馮發(fā)玉，王 毅，王麗娟，羅瑪妮婭，徐令文，楊彥萍，陸 斌

（1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院 a.云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

竹葉花椒Zanthoxylum armatumDC.為蕓香科花椒屬多刺小喬木。野生竹葉花椒主要分布在喜馬拉雅山脈附近的亞熱帶和溫帶河谷地區(qū)，我國(guó)的四川、云南和重慶等西南地區(qū)已有廣泛的栽植[1]。竹葉花椒的根、莖和果實(shí)均可入藥，常用于祛風(fēng)散寒、促進(jìn)消化和行氣止痛，其果實(shí)還是重要的香料和調(diào)味品，果皮花椒油的提取率高于紅花椒，所含揮發(fā)油為殺蟲(chóng)劑和抑菌劑中的有效成分[2]。竹葉花椒具有早實(shí)豐產(chǎn)、抗病蟲(chóng)性強(qiáng)、耐干旱瘠薄、根系發(fā)達(dá)和固土保水保肥能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是退耕還林工程中生態(tài)效益好的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[3]。竹葉花椒是多刺的，其主干、枝、葉柄均密生皮刺，這可以保護(hù)竹葉花椒免受食草動(dòng)物的攻擊和機(jī)械傷害[4]，而其皮刺卻不討人喜愛(ài)，因?yàn)槠ご淘黾恿嗽耘?、管理、收獲的難度[5]，提高了種植成本。因此，培育無(wú)刺的竹葉花椒品種是其育種計(jì)劃的一個(gè)重要目標(biāo)。然而，傳統(tǒng)育種技術(shù)將無(wú)刺性狀與其他重要性狀結(jié)合起來(lái)，可能既耗時(shí)且所需費(fèi)用又昂貴[6]。因此，挖掘竹葉花椒皮刺發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因是十分重要的。

轉(zhuǎn)錄因子又稱為反式作用因子，是由基因編碼的一類調(diào)節(jié)蛋白，能夠識(shí)別和結(jié)合特異的DNA序列，借助蛋白與DNA間的相互作用能有效調(diào)控目的基因在時(shí)空中的有序表達(dá)[7]。其中，MYB是植物體中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，其位于N端的DNA結(jié)合區(qū)通常高度保守，由1～4個(gè)串聯(lián)且不完全重復(fù)的R結(jié)構(gòu)組成，且R結(jié)構(gòu)是由50～53個(gè)氨基酸組成的[8]，位于羧基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，氨基酸一般折疊成雙親性，其一級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性不強(qiáng)，功能具有一定的可塑性[9]。有關(guān)研究結(jié)果表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子在一些表皮生長(zhǎng)物（包括毛狀體和皮刺）的發(fā)育中具有重要作用[6]。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥Arabidopsis thaliana毛狀體的形成受到典型MBW轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（其中包括MYB轉(zhuǎn)錄因子）的調(diào)控；Pandey等[11]在對(duì)熱帶刺茄Solanum viarum皮刺的研究中發(fā)現(xiàn)，與其皮刺發(fā)育有關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子可能具有潛在作用；Swarnkar等[12]在對(duì)玫瑰Rosa rugosa皮刺的研究中發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹(shù)皮中表皮細(xì)胞的分化似乎是由MYB蛋白決定的，并且在其皮刺的發(fā)育過(guò)程中，參與木質(zhì)素合成的MYB123和參與次生細(xì)胞壁生物發(fā)生的MYB43其表達(dá)水平均逐漸上調(diào)，其研究結(jié)果證實(shí)了成熟期間皮刺的木質(zhì)化和硬化。

然而，到目前為止，尚未見(jiàn)有關(guān)于竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的研究報(bào)道。為了挖掘出與竹葉花椒皮刺發(fā)育有關(guān)聯(lián)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，研究其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物學(xué)功能，本研究基于已有的竹葉花椒轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)竹葉花椒中存在的MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)模式的分析，并結(jié)合已報(bào)道的其他物種中的功能性MYB轉(zhuǎn)錄因子，預(yù)測(cè)了部分竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能，篩選出可能參與皮刺發(fā)育的MYB轉(zhuǎn)錄因子，以期為進(jìn)一步揭示MYB轉(zhuǎn)錄因子家族生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為后續(xù)無(wú)刺竹葉花椒品種的基因工程培育提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取云南省林業(yè)和草原科學(xué)院樹(shù)木園中生長(zhǎng)狀況良好的5年生實(shí)生竹葉花椒為研究材料。2019年4月單株取樣，分別采集竹葉花椒的葉芽（樣品編號(hào)為Ya）、根尖（樣品編號(hào)為Gen）和皮刺剛突起（樣品編號(hào)為PC1）、皮刺開(kāi)始木質(zhì)化（樣品編號(hào)為PC2）、皮刺完全木質(zhì)化（樣品編號(hào)為PC3）等不同發(fā)育時(shí)期的皮刺及沒(méi)有油點(diǎn)的果實(shí)樣品（其編號(hào)為ZaF1）；2019年5月從相同樣株上采集剛有油點(diǎn)的果實(shí)樣品（其編號(hào)為ZaF2）。將所采樣品迅速放入液氮中冷凍，送至派森諾生物科技股份有限公司，采用第二代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing，NGS），基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)7個(gè)樣品進(jìn)行雙末端（Paired-end，PE）測(cè)序，測(cè)序讀數(shù)為PE150，獨(dú)立樣本測(cè)序深度為6 G。

1.2 竹葉花椒MYB蛋白序列的獲取

采用第二代測(cè)序技術(shù)獲得竹葉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并從中篩選出含有MYB轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)據(jù)，利用在線預(yù)測(cè)軟件ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）搜索獲取具有全長(zhǎng)氨基酸序列的竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子序列。利用本地在線軟件Blast比對(duì)分析MYB蛋白結(jié)構(gòu)域，并剔除無(wú)MYB結(jié)構(gòu)域的蛋白序列[13]，利用SMART在線軟件篩選并確認(rèn)竹葉花椒MYB蛋白序列是否包含SANT保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 竹葉花椒MYB蛋白特征分析

利用ExPASy protparam tool在線程序分析竹葉花椒MYB蛋白的理化性質(zhì)，利用ProtScale在線程序分析蛋白的親水性與疏水性，采用signaIP-5.0和PSORT Prediction在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽及亞細(xì)胞的定位，采用Prabi在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[13]。利用MEME在線軟件對(duì)39個(gè)竹葉花椒MYB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，具體參數(shù)設(shè)置如下：基序位點(diǎn)分布情況，選擇重復(fù)次數(shù)不限制；保守性基序的數(shù)目限制選擇7，其他參數(shù)不變，均采用默認(rèn)值[14]。

1.4 竹葉花椒MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

以下載于Plant TFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)的擬南芥MYB蛋白為參考序列，利用MEGA7軟件構(gòu)建竹葉花椒與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；將以不同組織間表達(dá)差異顯著的8個(gè)竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列與其他10個(gè)功能已被驗(yàn)證的植物MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰位連接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，選用模型為Jones-Taylor-Thornton，執(zhí)行方式設(shè)為Bootstrap method，自檢重復(fù)次數(shù)設(shè)定為1 000次。

1.5 竹葉花椒MYB基因表達(dá)分析

以竹葉花椒的芽（Ya）、根尖（Gen）、不同發(fā)育時(shí)期的皮刺（PC1、PC2、PC3）和果實(shí)（ZaF1、ZaF2）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，獲得竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用基因云在線軟件上傳基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，依據(jù)其FPKM值，在線繪制竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)交互熱圖。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果及MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式，設(shè)以特異引物TZaMYB10（F-5′GAATGTTCTCACAACATGAA3′、R-5′ATTAATAGTACTATTACTA3′）與TZaMYB26（F-5′GAGTTGCAGATTGCGATGGA3′、R-5′CCACGTCAGCAATCACAGGC3′） 和Ubiquitins（F-5′ CATGAAAGTCGAATATATCA3′、R-5′ ATGATTAACACTAGT3′）為內(nèi)參基因。定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR的綠色主混合物12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板（cDNA）1 μL，ddH2O 10.5 μL，每個(gè)樣本進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。使用PCR熱循環(huán)儀（ABI 7300，應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster City，CA，USA）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)分析，PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性30 s，58 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸2 min（共35個(gè)循環(huán)）；72 ℃下終延伸7 min，4 ℃下保存。擴(kuò)增完成后從65 ℃到95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析，驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性[15]。

1.7 ZaMYB10基因的克隆

以ZaMYB10基因序列為依據(jù)，通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)PCR特異擴(kuò)增引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成?？寺∫餅閆aMYB10F（5′-ATGGGACGCCATTCTTCTTG-3′）和ZaMYB10R（5′-CATAAGTGGTGGAAGA-3′）。以竹葉花椒皮刺的cDNA為模板，分別以ZaMYB10F和ZaMYB10R為引物，以HiFiDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，得到ZaMYB10全基因片段。經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)后，將目的片段連接到pUMT載體上，經(jīng)PCR檢測(cè)后送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZaMYB蛋白的基本信息及理化性質(zhì)分析

從竹葉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出39條MYB轉(zhuǎn)錄因子序列，其所含氨基酸數(shù)量為101～621 aa，平均氨基酸數(shù)為288 aa。利用ExPASy protparam tool在線軟件分析竹葉花椒MYB蛋白的基本性質(zhì)，分析結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，在39個(gè)ZaMYB蛋白中，理論等電點(diǎn)（PI）的最大值為10.70，最小值為4.71，其均值為7.44，這一預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明，竹葉花椒的MYB蛋白偏堿性；除ZaMYB6蛋白的親水性的評(píng)分為正值外，其余38個(gè)ZaMYB蛋白的親水性的評(píng)分均為負(fù)值，這一分析結(jié)果表明，ZaMYB蛋白是可溶性蛋白。39個(gè)MYB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，除了ZaMYB21、ZaMYB24和ZaMYB35蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主，其余36個(gè)ZaMYB蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲的占比最高；總體而言，ZaMYB蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為其主要結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角及延伸鏈均為其次要結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)有利于ZaMYB蛋白穩(wěn)定性的維持。信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明，竹葉花椒MYB蛋白不存在信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，39個(gè)ZaMYB蛋白位于細(xì)胞核的可能性最大，這一預(yù)測(cè)結(jié)果符合轉(zhuǎn)錄因子的分布特點(diǎn)。

2.2 竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)的鑒定與分析

利用SMART在線程序?qū)χ袢~花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 ZaMYB蛋白家族結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 ZaMYB protein family domain prediction result

圖1顯示，39個(gè)竹葉花椒MYB蛋白具有共同的保守結(jié)構(gòu)域，28個(gè)ZaMYB蛋白包含2個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，其占比最高，這和大多數(shù)植物MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果相同，9個(gè)蛋白只包含1個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，其中ZaMYB4和ZaMYB28除了具有1個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域外，均包含1個(gè)ZnF_C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，據(jù)此推測(cè)，其具有MYB轉(zhuǎn)錄因子功能之外的其他功能。利用MEME在線軟件對(duì)竹葉花椒MYB家族蛋白系列進(jìn)行分析，結(jié)果得到了如圖2所示的7個(gè)保守元件，并命名其為基序1～7，此基序包含11～50個(gè)氨基酸，每個(gè)ZaMYB蛋白的基序數(shù)量為1～5個(gè)。在37個(gè)ZaMYB蛋白中發(fā)現(xiàn)了motif3，其為最常見(jiàn)的基序，其次分別是motif1和motif3，分別在32和30個(gè)ZaMYB蛋白中被發(fā)現(xiàn)。

圖2 竹葉花椒MYB基因家族的保守元件和基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Conserved elements and gene structure of Z.armatum MYB gene family

2.3 竹葉花椒與擬南芥MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

擬南芥作為模式植物，有關(guān)其MYB轉(zhuǎn)錄因子基因功能的研究較為透徹，因此，結(jié)合擬南芥MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，不僅有助于理解ZaMYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，還可以推測(cè)ZaMYB蛋白的功能。本研究利用MEGA7軟件構(gòu)建竹葉花椒和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖3所示。圖3表明，竹葉花椒的ZaMYB36蛋白與擬南芥的AtMYB3R-1、AtMYB3R-2、AtMYB3R-3和AtMYB3R-4蛋白聚在同一分支中，均為R3類型；竹葉花椒的ZaMYB38蛋白可劃分為R4類型，因?yàn)槠渑c擬南芥的R4類蛋白聚在同一分支中。這一分析結(jié)果與SMART的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致。整體而言，竹葉花椒和擬南芥的MYB蛋白主要聚為4個(gè)大分支：分支Ⅰ，包含16個(gè)R2R3-ZaMYB類蛋白和2個(gè)R1-ZaMYB蛋白；分支Ⅱ，包含4個(gè)R2R3-ZaMYB類蛋白和3個(gè)R1-ZaMYB蛋白；分支Ⅲ，包含8個(gè)R1-ZaMYB蛋白和1個(gè)R3-MYB蛋白；分支Ⅳ，包含4個(gè)無(wú)法與擬南芥MYB家族聚類的R3-MYB蛋白和1個(gè)R4-MYB蛋白，值得注意的是，在這4個(gè)無(wú)法聚類的蛋白中，ZaMYB4和ZaMYB28蛋白中均含鋅指結(jié)構(gòu)，而ZaMYB6蛋白具有未知結(jié)構(gòu)域。依據(jù)擬南芥R1-MYB和R2-MYB蛋白的劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將ZaMYB蛋白進(jìn)一步劃分為23個(gè)亞組，其中，部分?jǐn)M南芥亞組不包含ZaMYB轉(zhuǎn)錄因子。

圖3 竹葉花椒和擬南芥MYB類蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果Fig.3 Phylogenetic analysis of MYB protein in Z.armatum and Arabidopsis thaliana

在擬南芥的蛋白中，S4和S7亞組成員主要參與黃酮類化合物和花青素的合成，因此推測(cè)，與其聚在一個(gè)分支的ZaMYB7、ZaMYB24、ZaMYB26和ZaMYB29蛋白可能都具有相似的功能[17]。根據(jù)竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出表達(dá)差異顯著的8個(gè)ZaMYB轉(zhuǎn)錄因子，由這8個(gè)ZaMYB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥、甜橙Citrus sinensis和枇杷Eriobotrya japonica的功能已被驗(yàn)證的10個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子共同構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4所示。由圖4可知，竹葉花椒的ZaMYB10轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥的AtMYB85轉(zhuǎn)錄因子和甜橙的CsMYB85轉(zhuǎn)錄因子均聚在一個(gè)分支中；竹葉花椒的ZaMYB25轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥的AtMYB103轉(zhuǎn)錄因子聚在一個(gè)分支中，其bootstrap值為100。因此推測(cè)，竹葉花椒的ZaMYB10轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥的AtMYB85、甜橙的CsMYB85轉(zhuǎn)錄因子可能都有類似的功能，竹葉花椒的ZaMYB25轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥的AtMYB103轉(zhuǎn)錄因子可能具有類似的功能。

圖4 部分竹葉花椒MYB蛋白和參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)蛋白的進(jìn)化關(guān)系Fig.4 Evolutionary relationship between MYB protein and proteins involved in plant growth and development of Z.armatum

2.4 竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)量分析

通過(guò)基因云在線軟件上傳竹葉花椒根、芽、皮刺和果的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，依據(jù)其FPKM值，在線繪制如圖5所示的竹葉花椒MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)交互熱圖。根據(jù)差異表達(dá)模式，將這些基因聚集成如下3個(gè)分支：分支Ⅰ，包含14個(gè)基因，除了ZaMYB5和ZaMYB33基因在果實(shí)中的表達(dá)量較高之外，其余12個(gè)基因在皮刺中的表達(dá)量均較高，其中的ZaMYB10和ZaMYB25基因在皮刺中均有特異表達(dá)；分支Ⅱ，包含11個(gè)基因，主要在根中表達(dá)；分支Ⅲ，包含14個(gè)基因，主要在芽和果實(shí)中有較高的表達(dá)量。值得注意的是，竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子在皮刺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量逐漸升高，從圖5中可以看出，其在皮刺發(fā)育起始時(shí)期（PC1）的表達(dá)量相對(duì)較低，而在皮刺發(fā)育木質(zhì)化（PC3）時(shí)期的表達(dá)量較高，從皮刺剛突起到皮刺發(fā)育成熟階段（從PC1到PC3），MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量總體呈現(xiàn)出逐漸增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，特別是ZaMYB10、ZaMYB23和ZaMYB25基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出明顯的遞增趨勢(shì)，因此推測(cè)，這3個(gè)基因參與了對(duì)皮刺生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

圖5 竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)情況Fig.5 Interactive heat map of gene expression of Z.armatum MYB transcription factor

2.5 竹葉花椒MYB基因的qRT-PCR分析

經(jīng)特異引物檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄得到竹葉花椒cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析ZaMYB10和ZaMYB26基因在竹葉花椒的根、芽、皮刺、果實(shí)等組織中的具體表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看出，ZaMYB26基因在發(fā)育早期的皮刺（PC1）和無(wú)油點(diǎn)果實(shí)（ZaF1）中的表達(dá)量均相對(duì)較高，ZaMYB10基因在皮刺中的表達(dá)特異，且其在發(fā)育早期（PC1）到成熟時(shí)期（PC3）的皮刺中的表達(dá)量呈現(xiàn)出逐漸增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，這一分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析結(jié)果一致。

圖6 ZaMYB10和ZaMYB26基因在竹葉花椒不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Expression of ZaMYB10 and ZaMYB26 genes in different tissues of Z.armatum

2.6 ZaMYB10基因的克隆

以ZaMYB10F和ZaMYB10R為特異引物，通過(guò)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖7所示。從圖7中可以看出，EB顯色后，在約為1 030 bp處有1條清晰的亮帶，其與目的基因片段大小相符。切膠回收，將回收產(chǎn)物與pUMT載體連接，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后得到的片段大小與PCR產(chǎn)物大小相吻合，利用NCBI ORF Finder軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ZaMYB10基因具有全長(zhǎng)為1 032 bp的完整的cDNA開(kāi)放閱讀框（ORF），其編碼343個(gè)氨基酸。

圖7 竹葉花椒ZaMYB10基因的克隆Fig.7 Cloning of ZaMYB10 Gene from Z.armatum

3 討 論

在真核細(xì)胞中，基因表達(dá)調(diào)控是重要的生命活動(dòng)，其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要是在一個(gè)復(fù)雜的由轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的相互作用系統(tǒng)中進(jìn)行的。MYB轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于植物中，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程具有重要的調(diào)控作用[17]。隨著相關(guān)研究的不斷深入，MYB轉(zhuǎn)錄因子已在多個(gè)物種中被挖掘與鑒定，Hou等[18]在柑橘Citrus reticulata中發(fā)現(xiàn)了177個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子；Dubos等[19]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了198個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子；丁蒙蒙等[20]在楠木Phoebe zhennan中鑒定得到了82個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子。本研究基于竹葉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共挖掘出了39個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中包括9個(gè)R1-MYB、28個(gè)R2R3-MYB、1個(gè)R3-MYB和1個(gè)R4-MYB基因。對(duì)其理化性質(zhì)的分析結(jié)果表明，不同的MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白其理化性質(zhì)存在差異，說(shuō)明竹葉花椒不同的MYB轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮的生物學(xué)作用也不相同[21]。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，39個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核的可能性最大，這一預(yù)測(cè)結(jié)果符合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因表達(dá)的特性[22]。

竹葉花椒主干和枝條均密生皮刺，對(duì)果實(shí)采摘造成了一定的困難，故采摘果實(shí)常需大量的勞動(dòng)力，費(fèi)工費(fèi)時(shí)[5]。目前，關(guān)于竹葉花椒皮刺的研究相對(duì)薄弱，因此，通過(guò)分析3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的皮刺中MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，以挖掘出可能參與皮刺生長(zhǎng)發(fā)育的MYB轉(zhuǎn)錄因子。有關(guān)研究結(jié)果表明，在植物不同發(fā)育時(shí)期的同一組織中，基因表達(dá)存在差異的MYB轉(zhuǎn)錄因子在其發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。Jia等[23]在對(duì)甜橙的研究中發(fā)現(xiàn)，CsMYB308和CsMYB330基因的表達(dá)水平在甜橙果汁囊的木質(zhì)化過(guò)程中發(fā)生了顯著變化，他們通過(guò)瞬時(shí)分析和過(guò)量表達(dá)分析證明了這兩個(gè)基因在甜橙果汁囊的木質(zhì)化中均起著重要作用；李志根等[24]在分析MaMYB2基因在不同組織中的表達(dá)模式后發(fā)現(xiàn)，MaMYB2基因可能參與了葡萄風(fēng)信子Muscari botryoides花青素積累的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究中發(fā)現(xiàn)，ZaMYB10、ZaMYB23和ZaMYB25基因的表達(dá)量從早期皮刺（PC1）到成熟皮刺（PC3）逐漸增長(zhǎng)，據(jù)此推測(cè)，這3個(gè)基因可能參與了皮刺生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

Asano等[25]在對(duì)玫瑰皮刺形態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素的積累從皮刺頂部開(kāi)始，向下擴(kuò)散到皮刺的整個(gè)部分中，這表明皮刺的硬化與木質(zhì)素的積累密切相關(guān)。竹葉花椒的皮刺和玫瑰的皮刺具有相同的發(fā)育史，其皮刺形態(tài)均經(jīng)歷了從小到大和從軟到硬的變化過(guò)程。最近有關(guān)研究者[12]發(fā)現(xiàn)，玫瑰皮刺的發(fā)生和毛狀體的形成類似，受到典型MBW轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的調(diào)控，其中皮刺的形成似乎是由MYB蛋白決定的，玫瑰皮刺在其形成過(guò)程中積累了大量的次生代謝產(chǎn)物，尤其是木質(zhì)素和類黃酮物質(zhì)，一些與木質(zhì)素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，在皮刺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，這一結(jié)果表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在皮刺的發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。在對(duì)竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析中發(fā)現(xiàn)，竹葉花椒的ZaMYB10基因與擬南芥的AtMYB85基因和甜橙的CsMYB85基因均聚在一個(gè)分支中，表明竹葉花椒的ZaMYB10與擬南芥的AtMYB85和甜橙的CsMYB85的親緣關(guān)系均較近，其ZaMYB25和擬南芥的AtMYB103也聚在一個(gè)分支中，其bootstrap值為100，且擬南芥的AtMYB85[26]、AtMYB103[27]基因和甜橙的CsMYB85[28]基因均參與了木質(zhì)素的生物合成。結(jié)合基因表達(dá)分析結(jié)果推測(cè)，ZaMYB10和ZaMYB25基因在皮刺發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。

為了驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，ZaMYB10基因在皮刺中的特異表達(dá)情況和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，由此推測(cè)，ZaMYB10基因可能參與了竹葉花椒皮刺中木質(zhì)素的生物合成，與皮刺的硬化具有密切的關(guān)系。除此之外，對(duì)ZaMYB10基因的克隆結(jié)果表明，ZaMYB10基因具有全長(zhǎng)為1 032 bp的完整的cDNA開(kāi)放閱讀框（ORF），其編碼343個(gè)氨基酸，這進(jìn)一步證實(shí)了該基因的真實(shí)性。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步探討竹葉花椒MYB轉(zhuǎn)錄因子參與皮刺生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為無(wú)刺或少刺的竹葉花椒的基因工程培育提供了候選基因。然而，本研究對(duì)ZaMYB10基因的功能未加驗(yàn)證，后續(xù)將通過(guò)異源表達(dá)和基因敲除等驗(yàn)證其功能。

4 結(jié) 論

從竹葉花椒中共鑒定出39條MYB轉(zhuǎn)錄因子序列，其均包含SANT保守結(jié)構(gòu)域，其中包括9個(gè)R1-MYB型基因、28個(gè)R2R3-MYB型基因、1個(gè)R3型基因和1個(gè)R4型基因。分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和基因表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，ZaMYB10和ZaMYB25基因可能與其皮刺的發(fā)育有關(guān)系，且實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果也表明，ZaMYB10基因在皮刺中有特異表達(dá)，其表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致；此外，本研究成功克隆了ZaMYB10基因。這些證據(jù)證明，ZaMYB10基因真實(shí)存在并且可能在皮刺發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。