開始階段上調(diào)表達(dá)，并將持續(xù)整個(gè)越冬期，如Hsp70A，Hsp70B，Hsp60，Hsp25，Hsp23，Hsp18，SmHsp； 利用RNAi抑制熱激蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對蛹的低溫存活能力有重要影響[23]．云杉芽蟲中有14種sHsps基因在幼蟲進(jìn)入滯育前、滯育中、滯育后這3個(gè)階段上調(diào)表達(dá)，如Hsp19.6和Hsp22.1基因在滯育中顯著上調(diào)表達(dá)；Hsp19.2，Hsp19.7，Hsp21.5a和Hsp24.3基因在滯育前和滯育中上調(diào)表達(dá)；Hsp20.0 和Hsp21.3基因則在整個(gè)期間持續(xù)表達(dá)[24]．sHsps常作為細(xì)胞防御的第一道防線，在細(xì)胞受到脅迫時(shí)，作為分子伴侶防止底物蛋白的不可逆變性，反映生物體對環(huán)境中存在的某些極端應(yīng)力的響應(yīng)[25-26]．蔥蠅Deliaantiqua的Hsp23基因在蛹滯育開始時(shí)表達(dá)量逐漸升高，到滯育維持的中后期達(dá)到峰值，在滯育終止時(shí)降到較低水平[27]．在鹵蟲中由于缺失小熱激蛋白p26的胚胎更容易終止滯育，因此認(rèn)為該蛋白是維持滯育所必需的[28]。

家蠶滯育卵室溫條件下產(chǎn)后48～72 h開始進(jìn)入滯育，卵色由淡黃色逐漸變成赤豆色，胚胎形態(tài)不再變化，這個(gè)時(shí)期被稱之為前滯育期[29]．本研究的BmHsp19.5基因在這一時(shí)期上調(diào)表達(dá)，該結(jié)果與之前轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致； 根據(jù)基因表達(dá)模式推測該基因可能參與了滯育這一生理過程，可能在蠶卵進(jìn)入滯育的準(zhǔn)備階段發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也符合越冬昆蟲滯育期間熱激蛋白上調(diào)以抗寒這個(gè)主要特征．家蠶Hsp20.8A，Hsp70，DnaJ和Hsc71基因也是在滯育蠶卵中上調(diào)表達(dá)[30]．也有報(bào)道指出家蠶中Hsp20.4，Hsp20.8，Hsp40，Hsp70和Hsp90的 mRNA在滯育期間沒有變化[31]，在家蠶滯育卵和非滯育卵中的含量大致相同[15]．這可能是由于研究者取材時(shí)間的差異所致，同時(shí)說明滯育引起的熱激蛋白表現(xiàn)和普通應(yīng)急反應(yīng)不同，并不是所有熱激蛋白都同時(shí)參與其中，可能通過滯育相關(guān)機(jī)制調(diào)控Hsp基因及其產(chǎn)物，在不同時(shí)間增加、減少或保持不變，從而促進(jìn)昆蟲在逆境中生存[13，32]．因此，接下來工作的重點(diǎn)是獲得BmHsp19.5較純蛋白，進(jìn)一步明確蛋白的功能，并探究其作用機(jī)理。