高 文，花 蕊，郁萬文

（南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

銀杏葉中類黃酮有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎癥、增強機體免疫等作用[1]，具有重要的藥用價值[2]。研究銀杏葉中黃酮積累的影響因素，對葉用銀杏的選育和栽培管理有重要的指導意義。植物體內(nèi)黃酮類化合物合成代謝的起初源為光合產(chǎn)物[3]，有效光合作用有利于銀杏葉片中黃酮的積累[4]。氮素是植物需求量最大的礦質(zhì)元素，植物根系吸收的無機態(tài)氮素有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，其中硝態(tài)氮是植物利用的主要氮素形態(tài)，在水淹地或還原性較強的土壤中，銨態(tài)氮是主要氮素形態(tài)[5-6]。氮素的吸收積累會影響植物的生長發(fā)育[7]，直接或間接影響植物體內(nèi)的光合作用[8]，進而影響黃酮的合成積累。低氮促進了類黃酮物質(zhì)的積累，高氮則抑制類黃酮物質(zhì)的合成，但在不同植物中不同類黃酮物質(zhì)的變化并不相同[9]。前人研究結(jié)果表明，在銀杏葉片生長后期施用氮肥將降低葉黃酮含量[10]，但有關(guān)該時期增施不同形態(tài)氮肥對葉黃酮含量影響的研究鮮見報道。本研究中通過分析銀杏葉生長、生理指標對不同外施銨態(tài)氮水平的響應，以及不同外施銨態(tài)氮水平處理下葉黃酮含量的變化，研究外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉生長、生理及葉品質(zhì)的影響及其生理機制，以期闡明銨態(tài)氮通過影響光合作用進而影響葉黃酮積累的生理過程，為葉用銀杏的氮肥管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年在南京林業(yè)大學白馬基地（119°19′E，31°61′N）進行試驗。以未經(jīng)施肥處理的2年生半同胞家系銀杏幼苗為試材。試驗用聚乙烯塑料盆上口徑30 cm，下口徑25 cm，高27 cm，底部帶孔，盆下配有托盤防止養(yǎng)分流失。栽培基質(zhì)為黃壤土，土壤理化性質(zhì)為全氮含量5.454 g/kg，全磷含量0.952 g/kg，全鉀含量10.865 g/kg，銨態(tài)氮含量3.002 mg/kg，硝態(tài)氮含量6.129 mg/kg，pH 6.45。

1月選擇長勢均一、無病蟲害銀杏苗移栽于塑料盆中，每盆裝10 kg黃壤土。銀杏苗栽植后，置于通風良好的遮雨棚內(nèi)進行緩苗，常規(guī)管理4個月左右，5月中旬轉(zhuǎn)移到溫室大棚內(nèi)，適應1周后進行施肥試驗。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機區(qū)組設計。結(jié)合銀杏生長中的實際需氮特點，配制的氮肥設置4個銨態(tài)氮水平，每盆的總氮量分別為0 g（CK）、1 g（NH1）、2 g（NH2）、4 g（NH4），銨態(tài)氮（NH4+-N）均由分析純(NH4)2SO4提供，其他元素含量均相同。每個處理重復4次，每重復15株。除氮素形態(tài)配比處理外，所有盆栽苗隨機擺放，互不遮擋。2020年5月25日傍晚，采取一次性施肥處理，將各處理每盆所需要肥料使用分析天平稱量并溶解于300 mL蒸餾水中，依次澆入盆土中。整個試驗過程中進行定期定量澆水及除草常規(guī)管理等。

陳再興等[11]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉片總黃酮含量、總黃酮醇苷含量、萜類內(nèi)酯含量分別在8、5、6月最高，葉片最佳采收期應在5—8月。丁銀花等[12]也認為6—8月采收銀杏葉較為合適。因此，本試驗中于8月25日9:00—10:00，隨機采集幼苗中部功能葉片，對銀杏葉片生長、生理和品質(zhì)指標進行測定和評價。

1.3 指標測定

1.3.1 葉性狀指標

每個重復隨機取5株，按照上、中、下部位，各選取3片葉測定單葉干質(zhì)量和單葉面積，計算比葉干質(zhì)量（單葉干質(zhì)量和單葉面積的比值）。

1.3.2 葉生理指標

采用無水乙醇提取法提取葉綠素[13]，測定提取液在470、474、485、645 nm波長下的吸光值，計算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素的含量[14]。硝酸還原酶（NR）活性采用雙抗體夾心法測定。硝態(tài)氮（NO3－-N）、銨態(tài)氮含量采用紫外分光法測定[15]。N含量采用凱式定氮法測定，P含量采用鉬銻抗比色法測定，K含量采用火焰光度法測定[16]。

1.3.3 葉黃酮含量

參照文獻[17]中的方法并略有改動，對銀杏葉片黃酮醇苷類成分（槲皮素、山奈酚和異鼠李素[18]）的含量進行測定。以C18柱為色譜柱，以甲醇與0.4%磷酸的混合溶液（體積比50∶65）為流動相；檢測波長360 nm，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定槲皮素含量（C槲皮素）、山奈酚含量（C山奈酚）和異鼠李素含量（C異鼠李素），按下式換算成總黃酮含量（C總黃酮）：

C總黃酮=(C槲皮素+C山奈酚+C異鼠李素)×2.51。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016、SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較，采用Spearman方法進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉各生長指標的影響

外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉片各生長指標的影響如圖1所示。由圖1可見，外施銨態(tài)氮水平對銀杏單葉干質(zhì)量、單葉面積和比葉面積有顯著影響（P＜0.05），單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量均隨外施銨態(tài)氮水平的上升呈單峰趨勢，NH2處理時達到最高值，較CK分別顯著提高了36.38%、27.94%、6.52%。這表明適宜的外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉片的生長有促進作用。

圖1 不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉片各生長指標Fig.1 Growth indexes of G.biloba leaves under different levels of ammonium nitrogen

2.2 外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉各生理指標的影響

2.2.1 對光合色素含量的影響

葉綠素是葉片進行光合作用的主要物質(zhì)基礎，其含量可作為反映植物光合作用能力的重要指標[19]，葉綠素含量下降表明葉片開始衰老[20]。8月，不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉片光合色素含量如圖2所示。由圖2可見，外施銨態(tài)氮水平顯著影響銀杏葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素的含量（P＜0.05），隨外施銨態(tài)氮水平的升高均呈單峰趨勢，在NH2處理時達到峰值，并與其他處理有顯著差異，但其他處理間無顯著差異。這表明適宜的外施銨態(tài)氮水平能顯著提高銀杏葉片的光合色素含量，延緩葉片衰老。

圖2 不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉片光合色素含量Fig.2 Photosynthetic pigment content of G.biloba leaves under different ammonium nitrogen levels

2.2.2 對硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及硝酸還原酶活性的影響

硝態(tài)氮在硝酸還原酶、亞硝酸還原酶（NIR）作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮，銨態(tài)氮再循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀恢参镏苯永玫挠袡C態(tài)氮[21]。8月，不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉片硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及硝酸還原酶活性如圖3所示。由圖3可見，外施銨態(tài)氮水平顯著影響了銀杏葉片的硝酸還原酶活性（P＜0.05）。CK處理下，銀杏葉片硝酸還原酶活性顯著高于其他處理，且隨著外施銨態(tài)氮水平的升高，硝酸還原酶活性下降。不同處理下，銀杏葉片銨態(tài)氮含量和硝態(tài)氮含量的差異顯著（P＜0.05），且隨外施銨態(tài)氮水平的升高，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量均顯著升高，NH4處理較CK處理顯著增長了166.10%、24.67%。CK處理下，葉片硝態(tài)氮含量高于銨態(tài)氮含量，其余處理下，葉片硝態(tài)氮含量低于銨態(tài)氮。

圖3 不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉片硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及硝酸還原酶活性Fig.3 Nitrate nitrogen, ammonium nitrogen content and nitrate reductase activity of G.biloba leaves under different external ammonium nitrogen levels

可見，施用銨態(tài)氮提高了銀杏葉片銨態(tài)氮的含量，使銨態(tài)氮含量與硝態(tài)氮含量的比例增高，但施用銨態(tài)氮使硝酸還原酶活性降低，引起硝態(tài)氮的還原性減弱[22]，因而硝態(tài)氮含量升高。

2.2.3 對氮磷鉀含量的影響

不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉片氮磷鉀含量如圖4所示。由圖4可見，外施銨態(tài)氮水平顯著影響了銀杏葉片氮、磷的積累量（P＜0.05），對鉀的積累量影響不顯著（P＞0.05）。隨外施銨態(tài)氮水平的升高，銀杏葉片氮含量顯著升高，NH4處理中葉片氮含量較CK處理顯著提高了25.09%；NH2處理下，銀杏葉片磷含量最高，顯著高于其他處理；銀杏葉片鉀含量呈單峰趨勢，NH2處理時達到峰值。可見，施入銨態(tài)氮顯著促進了銀杏葉中氮、磷的積累，同樣促進了鉀的積累，但影響不顯著。

圖4 不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉片氮磷鉀含量Fig.4 Contents of NPK in G.biloba leaves under different levels of ammonium nitrogen

2.3 外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉黃酮含量的影響

8月，不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉黃酮含量如圖5所示。由圖5可見，外施銨態(tài)氮水平顯著影響銀杏葉片的黃酮醇苷類成分和總黃酮含量（P＜0.05），槲皮素、山奈酚含量均隨外施銨態(tài)氮水平呈逐漸上升的趨勢，且均在NH4處理達到峰值。異鼠李素含量隨外施銨態(tài)氮水平升高呈先上升、再下降的趨勢，在NH2處理時最高，較CK處理增加10.20%。銀杏葉片的總黃酮含量隨外施銨態(tài)氮水平升高呈先下降、再上升的趨勢，在NH4處理時最高，較CK處理增加28.54%。

圖5 不同外施銨態(tài)氮水平處理下銀杏葉黃酮含量Fig.5 Flavonoid content of G.biloba leaves under different ammonium nitrogen levels

可見，8月，施入適宜水平的銨態(tài)氮能顯著提高銀杏葉片的黃酮醇苷類成分和總黃酮的含量，施入過高或過低水平的銨態(tài)氮均會使異鼠李素含量顯著降低。

2.4 銀杏葉片黃酮含量與其生長及生理指標的相關(guān)性

對銀杏葉片黃酮含量指標（槲皮素含量、山奈酚含量、異鼠李素含量、總黃酮含量）與其生長及生理指標（單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、總?cè)~綠素含量、硝酸還原酶活性、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量、N含量、P含量、K含量）的相關(guān)性進行分析，結(jié)果見表1。

由表1可知，黃酮醇苷類成分及總黃酮的含量與單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量、K含量及總?cè)~綠素含量均無顯著相關(guān)性，槲皮素含量與葉綠素a、類胡蘿卜素含量呈顯著或極顯著負相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；山奈酚含量與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、N含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。異鼠李素含量與葉綠素b含量、硝酸還原酶活性、P含量呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；總黃酮含量與類胡蘿卜素含量呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表1 銀杏葉片黃酮含量與其生長及生理指標的相關(guān)系數(shù)?Table 1 Correlation coefficient between flavonoids content in G.biloba leaves and their growth and physiological indexes

由此說明，除單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量、K含量、總?cè)~綠素含量外，其他生理指標均與總黃酮及黃酮醇苷類成分含量存在相關(guān)關(guān)系。

2.5 外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉生長、生理和品質(zhì)影響的綜合評價

因各指標在不同處理間的變化趨勢不一致，為了更好地評價外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉生長、生理和品質(zhì)的影響，篩選出適用于葉用銀杏栽培的外施銨態(tài)氮水平，將測定的17個指標進行主成分分析，結(jié)果見表2。由表2可知，第1主成分的特征值為8.641，方差貢獻率為50.828%；第2主成分的特征值為6.536，方差貢獻率為38.446%；第3主成分的特征值為1.824，方差貢獻率為10.727%。前3個主成分的累計貢獻率達到100%（＞85%），表明前3個主成分代表了17個指標100%的綜合信息，因此，前3個主成分可以較好反映所測定17個指標的相對重要性和各指標間的關(guān)系。

表2 外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉生長、生理和品質(zhì)影響的主成分荷載矩陣及方差貢獻率Table 2 Principal component load matrix and variance contribution rate of the effects of external ammonium nitrogen levels on the growth,physiology and quality of G.biloba leaves

以X1、X2、X3……X17分別代表單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、總?cè)~綠素含量、硝酸還原酶活性、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、氮含量、磷含量、鉀含量、槲皮素含量、山奈酚含量、異鼠李素含量、總黃酮含量等指標原始數(shù)據(jù)的標準化值，以F1、F2、F3分別代表第1、2、3主成分的得分，根據(jù)特征向量矩陣得到各主成分得分的線性方程：

F1=0.936X1+0.907X2+0.922X3+0.980X4+0.977X5+0.928X6+0.979X7-0.422X8+0.237X9+0.298X10+0.315X11+0.798X12+0.994X13-0.266X14-0.117X15+0.444X16-0.165X17；

F2=0.269X1+0.377X2-0.077X3-0.189X4-0.212X5-0.229X6-0.194X7-0.806X8+0.970X9+0.942X10+0.946X11-0.302X12+0.065X13+0.828X14+0.981X15-0.495X16+0.885X17；

F3=-0.225X1-0.188X2-0.378X3+0.069X4+0.031X5+0.295X6+0.060X7+0.415X8+0.050X9+0.154X10-0.075X11+0.521X12-0.085X13+0.494X14+0.154X15+0.747X16+0.436X17。

根據(jù)上述線性方程分別計算各主成分的得分，以每個主成分的貢獻率作為權(quán)重，計算各處理的綜合得分。3個主成分的權(quán)重值分別為50.828%、38.446%、10.727%，綜合得分計算公式為F=50.828%F1+38.446%F2+10.727%F3。外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉生長、生理和品質(zhì)影響的綜合評價結(jié)果見表3。由表3可知，各外施銨態(tài)氮水平處理對銀杏葉生長、生理、品質(zhì)影響的綜合得分由大到小依次為NH2、NH4、NH1、CK，說明外施銨態(tài)氮水平能有效調(diào)控銀杏葉片的生長、生理和品質(zhì)，外施銨態(tài)氮水平為2 g/盆時銀杏葉的綜合表現(xiàn)更佳。

表3外施銨態(tài)氮水平對銀杏葉生長、生理和品質(zhì)影響的綜合評價結(jié)果?Table 3 Comprehensive evaluation of effects of ammonium nitrogen level on growth, physiology and quality of G.biloba leaves

3 結(jié)論與討論

氮元素是木本植物生長發(fā)育所需的大量元素之一，氮的供給水平影響了木本植物生長發(fā)育的許多生理過程。吳家勝等[23]的研究結(jié)果表明，氮的增施對銀杏葉產(chǎn)量、單葉面積及單葉質(zhì)量等均有良好的促進作用，每株3 g為最佳施氮量。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮均可為植物的生長發(fā)育提供充足的氮源[24]。本研究結(jié)果表明，施加適宜水平的銨態(tài)氮可顯著提高銀杏單葉面積、單葉干質(zhì)量和比葉干質(zhì)量，促進銀杏葉片生長，且各生長指標均在每盆施氮量為2 g時達到最高值。

光合作用是植物重要的生理過程，是植物生長發(fā)育的基礎。前人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，氮素可以通過影響傳導CO2的能力調(diào)控光合速率[25]，施氮可降低光合底物傳輸過程中的非氣孔限制，提高葉片的光合能力，延長高光合持續(xù)期[26]。氮素還可以通過影響植物葉片含氮量直接影響植物的光合作用[27]。氮素是葉綠素的主要構(gòu)成元素，施加氮素可以促進葉綠素的合成[28]。本研究結(jié)果表明，施入適宜水平的銨態(tài)氮能提高銀杏葉的光合色素含量，延緩葉片衰老，最佳外施銨態(tài)氮水平為每盆2 g，過多則會抑制光合色素的合成代謝。葉綠素含量可作為反映植物光合作用能力的重要指標[19]，施入適宜水平的銨態(tài)氮可提高銀杏葉片的光合能力，這與吳楚等[29]的研究結(jié)果一致。銨態(tài)氮能抑制植物對硝態(tài)氮的吸收[29]，降低硝酸還原酶活性[30]。本研究結(jié)果表明，施加適量銨態(tài)氮能提高植物體內(nèi)銨態(tài)氮水平，降低硝酸還原酶活性，使硝態(tài)氮的還原性減弱，導致硝態(tài)氮含量上升，進而增加植物體內(nèi)氮含量。提高葉片氮含量能夠提高植物葉片的光合效能[28]，同樣驗證了施入適宜水平的銨態(tài)氮提高了銀杏葉片的光合效能。施入適量的銨態(tài)氮同樣促進了銀杏葉片磷、鉀的積累，但對鉀含量的影響不顯著。葉片中氮、磷、鉀、鐵、鎂等營養(yǎng)元素會對光合生理過程產(chǎn)生直接影響[31]。

氮肥是影響植物黃酮類物質(zhì)含量的重要因素。Larbat等[32]的研究結(jié)果表明，低氮脅迫增加了番茄根、莖、葉中黃酮的含量；Strissel等[33]的研究結(jié)果表明，大量施氮降低了蘋果葉片中類黃酮物質(zhì)的含量。低氮促進植物黃酮類物質(zhì)積累，高氮抑制黃酮類物質(zhì)合成，但在不同的植物中具體變化不相同[8]。在對銀杏的研究中，吳家勝等[23]的研究結(jié)果表明，適宜的施氮量可以提高銀杏苗木葉片的黃酮總量，缺氮或施氮過量均不利于葉片黃酮的積累，1.5 g/株施氮量的處理中葉片各黃酮類物質(zhì)含量和黃酮總量最大。本研究結(jié)果表明，在銀杏生長高峰期（5月下旬）施加適當水平的銨態(tài)氮能顯著提高銀杏葉片黃酮類物質(zhì)的含量，這與前人的研究結(jié)果基本一致[34]。

植物的各種生理過程對其次生代謝產(chǎn)生影響[35-36]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，總黃酮或黃酮醇苷類成分含量與葉綠素b含量、硝酸還原酶活性、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量、氮含量、磷含量呈顯著正相關(guān)，說明隨著外施銨態(tài)氮水平的上升，銀杏葉片的葉綠素含量和營養(yǎng)元素氮、磷的積累增加，從而進一步提升銀杏葉黃酮的含量。采用主成分分析法提取3個主成分，進行綜合排名，結(jié)果表明每盆施入總氮量2 g處理的綜合得分最高，該處理能有效促進銀杏葉片的生長，提高銀杏葉片的銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、氮磷鉀含量、硝酸還原酶活性等生理指標，并且顯著提高黃酮類物質(zhì)含量。所以，在葉用銀杏的栽培管理中，適宜的銨態(tài)氮施肥水平為2 g/盆。

本研究中重點關(guān)注了銀杏苗葉片對外施銨態(tài)氮的生理響應，得出有利于銀杏生長發(fā)育及黃酮積累的適宜外施銨態(tài)氮水平。但當銨態(tài)氮為單一氮源時，植物需消耗大量能量進行氮素轉(zhuǎn)化，而硝態(tài)氮與之相反，可以減少能量消耗。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮共同配合的情況下，植物的生長發(fā)育更好[25]。因而還應繼續(xù)探究適宜的外施硝態(tài)氮水平，并在此基礎上篩選適用于葉用銀杏的最優(yōu)硝銨配比。