侯光生，閆貴云，李 欣，喬麟軼，常利芳，張曉軍，暢志堅

(山西農業(yè)大學 農學院/作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西農業(yè)大學 農學院，山西太谷 030801)

小麥(TritiumaestivumL.，2n = 6x = 42，AABBDD) 是中國三大糧食作物之一，全國40%以上的人口以小麥作為主食。小麥的安全生產與產量提高，對促進中國糧食安全和保障市場需求具有重要影響[1]。穗粒數(shù)是影響小麥產量的三大要素之一，一直以來都是遺傳育種學家研究的焦點[2]。正常情況下，普通小麥的每一朵小花之內都包含1個雌蕊和3個雄蕊，最終發(fā)育成1粒種子[3]。陳濟世等[4]最早報道了1種生有3個雌蕊的小麥材料，并將之命名為“三粒小麥”，其主要特點是每朵小花都包含3個雌蕊和3個雄蕊，比正常小麥多出2個雌蕊，且每朵小花都可以發(fā)育成3粒種子。

40余年來，國內外已對小麥三雌蕊性狀進行了大量研究。王宏霞等[5]通過SSR標記分析三雌蕊性狀的可能來源。Peng[6-7]等證實了三雌蕊性狀是受1對顯性核質基因控制，為三雌蕊性狀的遺傳分析和染色體定位奠定了基礎。Yang等[8]對三雌蕊突變體中的差異表達基因進行了鑒定，Wei等[9]分析了可能與三雌蕊性狀相關聯(lián)的WAG-2D基因的功能，為三雌蕊基因克隆提供了有用的信息。Watanabe等[10]將三雌蕊突變體與具有藍粒糊粉層基因的品種雜交，對三雌蕊性狀的發(fā)育起源進行了研究。Peng等[7]將三雌蕊基因定位在小麥4B染色體上。Wang等[11]利用中國春2D缺失系將控制小麥三雌蕊性狀的基因定位到了染色體2DL的末端區(qū)域。但目前對于小麥三雌蕊性狀基因的克隆和三雌蕊性狀形成原因及其遺傳機理尚無明確結論，在生產上的應用也無較大進展。

CH257為山西農業(yè)大學農學院利用‘三粒小麥’與普通小麥品系‘石優(yōu)20’回交3次后選育的一個三雌蕊材料，本研究通過對CH257與普通小麥中國春構建的后代群體進行遺傳分析，并利用90K SNP芯片掃描結合分離群體分組分析法(bulked segrgant analysis，BSA)進行基因定位和連鎖標記開發(fā)，以期為合理有效地利用三雌蕊小麥種質提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本實驗使用組合“CH257×中國春”的F1、F2、BC1及F3進行三雌蕊性狀的遺傳分析，CH257來源于組合‘三粒小麥/石優(yōu)20*3’的F5選系。中國春(Chinese Spring)小麥種子由電子科技大學生命科學學院楊足君教授惠贈。其他實驗材料均來自山西農業(yè)大學農學院。

1.2 遺傳群體構建

將CH257與中國春進行正反雜交構建F1群體，F(xiàn)1世代單株套袋自交，收獲種子后播種構建F2分離群體，F(xiàn)2群體單株編號掛牌后，于4～5葉期每株取5 cm長葉片置于2 mL離心管中，采用CTAB法[12]提取基因組DNA。收獲后每株取40粒種子播種于溫室，構建F2:3群體，用于推測F2代基因型。

1.3 遺傳群體表型調查

田間性狀統(tǒng)計數(shù)據收集可以在小麥的開花期或成熟期(4月底或5月初)兩個時期進行。在開花期進行數(shù)據的統(tǒng)計，如果有3個雌蕊在一朵小花里面則被認為是三雌蕊性狀，如果只有1個雌蕊和3個雄蕊在一朵小花里面，則被認為是正常雌蕊，即正常小麥性狀。

1.4 BSA法混池及SNP芯片掃描

根據F2:3單株表型結果，在“CH257×中國春”組合中選取三雌蕊和單雌蕊各40個F2單株，按照BSA法[13]分別取每個F2單株等量DNA組建三雌蕊和單雌蕊DNA混合池，利用illumina Wheat 90K SNP芯片分別對CH257、‘中國春’、三雌蕊混合池和單雌蕊混合池進行芯片掃描，委托中玉金(北京)生物技術股份有限公司進行SNP分型。掃描結果使用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據分析[14]。

1.5 連鎖標記開發(fā)

根據SNP分析結果，確定相關基因所在染色體區(qū)段。利用在NCBI數(shù)據庫(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/?term=wheat)中檢測中國春基因組(IWGSC v1.0)數(shù)據，利用SSR Hunter 1.3檢索該序列片段中的SSR，提取所有SSR序列兩側各300 bp序列，利用Primer Premier 6.0設計引物(表1)，Tm值為55 ℃，引物長度為18～22 bp。設計的引物在PCR儀(C1000型，美國伯樂公司)進行擴增，擴增產物加入2 μL 6×Loading Buffer，混勻后采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(220 V恒壓)，銀染法染色，顯影后，在膠片觀察燈上觀察電泳結果，照相并對F2群體進行條帶統(tǒng)計。

表1 16個在小麥CH257和‘中國春’上有擴增產物的SSR引物

2 結果與分析

2.1 三雌蕊基因的遺傳分析

利用CH257與‘中國春’進行正交構建F1群體，其F1再與雙親進行回交，并對F1、BC1F1和F2群體的性狀進行調查分析，結果如表2。其中，F(xiàn)1群體共35個單株，且都為三雌蕊性狀；BC1(CH257/中國春//中國春)群體共126株，65株為三雌蕊，61株為單雌蕊，卡方檢驗符合1∶1；BC1(CH257/中國春//CH257)群體共85株，全部為三雌蕊；F2代群體共312株，224株為三雌蕊，88株為單雌蕊，卡方檢驗結果表明三雌蕊:單雌蕊符合3∶1比例。以上遺傳結果分析表明在CH257中存在一個顯性單基因位點控制小麥三雌蕊發(fā)育的性狀。

2.2 三雌蕊基因SNP芯片分析

運用90K SNP基因芯片分別對‘CH257/中國春’組合兩個極端混池以及雙親進行全基因組檢測，在兩個混池及雙親間均表現(xiàn)差異的SNP進行比對，獲得兩個混池和兩個親本間共同表現(xiàn)差異的SNP共有557個，根據90K SNP基因芯片遺傳整合圖譜信息，將表現(xiàn)差異的位點整合到小麥的21條染色體上。由圖1，A 可知，3D、4D、6D、7D四條染色體上SNP位點差異不明顯；2D染色體上差異位點分布多達247個，約占總SNP數(shù)量的44%；3A、5A、6B三條染色體上均分布著12個差異位點；2A染色體上分布32個位點，約占總SNP數(shù)量的6%；2B染色體上分布著25個位點，約占總SNP數(shù)量的4%；其余的SNP差異位點分布在其他染色體上。另外，由圖1，B初步推測控制三雌蕊性狀的基因位于2D染色體的長臂上。

表2 遺傳群體性狀分析

2.3 連鎖標記的篩選

根據SNP芯片檢測結果，在2D染色體上設計了48對引物，設計的引物先在親本CH257和‘中國春’間篩選，共篩選出親本間多態(tài)性引物16對；用這16對引物擴增11株三雌蕊和11株單雌蕊組成的小群體，獲得5對連鎖的標記，分別為2DL07、2DL17、2DL22、2DL25和2DL38。

圖1 SNP差異位點分布位置(A)以及SNP位點在2D染色體上的分布(B)Fig.1 The physical distribution of SNP difference sites (A) and SNP sites are distributed on the chromosome 2D (B)

利用篩選出的5個多態(tài)性標記對F2群體的312個單株進行了PCR擴增(圖2)，與三雌蕊親本CH257帶型相同的個體基因型記為“A”，二者的雜合帶型記為“H”，與單雌蕊親本‘中國春’帶型相同的個體基因型記為“B”。讀帶結果(表3)顯示， 5個標記的基因型數(shù)量分離比例均符合1∶2∶1。根據小群體篩選結果推測，上述5個標記與CH257中的三雌蕊控制基因Pis-CH257均存在連鎖關系。

2.4 遺傳圖譜構建

利用5個連鎖標記檢測全部F2群體，根據分子標記檢測結果和田間表型鑒定結果，使用Joinmap4.0軟件計算連鎖距離，最終將CH257中控制雌蕊發(fā)育的基因Pis-CH257定位于2DL染色體2DL22-2DL25之間，2DL22和2DL25與Pis-CH257的遺傳距離分別為1.1cM和2.3cM。使用Mapchart2.3繪制遺傳連鎖圖譜(圖3，A)，通過查詢了小麥2D染色體的長度和5個標記的物理位置和已有報道的標記的物理位置(圖3，B)繪制了Pis-CH257的物理圖譜[15](圖3，C)。

M. Marker；A.三雌蕊親本(CH257)；B.單雌蕊親本(中國春)；1～11.三雌蕊單株；12～22.單雌蕊單株圖2 Pis-CH257連鎖SSR標記在“CH257×中國春”F2代三雌蕊與單雌蕊小群體擴增結果M. DNA size marker; A. Three pistil parent (CH257); B. Single pistil parent (Chinese Spring); 1-11. Three pistil per plant; 12-22. Single pistil per plantFig.2 Amplification results of Pis-CH257-linked SSR markers in three pistil and single pistil small population of “CH257×CS” F2

表3 Pis-CH257連鎖SSR對F2群體的擴增結果

圖3 Pis-CH257遺傳連鎖圖譜(A)、Pis-CH257已有標記物理圖譜(B)和已有標記比較物理圖譜(C)Fig.3 Pis-CH257 genetic linkage map (A), Pis-CH257 existing marker physical map (B) and existing marker physical map (C)

3 討 論

與其他谷類作物一樣，小麥花器官的發(fā)育直接影響谷物產量，然而這種花器官異?？梢詾楦牧夹←湲a量提供獨特的遺傳資源[16]。解析小麥花發(fā)育機制可以促進雜交小麥的發(fā)展，增加小麥的產量構成[17-19]。對控制小麥花發(fā)育基因的分子特征和調控因子的鑒定，可以改變小麥育種策略和加快培育高產小麥品種進程[20-21]。一個小花中發(fā)育出3個雌蕊在小麥遺傳育種研究中具有極大的利用價值，不僅能夠為研究植物花器官發(fā)育的機理和遺傳機制提供實驗材料，而且對小麥雜種優(yōu)勢利用和產量的提高也具有一定的作用[21]。關于三雌蕊性狀的遺傳機制，馬守才等[22-23]的研究認為控制三雌蕊小麥的基因有隱性和顯性兩種，且受細胞質影響嚴重；武軍等[24]、Peng等[6-7]研究認為，三雌蕊基因受一對顯性單基因控制；但Zhu等[25]的研究認為三雌蕊性狀受單個半顯性基因控制。本研究通過對“CH257/中國春”組合后代群體進行遺傳分析后，發(fā)現(xiàn)CH257的三雌蕊性狀可以穩(wěn)定遺傳給后代，而且在CH257中控制三雌蕊性狀的基因是一個顯性單基因。

SNP芯片結合傳統(tǒng)的分離群體分組分析法(BSA)，可以快速檢測2個不同表現(xiàn)型構建的混合池間的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)與目標性狀關聯(lián)度高的SNP變異，確定其所在染色體區(qū)段，并在此基礎上開發(fā)與目標基因位點連鎖的特異性PCR標記，實現(xiàn)對目標性狀控制基因的快速定位[26-27]。本研究采用90K SNP芯片結合BSA法，將CH257中控制三雌蕊性狀的基因Pis-CH257初步定位在2D染色體長臂上，之后利用在該區(qū)段開發(fā)的SSR標記將其定位于兩個SSR標記2DL22和2DL25之間。Yang等[28]于2017年將控制小麥三雌蕊性狀基因Pis1定位在標記M70和M71之間，兩個標記與Pis1的遺傳距離分別為1.1 cM 和3.0 cM。Zhu等[25]于2019年開發(fā)了4個SSR標記將控制小麥三雌蕊性狀的基因12TP定位在2DL染色體上，兩側標記遺傳距離7.58 cM。Yu等[29]于2020年利用BSA構建了三雌蕊位點(Pis1)的部分遺傳連鎖圖譜。這些研究都將三雌蕊基因定位在小麥2D染色體上，所有這些研究都表明在2DL染色體臂上有一個控制三雌蕊表型的基因座。將已報道三雌蕊基因連鎖標記的物理圖譜與本實驗中所用標記的物理圖譜進行了比較(圖3，C)發(fā)現(xiàn)， Yang等[28]通過M70和M71標記定位的Pis1物理位置與Pis-CH257所在區(qū)段物理位置相鄰；Yu等[29]將Pis1定位在分子標記Me5-eM33和M75之間，其物理位置與Pis-CH257區(qū)段物理位置接近，且有部分位置重合。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于遺傳背景不同所導致，但二者是否是等位基因還需要進一步的實驗驗證。本研究縮短了三雌蕊基因所在遺傳區(qū)間，但距離成功克隆三雌蕊小麥還有著不小的差距，下一步將利用來自F2的大群體篩選交換株，進行精細作圖。

綜上所述，本研究通過對“CH257/中國春”組合的F1、B1C1和F2群體進行遺傳分析后得出，CH257中存在一個受顯性基因控制的基因位點控制著小麥三雌蕊性狀，通過BSA法混池后經90K SNP芯片掃描確定控制三雌蕊的基因Pis-CH257處于2D染色體長臂上。根據基因芯片掃描結果在2D染色體上開發(fā)了5個SSR標記將Pis-CH257定位于2DL染色體2DL22-2DL25之間，遺傳距離分別為 1.1 cM和2.3 cM，為克隆控制小麥三雌蕊性狀的基因提供了基礎。