王瑤，吳殷囡，汪玉馨，孟長(zhǎng)虹

(1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院藥理毒理研究中心，南京 210029；2.徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，徐州 221004)

多組分生化藥多采用生物提取工藝制備，制備過(guò)程中，組胺或類(lèi)組胺等物質(zhì)可能混入，導(dǎo)致血壓下降、變態(tài)反應(yīng)等不良反應(yīng)，影響臨床用藥安全性[1-2]。骨肽是一種具有刺激成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)新骨形成的多組分生化藥，用于治療骨質(zhì)疏松癥、骨折及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。近年來(lái)，骨肽類(lèi)制劑的不良反應(yīng)報(bào)道逐漸增加，其中變態(tài)反應(yīng)、血壓下降等不良反應(yīng)報(bào)道較為頻繁[3-5]，目前已被列入國(guó)家重點(diǎn)監(jiān)控合理用藥藥品目錄[6]?，F(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中，僅有骨瓜提取物注射液、注射用骨瓜提取物等部分制劑設(shè)定了降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)[7]。為了完善骨肽類(lèi)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，筆者依據(jù)《注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》和《降壓物質(zhì)檢查法》[7]，對(duì)骨肽類(lèi)制劑及其原液進(jìn)行降壓物質(zhì)研究，為確定骨肽類(lèi)制劑的降壓物質(zhì)檢查限值提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 離體器官儀ALC-MPA2000(上海奧爾科特生物科技有限公司)。

1.2動(dòng)物 貓，雄性，體質(zhì)量約3.0 kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0062。使用環(huán)境：溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每小時(shí)換氣8次，光照≥200 lx。

1.3試藥 磷酸組胺(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150510-201313)；戊巴比妥鈉(上海Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：20140221)；肝素鈉注射液(南京新百藥業(yè)公司，批號(hào)：1180204)。供試品中骨肽類(lèi)注射液11批，注射用11批，骨肽原液5批，具體信息見(jiàn)表1。

表1 骨肽類(lèi)制劑樣品信息Tab.1 Information of osteopeptide preparation sampleS

2 方法與結(jié)果

2.1動(dòng)物麻醉及手術(shù) 參照《降壓物質(zhì)檢查法》，對(duì)實(shí)驗(yàn)貓腹腔注射5%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后固定于保溫手術(shù)臺(tái)上，分離氣管及頸動(dòng)脈，在一側(cè)頸動(dòng)脈插入連接離體器官儀的動(dòng)脈插管，使插管內(nèi)充滿(mǎn)肝素鈉0.9%氯化鈉溶液(1000 U·mL-1)，以記錄血壓；同時(shí)在一側(cè)分離股靜脈，插入靜脈插管，供注射藥液用。實(shí)驗(yàn)中注意保持動(dòng)物體溫。全部手術(shù)完畢后，將儀器調(diào)節(jié)到和動(dòng)物血壓相當(dāng)?shù)母叨萚一般為99.8～150.0 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)]，開(kāi)啟動(dòng)脈夾，待血壓穩(wěn)定后，進(jìn)行藥液注射。各次注射速度基本相同，每次注射后立即注入一定量的氯化鈉注射液，每次注射應(yīng)在前一次反應(yīng)恢復(fù)穩(wěn)定后進(jìn)行，且相鄰兩次注射的間隔時(shí)間盡量保持一致。

2.2靈敏度實(shí)驗(yàn) 經(jīng)靜脈插管依次注入組胺對(duì)照品稀釋液，劑量按照動(dòng)物體質(zhì)量調(diào)整，給予組胺0.05，0.10，0.15 μg·kg-1，給藥前后分別給與組胺進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 靈敏度驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Sensitivity verification results

由表2可知，在0.10 μg·kg-1劑量下血壓下降值均≥20.0 mmHg，且各劑量所致反應(yīng)有所差別，因此降壓實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物均符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定[7]，靈敏度驗(yàn)證成立。

2.3降壓物質(zhì)檢查預(yù)實(shí)驗(yàn) 取制劑各品種各1批，采用3個(gè)劑量(劑間比為1：3)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。由于骨肽制劑在靜脈注射時(shí)有一定降壓作用，將起始劑量定為臨床劑量的1/5。具體給藥劑量及結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 骨肽類(lèi)制劑預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Pre-test result of osteopeptide preparations

參照《注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》[7]，分析骨肽類(lèi)制劑降壓物質(zhì)檢查的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為實(shí)施正式實(shí)驗(yàn)擬定骨肽類(lèi)制劑各品種的降壓物質(zhì)檢查限值。

注射液制劑中，骨肽注射液在大、中、小劑量下均無(wú)降壓反應(yīng)，在正式實(shí)驗(yàn)中擬采用劑量2.5 mg·kg-1。復(fù)方骨肽注射液樣品在劑量4.5 mg·kg-1時(shí)，有明顯降壓作用，正式實(shí)驗(yàn)中擬采用劑量1.5 mg·kg-1即臨床劑量的3/5。骨肽氯化鈉注射液預(yù)實(shí)驗(yàn)中均未產(chǎn)生降壓反應(yīng)，則在正式實(shí)驗(yàn)中擬采用1 mg·kg-1。骨瓜提取物注射液在劑量3 mg·kg-1下有明顯的降壓作用，并不符合規(guī)定，故正式實(shí)驗(yàn)擬采用劑量1 mg·kg-1即臨床劑量的3/5。

注射用制劑中，注射用骨肽在大、中、小劑量下均無(wú)降壓反應(yīng)，在正式實(shí)驗(yàn)中采用劑量2.5 mg·kg-1。注射用復(fù)方骨肽在大、中、小劑量下均符合規(guī)定，大劑量時(shí)有明顯降壓作用，正式實(shí)驗(yàn)擬采用與復(fù)方骨肽注射液的同等劑量1.5 mg·kg-1。注射用骨瓜提取物在中、大劑量時(shí)降壓幅度相近，在正式實(shí)驗(yàn)中擬和骨瓜提取物注射液采用同等劑量1 mg·kg-1。注射用鹿瓜多肽大劑量有降壓作用，在正式實(shí)驗(yàn)中擬采用劑量0.72 mg·kg-1。具體見(jiàn)表4。

表4 降壓物質(zhì)檢查正式實(shí)驗(yàn)給藥劑量Tab.4 Dosage in formal depressor substance test

2.4降壓物質(zhì)檢查正式實(shí)驗(yàn) 按各制劑初步擬定的限值，對(duì)22批骨肽類(lèi)制劑進(jìn)行降壓物質(zhì)檢查，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 降壓物質(zhì)檢查正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Result of depressor substance test in formal experiment

2.5原液降壓物質(zhì)研究 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B企業(yè)的復(fù)方骨肽注射液與D企業(yè)的骨瓜提取物注射液均在其大劑量下產(chǎn)生一定程度的降壓作用。考慮到骨肽類(lèi)制劑的制備工藝，一種制劑的處方中采用一種或多種原液進(jìn)行制備，為探究制劑產(chǎn)生的降壓作用與其原液的相關(guān)性，因此選擇了上述兩家企業(yè)的骨肽類(lèi)原液進(jìn)行降壓物質(zhì)檢查，以判斷制劑的降壓物質(zhì)主要源于哪一種原液。

根據(jù)B企業(yè)和D企業(yè)提供的處方比例分別進(jìn)行計(jì)算，選擇制劑同等劑量(大劑量)下對(duì)應(yīng)的原液組分含量進(jìn)行降壓物質(zhì)檢查，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 骨肽類(lèi)原液降壓物質(zhì)檢查結(jié)果Tab.6 Result of depressor substance test in original solution of osteopeptide preparations

B企業(yè)的復(fù)方骨肽注射液，在預(yù)實(shí)驗(yàn)大劑量下有降壓作用(ds/2

D企業(yè)的骨瓜提取液、豬四肢骨提取液、甜瓜子提取液在同等劑量下均有降壓作用，與制劑一致，幾種原液所致的降壓作用可能影響制劑質(zhì)量。

2.6骨肽類(lèi)制劑降壓物質(zhì)檢查限值擬定 課題組擬定的降壓物質(zhì)限度表見(jiàn)表7。由于骨肽類(lèi)制劑在藥效中無(wú)降壓作用[8]，因此本實(shí)驗(yàn)在臨床劑量的1/5～5倍范圍內(nèi)擬取貓最大無(wú)降壓反應(yīng)劑量為限值[7]，通過(guò)比較不同劑量的供試品與組胺對(duì)照品(0.10 μg·kg-1)所引起麻醉貓血壓下降的程度，判定骨肽類(lèi)制劑在擬定的限值下是否符合規(guī)定，結(jié)果表明在擬定限值下，22批骨肽類(lèi)制劑均符合規(guī)定。

表7 骨肽類(lèi)制劑降壓物質(zhì)限值Tab.7 Depressor substance limits of osteopeptide preparations

3 討論

多組分生化藥因來(lái)源復(fù)雜、組分不明確等問(wèn)題備受關(guān)注[9]。骨肽類(lèi)制劑是以動(dòng)物骨為原料，經(jīng)提取制成的傳統(tǒng)生化藥。研究表明[10]，生化制藥用原材料具有被污染的可能性。組胺、類(lèi)組胺等小分子物質(zhì)可能混入提取或制備工藝中，引起不良反應(yīng)影響臨床療效。因此，對(duì)骨肽類(lèi)制劑及原液的降壓物質(zhì)研究以提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有必要性。

由降壓物質(zhì)檢查結(jié)果可見(jiàn)，骨肽類(lèi)制劑在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方骨肽注射液、注射用復(fù)方骨肽、注射用鹿瓜多肽在大劑量下均有降壓作用；骨瓜提取物注射液則在中劑量時(shí)就出現(xiàn)了降壓作用；中劑量與大劑量的注射用骨瓜提取物均有降壓作用，根據(jù)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及降壓物質(zhì)檢查的限值規(guī)定[8]，課題組為正式實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)了限值。根據(jù)擬定限值，正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明22批骨肽類(lèi)制劑均符合規(guī)定，方法可行。也發(fā)現(xiàn)個(gè)別批次的樣品使用不同貓時(shí)降壓反應(yīng)不同，考慮可能是由于貓的質(zhì)量控制存在問(wèn)題所致，不同性別、年齡、生理?xiàng)l件、不同環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響因素較大，造成不同的貓對(duì)降壓的敏感性不同。

在研究同企業(yè)原液與制劑所引起降壓作用的相關(guān)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)B企業(yè)的產(chǎn)品批間差異較大，在與制劑引起降壓作用的同等劑量下，骨肽類(lèi)原液并未引起降壓作用，用原液實(shí)驗(yàn)時(shí)則存在不同程度的降壓作用；而D企業(yè)的骨肽類(lèi)原液在其制劑引起降壓作用的同等劑量下即產(chǎn)生降壓作用，認(rèn)為骨肽類(lèi)制劑的降壓作用可能與其原液自身所引起的降壓作用相關(guān)，因此骨肽類(lèi)原液的降壓物質(zhì)檢查也應(yīng)受到重視。

現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，大部分臨床常用的骨肽類(lèi)制劑如骨肽注射液等并未設(shè)置降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)?？紤]到骨肽類(lèi)制劑的不良反應(yīng)報(bào)道中降壓反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)等皆與組胺、類(lèi)組胺等物質(zhì)相關(guān)，提高骨肽類(lèi)制劑與原液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)，控制組胺及類(lèi)組胺等物質(zhì)在制劑與原液中的含量，對(duì)保障患者用藥安全具有重大意義。