黃鶴歸，徐慧，黃賀達(dá)，楊全偉，黃小龍，覃雙來，胡作為

(武漢市第一醫(yī)院1.藥學(xué)部；2.腫瘤科；3.呼吸內(nèi)科，武漢 430022)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有惡性腫瘤之首。目前肺癌患者確診時(shí)大多已是局部晚期或出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移，其5年生存率<20%，總體預(yù)后較差[1]。一直以來，化學(xué)治療(化療)是肺癌患者重要的治療手段，雖然隨著分子靶向治療、免疫治療、放射治療(放療)等研究的不斷深入，具備更多的臨床選擇，但化療作為最基礎(chǔ)的治療仍占據(jù)著不可忽視的位置?；熢跍p少腫瘤負(fù)荷、延長生存期等方面具有重要意義，但尚不能令人滿意。同時(shí)其細(xì)胞毒副作用和對(duì)生活質(zhì)量的影響也成為了限制其應(yīng)用的障礙[2]。中醫(yī)藥在治療腫瘤及其相關(guān)疾病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，筆者前期研究已證實(shí)“癌痛方”可抑制肺癌患者腫瘤生長；動(dòng)物研究也證實(shí)其對(duì)醋酸所致小鼠疼痛具有顯著鎮(zhèn)痛作用，并能降低白細(xì)胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)含量[3-5]。但癌痛方抑制癌性疼痛(癌痛)的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步深入研究。本研究對(duì)癌痛方進(jìn)行正丁醇部位提取，將其作用于Lewis肺癌小鼠模型，觀察癌痛方正丁醇提取物(n-butanol extracts，BTE)對(duì)癌痛的影響，并進(jìn)一步闡釋其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性無特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6小鼠25只，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，由湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018，使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2017-0067，并在湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，保證室溫22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，明暗交替12 h，自由飲水、采食。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2試藥 Lewis肺癌細(xì)胞株(湖南豐暉生物科技有限公司，貨號(hào)：CL0194)。癌痛方所含藥物組成：重樓( Paridis Rhizoma)10 g(產(chǎn)地：云南)、川烏(Aconitum carmichaeli Debx)3 g(產(chǎn)地：四川)、蟾酥(Venenum Bufonis)0.02 g(產(chǎn)地：湖北)(湖北天濟(jì)藥業(yè)有限公司)，所有藥材經(jīng)武漢市第一醫(yī)院余南才教授鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2020 版一部的要求。試劑：β-Actin(批號(hào)：ab37168)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)(批號(hào)：ab189786)、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated c-AMP response element binding protein，p-CREB)(批號(hào)：ab32096)購于美國Abcam公司。5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BRDU)(批號(hào)：66241-1)購于三鷹公司，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)試劑盒(批號(hào)：11684817910)購于Roche公司。

1.3儀器 奧林巴斯IX51倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、成像系統(tǒng)(QImaging公司)、RM2016切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)、DR-200Bs酶標(biāo)檢測(cè)儀(Diatek公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1癌痛方正丁醇有效部位提取 將重樓、川烏及蟾酥碎后過孔徑2.00 mm(10目)藥篩，并按10：3：0.02比例稱取藥材總質(zhì)量為130.20 g，并用20倍體積質(zhì)量比70%乙醇溶液在室溫下滲漉桶中浸泡36 h，按1.0 mL·min-1·kg-1速度滲漉提取，將滲漉液減壓濃縮至密度為1.03 g·mL-1，用分液漏斗依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取，并將正丁醇萃取液進(jìn)行濃縮、干燥后稱質(zhì)量為5.20 g。

1.4.2肺癌小鼠皮下移植瘤模型及給藥 采用已建立Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型[6]，接種14 d后(瘤體積約為150 mm3)，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表分組，共2組，每組10只，即BTE組、模型對(duì)照組。BTE組將BTE用0.9%氯化鈉溶液稀釋后給予0.2 mL灌胃(生藥量計(jì)算為1.97 g·kg-1·d-1)；模型對(duì)照組：0.9%氯化鈉溶液0.2 mL灌胃。各組每日給藥1次，共計(jì)14 d。

1.4.3腫瘤體積抑制率 在末次給藥后24 h，對(duì)移植瘤小鼠處死，于超凈工作臺(tái)剝離出腫瘤組織并稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率(IR)。腫瘤體積抑制率(tumor volume inhibition percentage，TVI%)=(模型對(duì)照組腫瘤平均體積-BTE組腫瘤平均體積)/模型對(duì)照組腫瘤平均體積×100%。

1.4.4腫瘤組織形態(tài)學(xué)改變 取部分腫瘤組織在4%低聚甲醛溶液中固定，然后進(jìn)行石蠟包埋。準(zhǔn)備組織切片(厚度5 μm)，并使用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行常規(guī)染色。在奧林巴斯CX-51光學(xué)顯微鏡觀察并攝相。

1.4.5腫瘤組織凋亡水平 將石蠟組織切片，按照羅氏公司TUNEL試劑盒操作說明書步驟處理，分別進(jìn)行TUNEL染色和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色，在熒光顯微鏡下觀察并攝相。

1.4.6腫瘤組織增殖情況 將石蠟組織切片，按照BRDU法檢驗(yàn)操作步驟進(jìn)行處理[7]。熒光顯微鏡下觀察，并量化BRDU陽性細(xì)胞的密度。

1.4.7腫瘤組織中CGRP/p-CREB信號(hào)通路改變 腫瘤組織塊用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液漂洗，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上裂解組織，離心5 min，收集上清液，使用2，2'-聯(lián)喹啉-4，4'-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，確定上樣量，沸水變性。按照Western blotting操作步驟[8]，并使用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度。

2 結(jié)果

2.1BTE對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤質(zhì)量、體積的影響 結(jié)果見表1。與模型對(duì)照組比較，BTE組小鼠的腫瘤質(zhì)量下降，體積縮小(均P<0.05)。

表1 2組小鼠腫瘤質(zhì)量及體積比較Tab.1 Comparison of tumor mass and volume between two groups of mice

2.2BTE對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)影響 結(jié)果見圖1。腫瘤組織HE染色發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組腫瘤組織細(xì)胞分布均勻致密；BET處理后，腫瘤組織部分細(xì)胞腫脹及細(xì)胞核固縮。

A.模型對(duì)照組；B.BTE組。圖1 2組小鼠腫瘤組織HE染色結(jié)果(×400)A.model control group；B.BTE group.Fig.1 HE staining of tumor tissue in two groups of mice(×400)

2.3BTE對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織凋亡水平影響 模型對(duì)照組腫瘤組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比例為(6.71±1.84)%，BTE組小鼠腫瘤組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比例為(18.00±2.74)%，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.95，P<0.01)。結(jié)果見圖2。

A.模型對(duì)照組；B.BTE組。圖2 2組小鼠腫瘤組織TUNEL染色結(jié)果(×400)A.model control group；B.BTE group.Fig.2 TUNEL staining of tumor tissue in two groups of mice(×400)

2.4BTE對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織增殖水平影響 結(jié)果見圖3。模型對(duì)照組腫瘤組織中BRDU陽性細(xì)胞比例為(76.67±8.36)%，BTE組小鼠腫瘤組織中BRDU陽性細(xì)胞比例為(31.94±6.77)%，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.69，P<0.01)。

A.模型對(duì)照組；B.BTE組。圖3 2組小鼠腫瘤組織BRDU染色結(jié)果(×400)A.model control group；B.BTE group.Fig.3 BRDU staining of tumor tissue in two groups of mice(×400)

2.5BTE對(duì)CGRP及p-CREB蛋白表達(dá)影響 結(jié)果見圖4。與模型對(duì)照組比較，BTE組小鼠腫瘤組織CGRP及p-CREB蛋白水平均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

A.模型對(duì)照組；B.BTE組。 ①與模型對(duì)照組比較，t=3.62，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=5.72，P<0.01。圖4 2組小鼠腫瘤組織中CGRP及p-CREB蛋白表達(dá)A.model control group；B.BTE group；①Compared with model control group，t=3.62，P<0.05；②Compared with model control group，t=5.72，P<0.01.Fig.4 Expression of CGRP and p-CREB proteins in the tumor tissues of two groups of

3 討論

癌痛方是我院臨床治療腫瘤常用的經(jīng)驗(yàn)方，具有散結(jié)消腫、通絡(luò)止痛的功效。方中川烏溫經(jīng)散寒，通絡(luò)止痛；重樓清熱解毒，消腫止痛；蟾酥解毒，消腫，止痛。研究證實(shí)川烏中烏頭堿可用于治療多種癌癥，如肝癌、肺癌、前列腺癌等，并可提高癌癥化療效果及減緩患者治療后的疼痛[9]。甾體皂苷是重樓主要活性成分[10]。重樓總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞具有一定的放療增敏作用，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低MUC-1 蛋白的表達(dá)有關(guān)[11]。研究證實(shí)，重樓皂苷I可通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量依賴性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，BTE能誘導(dǎo)Lewis肺癌小鼠腫瘤質(zhì)量降低，腫瘤體積縮?。煌瑫r(shí)，形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞腫脹變形及細(xì)胞核固縮；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BTE能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。提示BTE能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞作用。

CGRP感覺神經(jīng)元形成一個(gè)C類纖維亞群，該亞群參與疼痛傳導(dǎo)，并與突破痛的發(fā)生有關(guān)。CGRP及其受體在肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中高表達(dá)，其參與了肺癌及癌痛的發(fā)生、發(fā)展[13]。CREB是堿性亮氨酸拉鏈超家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)多種生理過程[14]；其在腫瘤細(xì)胞增殖、存活及轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用[15]。腫瘤微環(huán)境改變可以促進(jìn)CGRP及其下游p-CREB在Lewis肺瘤組織中感覺神經(jīng)興奮性及痛覺[16]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)癌痛方對(duì)醋酸所致小鼠疼痛具有顯著鎮(zhèn)痛作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)BTE能下調(diào)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中CGRP和CREB蛋白水平，提示CGRP/p-CREB信號(hào)通路抑制可能介導(dǎo)了BTE抑制癌痛作用。

綜上所述，癌痛方BTE能抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，并具有鎮(zhèn)痛作用。CGRP/p-CREB信號(hào)通路抑制可能介導(dǎo)了BTE抑制癌痛作用。本研究為癌痛方抑制癌痛及臨床應(yīng)用供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。