王澤坤，李亞明，楊靖雯，楊其峰,

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性生命健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率不斷升高，約占全球女性惡性腫瘤發(fā)病率的24%[1]。目前，國際通用的乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)可將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性型、三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）及其他特殊類型乳腺癌[2-3]。TNBC大約占全部乳腺癌的15%，該類型的乳腺癌以雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及HER2表達均陰性為特點。TNBC好發(fā)于年輕女性，其相對于其他類型的乳腺癌具有生長速率快、侵襲性強、容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，同時其缺乏內(nèi)分泌及抗HER2治療的靶點，目前尚無針對性的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，患者的5年生存率不足30%[4]。因此，急需尋找TNBC的新型診斷標(biāo)記物及分子治療靶點。

非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）是一類缺乏開放閱讀框（open reading frame，ORF）、無法被翻譯成為蛋白質(zhì)的RNA，其已被證明可以在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學(xué)行為過程中起到至關(guān)重要的作用[5]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼RNA家族中的一種，不具有編碼蛋白的能力但可參與調(diào)控細胞生物學(xué)過程，與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，其由前體mRNA經(jīng)由反向剪接反應(yīng)形成，因此具有特殊的剪接位點及序列；circRNA在發(fā)現(xiàn)之初被認為是mRNA錯誤剪接的產(chǎn)物[6-7]。同時circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定，不易降解，并具有高度穩(wěn)定性和組織特異性[8]。

近年來，各種研究表明circRNA在腫瘤細胞內(nèi)的異常表達參與了肺癌、肝癌和膀胱癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[9-11]。CircRNA在TNBC中的調(diào)控功能也有過相關(guān)報道，如circAGFG1可通過調(diào)控miR-195-5p/CCNE1信號軸促進TNBC的進展[12]，circRNA_069718可以通過激活Wnt/beta-catenin通路促進TNBC的增殖及侵襲能力[13]，circIFI30可以促進TNBC的進展并與TNBC患者的預(yù)后密切相關(guān)[14]。綜上所述，circRNAs可以在TNBC的進展轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用，但有關(guān)circRNA在TNBC中的具體功能及分子機制仍不明確，亟待進一步的研究。

本研究中首先利用高通測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，circRNA hsa-circ-0004840 [circ-整合素α1（integrin alpha 1，ITGA1）]在高轉(zhuǎn)移能TNBC細胞中呈現(xiàn)顯著高表達狀態(tài)。隨后發(fā)現(xiàn)，干擾circ-ITGA1表達可以顯著抑制TNBC細胞的增殖、遷移及侵襲能力，過表達circ-ITGA1則可以促進TNBC細胞的上述惡性生物學(xué)行為，并且circ-ITGA1可能是通過影響miR-624-5p/LMBRL1信號軸發(fā)揮相應(yīng)的功能。本研究證明了circ-ITGA1在TNBC的進展轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用，為進一步理解TNBC進展轉(zhuǎn)移的分子機制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

人正常乳腺上皮MCF-10A細胞以及乳腺癌MCF-10AT、MCF-10CA1A、MCF-10CA1H、HS578T、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-231及MDA-MB-468細胞購自美國菌種保藏中心。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國HyClone公司，胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自中國碧云天生物技術(shù)公司。LipofectAMINETM 2000購自美國Invitrogen公司。RNA抽提試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自長沙艾科瑞生物工程有限公司、PCR擴增試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司、EdU試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司、MTT購自北京索萊寶科技有限公司、Transwell小室購自美國Corning公司，結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物技術(shù)公司。特異性針對circ-ITGA1的siRNA（sicirc-ITGA1-1和sicirc-ITGA1-2）及陰性對照（negativecontrol，NC）（siNC）購自上海鉑尚生物技術(shù)有限公司。siNC的正義鏈序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’反義鏈序列為5’-AAACGTGACACGTTCGGAGAA-3’；sicirc-ITGA1-1的正義鏈序列為5’-AACAGACA CAGGGTGCTTATT-3’，反義鏈 序列為5’-AATAAGCACCCTGTGTCTGTT-3’；sicirc-ITGA1-2的正義序列為5’-TAAACAGACACAGG GTGCTTA-3’，反義鏈序列為5’-TAAGCACCC TGTGTCTGTTTA-3’。攜帶有特異性針對circ-ITGA1的重組過表達（overxexpression，OE）載體（PLCDH-circ-ITGA1-OE）及空載質(zhì)粒PLCDH（對照）購自廣州吉賽生物科技股份有限公司。

實時熒光定量PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，全自動酶標(biāo)儀為美國Bio-Tek公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 RNA測序

建立TNBC細胞系MDA-MB-231的高轉(zhuǎn)移能細胞MDA-MB-231-M，提取細胞總RNA；用RNase R將RNA消化為線性RNA，行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將RNA送聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進行高通量測序，并利用生物信息學(xué)分析方法分析測序結(jié)果，篩選出親本MDA-MB-231細胞和高轉(zhuǎn)移能MDA-MB-231-M細胞中差異表達的circRNAs。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞用含青鏈霉素雙抗及10% FBS的DMEM培養(yǎng)液（完全培養(yǎng)液），置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔24～48 h更換培養(yǎng)液。待細胞在融合度為90%～100%時，更換為無血清培養(yǎng)液饑餓細胞；使用LipofectAMINETM 2000分別將siRNA（sicirc-ITGA1-1、sicirc-ITGA1-2及siNC）或重組過表達載體（PLCDHcirc-ITGA1-OE及空載體PLCDH）轉(zhuǎn)入MDAMB-231和MDA-MB-468細胞中，8～10 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)液，24 h后再更換為有血清的培養(yǎng)液。circ-ITGA1過表達組中還需在24～36 h后加入終濃度為2.5 μmol/mL的嘌呤（puro）進行篩選，最終篩選出穩(wěn)定過表達circ-ITGA1的MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測

轉(zhuǎn)染24～36 h后，采用RNAeasy法提取MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞的總RNA，用DEPC處理后的去離子水溶解RNA。用Nanodrop 2000分光光度計檢測提取RNA濃度與純度。將提取獲得的總RNA按照10 μL體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 20 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保存。以cDNA為模板，進一步采用實時熒光定量PCR法檢測circ-ITGA1的表達水平（以β-actin為內(nèi)參照）；反應(yīng)體系為Syber green、引物（內(nèi)參或目的基因）和cDNA（共計10 μL）；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性5 s，55～68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，應(yīng)用2-△△Ct法計算circ-ITGA1在樣品中的相對表達量。

所用引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。circ-ITGA divergent上游引物序列為5’-TG CTGGATGGTTCCAACAGT-3’，下游引物序列 為5’-CACCTCTCCCAACTGGACAC-3’；circ-ITGA convergent上游引物序列為5’-TGC TTATTGGTTCTCCG-3’，下游引物序列為5’-TTGAAATGTGGGGCTGA-3’；ITGA1基因上游引物序列為5’-CCGAAGAGGTACTTG TTGCAGC-3’,下游引物序列為5’-GGCTTCC GTGAATGCCTCCTTT-3’；β-actin基因（內(nèi)參照）上游引物序列為5’-CACCATTGGCAATGA GCGGTTC-3’,下游引物序列為5’-AGGTCT TTGCGGATGTCCACGT-3’。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細胞中分別干擾及過表達circ-ITGA1。將各對照組和實驗組細胞用胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液重懸細胞制成細胞懸液并計數(shù)。以1 500個細胞/孔的密度接種于96孔板中（共設(shè)置6塊板），每孔中用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液將體積補齊至100 μL。從細胞接種24 h起，每24 h同一時間在其中一塊板中加MTT染料，4～6 h后在免疫酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測各孔的D值。連續(xù)檢測6 d，并根據(jù)D值繪制成細胞的生長曲線。

1.2.5 EdU實驗檢測細胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細胞系中分別干擾及過表達circ-ITGA1后，將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期階段，即大約占培養(yǎng)皿面積的60%～70%，然后將細胞種到96孔板中，每孔約1×104個細胞。過夜（培養(yǎng)至正常生長階段），每孔加入100 μL含Edu的培養(yǎng)液（EdU溶液與細胞完全培養(yǎng)液的體積稀釋比例為1∶1 000），孵育2 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入在4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.5%在TritonX-100溶液通透10 min后，隨后根據(jù)體外試劑盒說明書對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下隨機挑選3個視野進行取像和計數(shù)。

1.2.6 克隆形成實驗檢測細胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細胞中分別干擾及過表達circ-ITGA1后，將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期階段，將各對照組、實驗組細胞用胰蛋白酶消化后，加入完全培養(yǎng)液重懸細胞，制成細胞懸液并計數(shù)。將細胞接種至6孔板中，每種細胞設(shè)置3個復(fù)孔，每孔約800個細胞，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液并觀察細胞形態(tài)，3～6周后吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌1遍，用100%甲醇溶液固定細胞15～20 min，除去甲醇溶液，加入結(jié)晶紫染色15～20 min，用三蒸后的去離子水清洗細胞，晾干后拍照保留結(jié)果。

1.2.7 劃痕實驗檢測細胞的橫向遷移能力

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細胞系中分別干擾及過表達circ-ITGA1后，將細胞各組細胞接種于24孔板中（2×105個細胞/孔）；24 h后用PBS清洗細胞3遍，最后1遍清洗時不吸走PBS，使用10 μL槍頭在24孔板內(nèi)進行劃痕，置于倒置光學(xué)顯微鏡下拍攝0 h劃痕距離，更換無血清培養(yǎng)液，隨后將24孔板放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再置于倒置光學(xué)顯微鏡下拍攝24 h時的劃痕距離，然后計算出愈合率，與0 h進行比較，即可得出細胞的相對遷移能力。

1.2.8 Transwell小室實驗檢測細胞的縱向遷移能力和侵襲能力

將700 μL含有20% FBS的DMEM培養(yǎng)液加入24孔板中作為下室，將Transwell小室放入其中，作為上室。將MDA-MB-231細胞（6×104個/孔）和MDA-MB-468細胞（8×104個/孔）制成200 μL無血清的細胞懸液，接種于上室中，將設(shè)有小室的24孔板緩慢水平放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（MDAMB-468細胞需培養(yǎng)48 h）。用PBS輕輕洗滌1～2遍，用甲醇溶液固定細胞15 min，吸棄甲醇溶液，用結(jié)晶紫染料染色15 min后用三蒸去離子水輕柔洗凈，用棉球輕輕擦去上室中未穿過小室膜的細胞，干燥后在光學(xué)顯微鏡下隨機取3個視野拍照并計數(shù)。

細胞侵襲實驗中首先在小室膜上鋪設(shè)基質(zhì)膠，其余步驟同細胞遷移實驗。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

利用Graph Pad Prism 9.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有實驗均獨立重復(fù)3次，計量資料以表示。對于2組數(shù)據(jù)，選擇t檢驗的方法進行分析，而對于多組間數(shù)據(jù)首先選擇單因素方差分析，再行組內(nèi)兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Circ-ITGA1在TNBC高轉(zhuǎn)移能細胞中高表達

為了篩選與TNBC進展轉(zhuǎn)移相關(guān)的circRNAs，本研究前期即建立了MDA-MB-231細胞的高轉(zhuǎn)移能細胞MDA-MB-231-M。利用高通量測序的方法檢測了2組細胞間差異表達的circRNAs。結(jié)果顯示（圖1A），共有6 283個circRNAs在高轉(zhuǎn)移能MDA-MB-231-M細胞中高表達，4 667個circRNAs在MDA-MB-231-M細胞中表達降低。利用該高通量測序結(jié)果檢出的circRNAs的長度分布及分類如圖所示（圖1B和圖1C），選擇表達變化最為顯著的5個上調(diào)的circRNAs及5個下調(diào)的circRNAs（圖1D）。

采用實時熒光定量PCR法檢測乳腺癌細胞系中的各circRNAs表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1在TNBC細胞系中顯著上調(diào)且與乳腺癌細胞的惡性程度呈正相關(guān)（圖1E），同時通過檢索Mioncocirc數(shù)據(jù)庫[15]發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1在人體各種類型腫瘤中廣泛表達（圖1F）。最后，在MDA-MB-231及高轉(zhuǎn)移能細胞系MDA-MB-231-M中檢測了該circRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1在高轉(zhuǎn)移能細胞系中同樣顯著調(diào)（P＜0.01）（圖1G）。上述結(jié)果提示，circ-ITGA1表達水平與乳腺癌細胞的惡性程度呈正相關(guān)，其可能在TNBC細胞的進展轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

Fig.1 Circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) was up-regulated in metastatic TNBC cells.A:Heatmap of the significantly differentially expressed circRNAs between MDA-MB-231 and its highmetastatic MDA-MB-231-M cells.B:The length of identified circRNAs was presented.C:The types of identified circRNAs were presented.D:Five most significantly up-regulated and down-regulated circRNAs based on RNA-seq were presented.E:The expression level of circ-ITGA1 in breast cancer cells (MCF-10AT,MCF-10CA1A,MCF-10CA1H,HS578T,MCF-7,SK-BR-3,MDA-MB-453,MDA-MB-231 and MDAMB-468),and the human normal breast epithelial cells MCF-10A as the control.F:The expression level of circ-ITGA1 in different tissues based on Mioncocirc database.G:The expression level of circ-ITGA1 was detected in MDA-MB-231 and its high-metastatic MDA-MB-231-M cells with different high-metastatic abilities detected by real-time fluorescent quantitative-PCR.**P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).ACC:Adenoid cystic carcinoma;BLCA:Bladder urothelial carcinoma;BRCA:Breast invasive carcinoma;CHOL:Cholangiocarcinoma;COLO:Colorectal cancer;ESCA:Esophageal carcinoma;GBM:Glioblastoma multiforme;HCC:Liver hepatocellular carcinoma;HNSC:Head and neck squamous cell carcinoma;KDNY:Kidney cancer;LUNG:Lung cancer；OV:Ovarian serous cystadenocarcinoma;PAAD:Pancreatic adenocarcinoma;PRAD:Prostate adenocarcinoma;SARC:Sarcoma;SECR:Secretory cancer;SKCM:Skin cutaneous melanoma.圖1 circ-ITGA1在高轉(zhuǎn)移TNBC細胞系中表達上調(diào)

2.2 驗證Circ-ITGA1在TNBC細胞中為circRNA

通過檢索UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫[16]發(fā)現(xiàn)，circ-ITGA1由ITGA1基因的3～6號外顯子反向剪接形成，其成熟體circRNA的長度為442 nt。因此，本研究中首先設(shè)計了特異性針對circ-ITGA1反向引物（divergent primer）及正向引物（convergent primer），并利用反向引物擴增circ-ITGA1的反向剪接位點，并通過Sanger測序技術(shù)成功的檢測到了circ-ITGA1的剪接點特異性序列，該序列與circBase數(shù)據(jù)庫[17]展示的序列一致。證明了TNBC細胞內(nèi)存在circ-ITGA1（圖2A）。

由于circRNA具有抵抗核糖核酸酶R（RNAse R）消化的特性，本研究中利用RNAse R對MDA-MB-231細胞總RNA進行處理，并采用PCR法檢測circ-ITGA1對RNAse R的抵抗能力。結(jié)果顯示（圖2B），利用divergent引物特異性擴增circ-ITGA1，在有無RNase R處理的情況下均可擴增出產(chǎn)物；利用convergent引物擴增線性RNA，在無RNase R處理時可以有效擴增出PCR產(chǎn)物，而在RNase R處理的情況下，PCR產(chǎn)物顯著降低（MDA-MB-231細胞）甚至無法有效擴增（MDA-MB-468細胞）（P＜0.01）。這一結(jié)果表明，circ-ITGA1為circRNA，并且耐受RNase R消化。同時，以細胞基因組DNA（genomic DNA，gDNA）或cDNA為模板，分別用divergent primer和convergent primer對circ-ITGA1及β-actin（內(nèi)參照）的進行擴增，發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1僅在cDNA中可被檢測出來，未在gDNA中發(fā)現(xiàn)，符合circRNA的特性（圖2C）。

隨后，用放線菌素D處理MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞（0、4、8、12和24 h），并采用實時熒光定量PCR法檢測circ-ITGA1及本底基因ITGA1表達水平的變化。結(jié)果（圖2D）表明，相較于線性ITGA1基因的mRNA，circ-ITGA1具有更高的穩(wěn)定性及更長的半衰期（P＜0.05）。

Fig.2 Characterization of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) as a circular RNA in triplenegative breast cancer (TNBC) cells.A:The schematic diagram indicates the genomic loci of circ-ITGA1 and the designation of divergent and convergent primers.Sanger sequencing conducted following PCR using the indicated divergent flanking primers confirmed the “head-to-tail” splicing of circ-ITGA1.B:RNase R treatment was subjected to PCR with divergent or convergent primers.The relative expression level was detected by realtime fluorescent quantitative PCR.C:RT-PCR with divergent or convergent primers indicated the existence of circ-ITGA1 in cDNA,but not in gDNA (β-Actin was used as a negative control).D:Quantitative real-time fluorescent quantitative indicated the abundance of circ-ITGA1 and the ITGA1 mRNA in TNBC cells after treatment with actinomycin D at the indicated time points.E:The relative expression levels of circ-ITGA1 and ITGA1 in TNBC cells were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR after normalization to random primers and oligo (dT) primers.*P＜0.05,**P＜0.001,vs ITGA1 group (n=3)圖2 TNBC細胞系中circ-ITGA1環(huán)狀特性的驗證

由 于mRNA具 有poly（A）尾 部，而circRNA因其特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)不具備poly（A）尾部，因此最后分別利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的OligodT引物及Random引物對細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，隨后行實時熒光定量PCR法檢測。結(jié)果（圖2E）顯示，circ-ITGA1在Oligo-dT組中表達水平顯著降低，而ITGA1 mRNA的表達水平則無明顯變化（P均＜0.01），表明circ-ITGA1不具備poly（A）尾部結(jié)構(gòu)。

2.3 干擾circ-ITGA1的表達水平可以抑制TNBC細胞的增殖能力

為了檢測circ-ITGA1對TNBC細胞生物學(xué)功能的影響，本研究中在TNBC細胞中轉(zhuǎn)入針對circ-ITGA1特異性的siRNA。實時熒光定量PCR結(jié)果（圖3A）顯示，相較于轉(zhuǎn)入siNC的對照組細胞，sicirc-ITGA1-1和sicirc-ITGA1-2組MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞中circ-ITGA1的表達水平均明顯降低（P均＜0.01），驗證了siRNA的干擾效率。

Fig.3 Knockdown of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) inhibited proliferation of TNBC cells.A:The knockdown efficiency of circ-ITGA1 siRNAs.B:The proliferation rates of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells were examined by MTT assay.C:The proliferations of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells were examined by colony formation assay.D:The proliferation activities of MDA-MB-231 and MDAMB-468 cells were determined by EdU assay (×200).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs SiNC group (n=3).圖3 下調(diào)circ-ITGA1表達抑制TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞的增殖能力

隨后，采用MTT法及克隆形成實驗檢測下調(diào)circ-ITGA1表達對MDA-MB-231和MDAMB-468細胞增殖能力的影響。結(jié)果（圖3B和圖3C）顯示，干擾circ-ITGA1表達后，MDAMB-231和MDA-MB-468細胞的增殖能力均明顯降低（P均＜0.01）。進一步利用EDU實驗檢測對MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞增殖活性的影響，結(jié)果（圖3D）顯示干擾circ-ITGA1表達后，細胞的增殖活性均被明顯抑制（P均＜0.05）。

2.4 下調(diào)circ-ITGA1表達可以抑制TNBC細胞的侵襲及遷移能力

為了進一步驗證circ-ITGA1的生物學(xué)功能，干擾circ-ITGA1表達后采用Transwell小室實驗檢測對MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞縱向遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，干擾circ-ITGA1表達后，MDA-MB-231和MDAMB-468細胞的縱向遷移能力均被明顯下調(diào)（P均＜0.01）（圖4A）。同樣，細胞的侵襲能力也受到的抑制（P均＜0.01）（圖4B）。同時本研究中采用劃痕實驗檢測了對MDA-MB-231和MDAMB-468細胞橫向遷移能力的影響，結(jié)果（圖4C）顯示干擾circ-ITGA1表達后，MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞的遷移距離均被明顯降低（P均＜0.01）。結(jié)果表明，干擾circ-ITGA1的表達水平可以抑制TNBC細胞的侵襲及遷移能力。

Fig.4 Knockdown of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) suppressed migration and invasion of triple-negative breast cancer cells.A:Transwell assay showed the migration abilities of TNBC cells were inhibited (×100).B:The invasion abilities of TNBC cells were suppressed after circ-ITGA1 knockdown (×100).C:Wound healing assay confirmed the migration abilities of TNBC cells were inhibited(×100).**P＜0.01,***P＜0.001 vs siNC group (n=3).圖4 下調(diào)circ-ITGA1表達抑制TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞的侵襲及遷移能力

Fig.5 Overexpression of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) promoted the proliferation,migration and invasion of triple-ngative brease cancer TNBC cells.A:The efficiency of circ-ITGA1 overexpression in TNBC cells.MTT (B) and colony formation (C) assay showed the proliferation rates of TNBC cells were increased by circ-ITGA1.D:The proliferative activities of TNBC cells were enhanced with circ-ITGA1 overexpression (×200).The migration (E) and invasion (F) abilities of TNBC cells were promoted after circ-ITGA1 overexpression (×100).G:Wound healing assays confirmed the migration abilities of TNBC cells were increased by circ-ITGA1 (×100).**P＜0.01,***P＜0.001 pbCON group (n=3).圖5 過表達circ-ITGA1促進TNBC細胞增殖、侵襲和遷移

2.5 過表達circ-ITGA1表達水平可以促進TNBC細胞的增殖、侵襲及遷移能力

為了進一步驗證circ-ITGA1對TNBC細胞生物學(xué)功能的影響，本研究再在MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞中使circ-ITGA1過表達。（P均＜0.01）（圖5A）。隨后，采用MTT法及克隆形成實驗檢測了細胞的增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達circ-ITGA1后，TNBC的細胞增殖速率顯著升高（P均＜0.01）（圖5B、C）。同時，EDU實驗顯示過表達circ-ITGA1后細胞的增殖活性顯著升高，與之前所述結(jié)果相吻合（P均＜0.01）（圖5D）。進一步利用Transwell實驗證明了過表達circ-ITGA1后細胞的侵襲及遷移能力均有顯著的升高（P均＜0.01）（圖5E，F(xiàn)）。同時劃痕實驗也證明了circ-ITGA1對細胞遷移能力的促進作用（P均＜0.01）（圖5G）。綜上所述，我們的結(jié)果表明，過表達circ-ITGA1的表達水平可以促進TNBC細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

2.6 circITGA1影響TNBC細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移可能的作用機制

研究表明，circRNA可以吸附微RNA（microRNA，miRNA），而miRNA又能與mRNA結(jié)合從而誘導(dǎo)基因沉默，故circRNA被當(dāng)作一種內(nèi)源競爭性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），與miRNA競爭性的結(jié)合，從而降低miRNA對于靶mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用，促進靶mRNA的表達，形成circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控體系，在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[18]。通過Circbank[19]和Circinteractome[20]2個網(wǎng)站來預(yù)測可能與circITGA1結(jié)合的miRNAs，二者取交集，共得到5個可能的靶miRNAs，分別 為has-miR-136-5p、has-miR-338-3p、hasmiR-582-3p、has-miR-589-3p和has-miR-624-5p（圖6A）。接著用Metabric[21]和TCGA[22]數(shù)據(jù)庫分析這5個靶miRNAs對于TNBC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)僅有高表達has-miR-624-5p組的預(yù)后明顯優(yōu)于低表達組，與circ-ITGA1的功能相一致（圖6B）。圖6C則展示了circITGA1與hasmiR-624-5p的結(jié)合位點。接著通過miRNet[23]網(wǎng)站預(yù)測到了127個可能與miR-624-5p結(jié)合的靶基因。進一步利用Mioncocirc數(shù)據(jù)庫預(yù)測在乳腺癌患者中與circ-ITGA1表達呈正相關(guān)的基因共3 861個，對2組結(jié)果取交集，共得到3個感興趣的基因，分別為LMBR1L、MAP3K1和LONRF2（圖6D）。圖6E則展示了這3個基因與circ-ITGA1表達的相關(guān)性。為了進一步篩選可能的靶基因，本研究中再利用TCGA數(shù)據(jù)庫探究了TNBC患者中miR-624-5p與基因表達的相關(guān)性。結(jié)果表明，僅有LMBR1L的表達與miR-624-5p呈負相關(guān)，符合ceRNA的表達趨勢（圖6F）。同時，利用Metabric和TCGA分析LMRB1L的表達對于TNBC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)LMBR1L與患者的預(yù)后呈負相關(guān)（圖6G）。由此推測，circ-ITGA1可能是通過競爭性地結(jié)合has-miR-624-5p從而降低has-miR-624-5p對LMBR1L的，進而發(fā)揮促進腫瘤進展轉(zhuǎn)移的功能（圖6H）。

3 討 論

作為世界3大癌癥之一，乳腺癌深深威脅著女性身體健康[24]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)不斷進展，對乳腺癌的研究有了突破性的進展，應(yīng)對各類乳腺疾病的能力不斷提高，乳腺癌的臨床診治能力不斷提高，人們對乳腺健康的關(guān)注度不斷提高，但乳腺癌發(fā)病率仍增長迅速，甚至成為發(fā)病率第一的癌癥類型[25]

專家學(xué)者嘗試從各種途徑來探討乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制，近年來，隨著生物信息學(xué)以及RNA-seq的飛速發(fā)展，使得用高通量測序技術(shù)進行測序分析成為可能，能直觀反映出circRNA和長鏈非編碼RNA等的表達水平，這也推進了非編碼RNA的研究，使其逐漸成為當(dāng)下研究領(lǐng)域熱門話題。非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括circRNA、長鏈非編碼RNA、miRNA、rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。這些RNA均由基因組轉(zhuǎn)錄得到，大多不翻譯為蛋白質(zhì)，在RNA水平上就能行使各自的生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)多種細胞生物學(xué)過程。

Fig.6 MicroRNA (miR)-624/LMBR1L could be the potential target of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1).A:The target miRNAs of circ-ITGA1 were predicted by circBank and Circinteractome database,and 5 miRNAs were filtered out.B:The prognosis of TNBC patients with different miR-624 expression in Metabric and TCGA databases.C:The predicted binding sites of circ-ITGA1 and miR-624.D:The potential target genes of miR-624 were predicted by using miRNet and Mioncocirc databases,and 3 genes were selected.E:The correlation between circ-ITGA1 and LMBR1L,MAP3K1 and LONRF2 expression.F:The correlation between miR-624 and LMBR1L,MAP3K1 and LONRF2 expression.G:The prognosis of TNBC patients with different LMBR1L expression in Metabric and TCGA databases.H:The potential molecular mechanisms of circ-ITGA1/ miR-624/LMBR1L axis.圖6 miR-624/LMBR1L信號軸可作為circ-ITGA1的潛在分子靶點。

circRNA是當(dāng)下熱點的研究方向，其是一種特殊的非編碼RNA，它沒有5’帽子結(jié)構(gòu)和3’ poly（A）尾，為共價閉合、單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對核酸外切酶不敏感，因此比普通的線性RNA（linear RNA）更穩(wěn)定。研究還發(fā)現(xiàn)，circRNA具有細胞和組織特異性，廣泛存在于真核生物轉(zhuǎn)錄組中，主要位于細胞質(zhì)中，也有部分位于細胞核中[26]。研究表明，circRNA可以參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[27]。在乳腺癌中，已有報道如circRNA_0025202可以調(diào)控乳腺癌細胞對它莫西芬的耐藥性[28]；Hsa_circ_001783可以通過吸附miR-200c-3p影響乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移[29]等。然而有關(guān)circRNA影響TNBC的具體功能及機制仍不甚明確，因此本研究中首先采用RNA高通量測序技術(shù)，對乳腺癌細胞系進行了測序分析，通過差異表達譜以及實時熒光定量PCR技術(shù)證實circ-ITGA1在高轉(zhuǎn)移能細胞系中顯著高表達，因此提示circ-ITGA1可能能夠影響TNBC的進展和轉(zhuǎn)移能力。為了進一步研究circ-ITGA1的相關(guān)功能，構(gòu)建了針對circ-ITGA1的siRNA，經(jīng)一系列體外實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)circ-ITGA1之后，細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為受到抑制；隨后構(gòu)建了針對circ-ITGA1的重組過表達質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染進TNBC細胞，進行體外功能實驗驗證，發(fā)現(xiàn)過表達circ-ITGA1促進了TNBC細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為，進一步驗證了circ-ITGA1的異常表達對細胞增殖、遷移及侵襲的影響。這些結(jié)果表明，circ-ITGA1在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

基于文獻報道，circRNA行使其相關(guān)功能的機制主要是：（1）作為海綿吸附microRNA，抑制miRNA對mRNA的降解或阻礙其翻譯；（2）誘導(dǎo)血管生成；（3）與RNA結(jié)合蛋白相互作用；（4）促進腫瘤免疫逃逸；（5）促進腫瘤微環(huán)境形成等多種方式參與乳腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[30]。為了進一步研究circ-ITGA1發(fā)揮功能的相關(guān)的分子作用機制，本研究中首先分析了可能與circ-ITGA1結(jié)合的miRNAs，其中miR-624-5p在數(shù)據(jù)庫中表現(xiàn)為抑癌基因表型，高表達miR-624-5p的TNBC患者呈現(xiàn)較好的預(yù)后。同時基于文獻報道，miR-624-5p在腫瘤中參與了多種促癌相關(guān)非編碼RNAs的分子機制，如hsa_circ_0091579可以通過調(diào)控miR-624/H3F3B信號軸從而促進“Warburg效應(yīng)”并促進肝細胞癌的惡性生物學(xué)行為[31]；長鏈非編碼RNA LncRNAZFAS1可以通過調(diào)控miRNA-624/MDK/ERK/JNK/P38信號軸從而促進肝細胞癌的進展和轉(zhuǎn)移過程等[32]。因此，miR-624可作為circ-ITGA1潛在的靶miRNA。同時，為了進一步分析circ-ITGA1/miR-624的分子機制，我們利用數(shù)據(jù)庫分別篩選與circ-ITGA1呈表達正相關(guān)及與miR-624表達呈負相關(guān)的基因，篩選出LMBR1L可能作為下游靶基因。

綜上所述，circRNA circ-ITGA1可以通過調(diào)控miR-624/LMBR1L信號軸進而調(diào)控TNBC的進展和轉(zhuǎn)移進程，有望成為TNBC治療的新靶點。