吳秀怡，田清尹，楊秀蓮，岳遠(yuǎn)征，王良桂

(南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210037)

桂花(Osmanthusfragrans)是原產(chǎn)于中國(guó)的一種重要觀賞經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。花是其最重要的觀賞器官，具有形小繁多，芬芳馥郁，顏色豐富的特性[1]。同時(shí)，它富含多種有益于人體健康的營(yíng)養(yǎng)元素，常用于配料制作各種中國(guó)傳統(tǒng)美食，在精油、洗護(hù)用品等化學(xué)工業(yè)中也擁有巨大的應(yīng)用潛力[2-4]。桂花具有極高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，因此，研究參與調(diào)控桂花花朵開(kāi)放過(guò)程中相關(guān)基因的作用機(jī)制及功能具有重要意義。

SPL(SQUAMOSA-promoter binding protein-like)基因是一個(gè)調(diào)控花發(fā)育過(guò)程的重要樞紐，僅存在于綠色植物中。SPL基因家族成員均含有由76個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的SBP結(jié)構(gòu)域，即兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(Cys-Cys-His-Cys或Cys-Cys-Cys-Cys和Cys-Cys-Cys-His)和一個(gè)核定位信號(hào)(NLS)[5]。兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)通過(guò)結(jié)合鋅離子來(lái)維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定，而核定位信號(hào)與第二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)部分重疊，引導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]。SPL基因首次在金魚(yú)草中被發(fā)現(xiàn)[6]，之后又陸續(xù)從單細(xì)胞藻類到高等植物中被成功克隆出來(lái)[7-8]。目前，有關(guān)SPL基因家族的全基因組鑒定已在擬南芥[9-10]、水稻[11]、小麥[12]、矮牽牛[13]、麻風(fēng)樹(shù)[14]和桃[15]中得到系統(tǒng)性的研究，其功能也被相繼報(bào)道。

在模式植物擬南芥中，共鑒定得到17個(gè)SPL基因家族成員，它們?cè)趨⑴c調(diào)控?cái)M南芥花朵開(kāi)放過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9-10]。SPL基因可以調(diào)控植物的開(kāi)花時(shí)間和花器官的生長(zhǎng)，如過(guò)表達(dá)AtSPL3的擬南芥出現(xiàn)提前開(kāi)花的現(xiàn)象并導(dǎo)致花序異常[16]，抑制AtSPL10的表達(dá)則會(huì)影響擬南芥花柄的伸長(zhǎng)[17]。在花藥育性方面，過(guò)表達(dá)AtSPL8會(huì)降低擬南芥的育性[18]，它通過(guò)影響赤霉素生物合成和油菜素類固醇信號(hào)傳導(dǎo)起到正向的調(diào)控作用。此外，SPL基因還參與調(diào)控花色和花香物質(zhì)的合成。MicroRNA156(miR156)通過(guò)調(diào)控AtSPL9破壞MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的穩(wěn)定性來(lái)抑制二氫黃酮還原酶DFR(dihydroflavonol reductase)的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控花青素的生物合成[19]。同時(shí)，AtSPL9對(duì)倍半萜合成酶AtTPS21表達(dá)的調(diào)控可以促進(jìn)擬南芥在開(kāi)花階段形成(E)-b石竹烯等香氣物質(zhì)[20]。

桂花花朵開(kāi)放是一個(gè)較為特殊的生物學(xué)過(guò)程，它需要特殊的環(huán)境條件，如溫度、空氣濕度和光照等[21-22]。此外，不同品種的桂花在花朵開(kāi)放過(guò)程中也有不同的作用機(jī)制，如色與香的合成過(guò)程及差異變化一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)[23]。本研究基于課題組前期的桂花全基因組數(shù)據(jù)，鑒定得到29個(gè)SPL基因家族成員，系統(tǒng)分析了基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和不同組織間表達(dá)模式，篩選出可能參與調(diào)控桂花花朵開(kāi)放過(guò)程中的SPL基因，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析SPL基因在花朵不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，進(jìn)行亞細(xì)胞定位和酵母自激活實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，為解析SPL基因參與調(diào)控桂花花朵開(kāi)放過(guò)程的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

以桂花‘日香桂’(O.fragrans‘Rixianggui’)品種為實(shí)驗(yàn)材料，采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。采集時(shí)間為每日上午9：00～11：00，采集樣品為花朵開(kāi)放過(guò)程中不同發(fā)育階段的花瓣：鈴梗期(S-1)、香眼期(S0)、初花期(S1)、盛花期(S2)和末花期(S3)，相鄰兩個(gè)花期間隔1～2 d(圖1)，每個(gè)花期3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有樣品采集后立即放入液氮中速凍處理，并置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 方 法

1.2.1 桂花SPL基因家族成員鑒定從Pfam網(wǎng)站下載SPL家族的結(jié)構(gòu)域模型文件(Pfam03110)，使用HMMER軟件從桂花全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中初步篩選出所有包含SPB結(jié)構(gòu)域的蛋白序列[24]，利用Batch CD-search、Pfam和SMART這3個(gè)在線工具驗(yàn)證其是否含有完整的SPB保守結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用Weblogo3將SBP結(jié)構(gòu)域可視化，運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站分析OfSPL蛋白序列的相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)值，使用WoLF PSORT在線預(yù)測(cè)OfSPL蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.2 桂花OfSPL生物信息學(xué)分析利用MEGA7.0軟件將OfSPL與AtSPL編碼的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)，Poission模式、完全刪除和1000次重復(fù)進(jìn)行測(cè)試，AtSPL的蛋白序列下載自Tair官網(wǎng)。在桂花全基因組GFF3文件中提取OfSPL的染色體信息(染色體長(zhǎng)度和基因的起始、終止位點(diǎn))繪制染色體定位圖。使用TBtools獲取桂花SPL基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)信息并進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的可視化展示。

S-1. 鈴梗期；S0. 香眼期；S1. 初花期；S2. 盛花期；S3. 末花期圖1 桂花花朵開(kāi)放的不同發(fā)育階段S-1. Bud-pedicel stage; S0. Bud-eye stage; S1. Primary blooming stage; S2. Full blooming stage; S3. Flower fading stageFig.1 Different flower development stages of O. fragrans flower opening

1.2.3 桂花不同組織及花發(fā)育不同階段表達(dá)分析基于桂花全基因組的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)得到7個(gè)不同組織(根、莖、幼葉、成熟葉、初花期、盛花期和末花期)的FPKM值，進(jìn)行SPL基因家族成員的表達(dá)分析。利用TBtools完成表達(dá)熱圖的繪制，篩選出在花組織中較高表達(dá)的SPL基因。

按照天根植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明提取桂花花朵不同發(fā)育階段的RNA，采用EasyScript一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA的合成，并用去離子水稀釋10倍。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)OfSPL的特異性引物，以桂花RAN為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量[25-26]。測(cè)定結(jié)果均為3次生物學(xué)和3次技術(shù)性重復(fù)的平均值±SE，利用SPSS(22.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性比較。

1.2.4OfSPL10/21候選基因亞細(xì)胞定位及酵母自激活為了構(gòu)建35S∷GFP-OfSPL10/21，將OfSPL10/21的CDS序列克隆到pCAMBIAsuper1300-GFP載體上。采用攜帶35S∷GFP-OfSPL10/21農(nóng)桿菌(GV3101)及對(duì)照載體注射本氏煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析。待浸潤(rùn)植株于生長(zhǎng)室正常培養(yǎng)2 d后，在德國(guó)Zeiss公司的LSM710顯微鏡上觀察綠色熒光蛋白(GFP)熒光信號(hào)。

將OfSPL10/21的CDS序列克隆到pGBKT7載體獲得pGBKT7-OfSPL10/21，再將pGBKT7-OfSPL10/21和陰性對(duì)照pGBKT7轉(zhuǎn)化到酵母AH109菌株上，并于SD/-Trp、SD/-Trp-ade和SD/-Trp-ade+X-α-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d(30 ℃)后觀察變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 OfSPL基因家族成員鑒定

基于桂花全基因組數(shù)據(jù)，共鑒定得到29個(gè)OfSPL家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置，依次命名為OfSPL1—OfSPL29(表1)，它們不均勻地分布在桂花15條染色體上(圖2)。29個(gè)OfSPL家族成員均含高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域(圖3)。此外，OfSPL10/17/21/22蛋白序列還包含ANK結(jié)構(gòu)域，OfSPL11包含RRM結(jié)構(gòu)域。29個(gè)OfSPL蛋白分子量從15.053 kD跨度到119.887 kD，最長(zhǎng)的OfSPL19含有1 088個(gè)氨基酸，而最短的OfSPL2僅有133個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)分布在6.16～9.83之間。

2.2 OfSPL系統(tǒng)發(fā)育和基因結(jié)構(gòu)分析

為了解桂花SPL基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將29個(gè)桂花SPL蛋白和16個(gè)擬南芥SPL蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，29個(gè)桂花SPL蛋白聚為8個(gè)亞群，每個(gè)亞群分別含有7、6、10、4、6、9、3和1個(gè)蛋白，其中桂花OfSPL分別為4、3、7、3、3、5和2個(gè)。除了亞群8，每個(gè)亞群至少包含1個(gè)AtSPL和1個(gè)OfSPL(圖4，表2)。為進(jìn)一步研究桂花SPL基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對(duì)其外顯子、內(nèi)含子的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，不同組的外顯子數(shù)量存在差異，但在同一組中幾乎一致，共分為7個(gè)組G1—G7(圖5)。

2.3 OfSPL不同組織表達(dá)模式及花發(fā)育不同階段分析

從桂花7個(gè)不同組織樣本的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)中獲得24個(gè)OfSPL的FPKM值(圖6)，5個(gè)OfSPL(OfSPL1/2/6/20/27)未找到表達(dá)量。結(jié)果顯示，24個(gè)OfSPL在不同組織中的表達(dá)模式不同，其成員之間表達(dá)存在較大差異。亞群6中OfSPL10/17/19/21/28、亞群2中OfSPL9、亞群3中OfSPL7/16/25、亞群4中OfSPL18、亞群5中OfSPL8和亞群7中OfSPL27在不同組織中均有表達(dá)，其中，OfSPL9/10/17/18/19/21/27/28這8個(gè)基因在花組織中的整體表達(dá)量較高。

為了探究OfSPL在桂花花朵開(kāi)花過(guò)程中的潛在功能，對(duì)OfSPL10/21在桂花花朵不同發(fā)育階段S-1～S3進(jìn)行qPCR技術(shù)分析。結(jié)果顯示，OfSPL10/21在花朵不同發(fā)育階段均有不同程度的表達(dá)，OfSPL10/21的相對(duì)表達(dá)量隨著花朵逐漸開(kāi)放基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖7)。

表1 桂花OfSPL基因家族成員

2.4 OfSPL10/21蛋白的亞細(xì)胞定位及酵母自激活

使用WoLF PSORT在線預(yù)測(cè)OfSPL蛋白的亞細(xì)胞定位，OfSPL10/21均主要定位于細(xì)胞核上。為進(jìn)一步驗(yàn)證其編碼蛋白的亞細(xì)胞位置，在本氏煙草中進(jìn)行35S∷GFP-OfSPL10/21亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，探究OfSPL10/21基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中的潛在功能。結(jié)果顯示，35S∷GFP-OfSPL10/21融合蛋白的綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜上能夠被明顯地觀測(cè)到(圖8)，表明OfSPL10/21蛋白主要定位在細(xì)胞核中。

為了進(jìn)一步確定OfSPL10/21的轉(zhuǎn)錄激活功能，將篩選出的OfSPL10/21序列克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7中。陰性對(duì)照pGBKT7和pGBKT7-OfSPL10/21在連續(xù)稀釋的SD/-Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在SD/-Trp-Ade和SD/-Trp-ade+X-α-gal培養(yǎng)基上均不能正常生長(zhǎng)(圖9)。

左側(cè)比例尺表示染色體長(zhǎng)度圖2 桂花SPL的染色體定位The scale on the left provides the relative length of chromosomesFig.2 Chromosomal localization of SPLs in O. fragrans

表2 擬南芥SPL基因家族成員登錄號(hào)

Of. 桂花；At. 擬南芥圖4 桂花SPL基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析Of. Osmanthus fragrans； At. Arabidopsis thalianaFig.4 Phylogenetic analysis of SPL gene family in O. fragrans

圖例表示標(biāo)準(zhǔn)化的FPKM值。紅色表示高表達(dá)水平，綠色表示低表達(dá)水平圖6 桂花SPL基因家族不同組織及花期中的差異表達(dá)Legends represent the normalized FPKM values. Red means high expression level, while green means low expression levelFig.6 Differential expression of SPL family in different tissues and flowering stages of O. fragrans

圖5 桂花SPL基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of gene structure of SPL gene family in O. fragrans

不同小寫字母表示基因表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05)圖7 OfSPL10/21基因在桂花花朵不同發(fā)育階段的表達(dá)Different lowercase letters indicate significant difference in gene expression (P<0.05)Fig.7 Expression levels of OfSPL10/21 in different flower development stages of O. fragrans

3 討 論

SPL是植物特有的具有高度保守SBP結(jié)構(gòu)域的特異性家族，在花朵開(kāi)放過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。迄今為止，有關(guān)SPL基因的研究在模式植物中取得了很大進(jìn)展，但對(duì)大多數(shù)木本觀賞植物的報(bào)道較少。SPL基因家族成員可聚類為8個(gè)亞群[9-11]，在有的研究中也被分為6個(gè)亞群[27-28]。本研究通過(guò)桂花全基因組共鑒定出29個(gè)OfSPL家族成員，根據(jù)8個(gè)亞群的分類方法分到其中7個(gè)亞群中，第8亞群不含SPL基因。大部分OfSPL與AtSPL同源性極高并歸為同一亞群，且具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，該結(jié)果與桃SPL基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分布情況較吻合[15]。由此，我們推測(cè)同一亞群中桂花OfSPL和擬南芥AtSPL可能具有相似的生物學(xué)功能。

激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)的設(shè)置為：GFP.500 nm(綠色)；葉綠體.400 nm(紅色)圖8 OfSPL10/21蛋白在本氏煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位The excitation wavelength of the confocal laser microscope was set as GFP. 500 nm (green). Chloroplasts. 400 nm (red)Fig.8 Subcellular localization of OfSPL10/21 in the epidermal cells of Tobacacia benzoi

圖9 OfSPL10/21在酵母中的轉(zhuǎn)錄自激活活性分析Fig.9 Transactivation analysis of OfSPL10/21 in yeast cells

基因在植物中的表達(dá)決定其功能，基因的表達(dá)模式反映了其功能[13]。大多數(shù)OfSPL在不同的組織中表達(dá)不同，說(shuō)明OfSPL在桂花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與了多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。已有研究報(bào)道，同一亞群中大多數(shù)同源SPL基因具有相似的表達(dá)模式[29]。在桂花中，屬于第6亞群的5個(gè)基因OfSPL10/17/19/21/28幾乎在所有組織中都較高表達(dá)，其余亞群中大部分OfSPL都較低表達(dá)，這與椰子SPL基因家族成員的表達(dá)情況一致[30]。OfSPL9/10/17/18/19/21/28/27在花組織中較高表達(dá)，推測(cè)這8個(gè)基因可能參與了桂花花朵開(kāi)放的過(guò)程。其中，OfSPL10在所有組織中的表達(dá)量都極高，它可能在桂花生長(zhǎng)中起著至關(guān)重要的作用。有報(bào)道同源基因AtSPL1和AtSPL12在擬南芥花序中的高表達(dá)增強(qiáng)了花序的耐熱性[31]。在本研究中，OfSPL10/21的表達(dá)趨勢(shì)和桂花花香物質(zhì)的釋放及花色呈色的規(guī)律一致[23,32]，由此推測(cè)其可能參與調(diào)控花色與花香物質(zhì)的生物合成。

許多研究表明，具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子通常定位于細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控作用[33]，如枸杞LbSPL6基因在細(xì)胞核上調(diào)控下游基因的表達(dá)[34]。在桂花中，OfSPL10/21定位于細(xì)胞核，說(shuō)明它們可以在細(xì)胞核中發(fā)揮活性。然而，部分轉(zhuǎn)錄因子并非特異定位在細(xì)胞核上，它們可能在一定的誘導(dǎo)狀態(tài)下才能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中發(fā)揮功效，如膜定位的MfNACsa在干旱脅迫下會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[35]，或者與其他基因發(fā)生互作，其位置也會(huì)受到影響[36]。轉(zhuǎn)錄自激活分析顯示，OfSPL10/21不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，因此，我們推測(cè)它們可能與其他基因發(fā)生相互作用。

本研發(fā)現(xiàn)，OfSPL9/10/17/18/19/21/27/28可能參與了桂花花朵開(kāi)放的過(guò)程，推測(cè)OfSPL10/21可能參與調(diào)控桂花花色與花香物質(zhì)的生物合成。通過(guò)亞細(xì)胞定位和酵母自激活驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)OfSPL10/21主要定位在細(xì)胞核上，推測(cè)它們可能需要與其他基因發(fā)生互作才能發(fā)揮調(diào)控作用。本研究為進(jìn)一步探究SPL基因參與桂花花朵開(kāi)放過(guò)程中的作用機(jī)制提供了基因資源。