李 珊，王曉燕，黃 霞，張紅偉*，劉 菊，趙一擎，茹慶國(guó)

(1 河南省食品藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450018；2 鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450007)

貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肅、湖北、安徽等省[1]。2020年版《中國(guó)藥典》一部藥材與飲片項(xiàng)下收載了6種不同來源的藥用貝母，分別為浙貝母(百合科植物浙貝母FritillariathunbergiiMiq.的干燥鱗莖)、土貝母[葫蘆科植物土貝母Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franquet的干燥塊莖]、湖北貝母(百合科植物湖北貝母FritillariahupehensisHsiao et K.C.Hsia的干燥鱗莖)、川貝母[百合科植物川貝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母FritillariaprzezvalskiiMaxim.、梭砂貝母FritillariadelavayiFranch.、太白貝母FritillariataipaiensisP.Y.Li或瓦布貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsiavar.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu, S.Wang et S.C.Chen的干燥鱗莖]、平貝母(百合科植物平貝母FritillariaussuriensisMaxim.的干燥鱗莖)、伊貝母(百合科植物新疆貝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁貝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鱗莖)。貝母的植物來源種類繁多，遍布全國(guó)各地，但藥典中收載的川貝母野生資源逐漸枯竭，因此各地均有替代品[2]。

現(xiàn)代藥理研究表明，貝母具有抑菌[3-5]、鎮(zhèn)咳[6-7]、平喘[8-9]、抗腫瘤[10-12]等作用。核苷類屬于貝母中的水溶性成份，有研究表明，貝母的水溶性成份具有松弛平滑肌、抑制血小板聚集、降壓、抗炎等作用[13]，而貝母的抗炎作用能協(xié)同治療呼吸道感染，是貝母止咳化痰的藥理學(xué)基礎(chǔ)[14]。

舞陽貝母為百合科植物舞陽貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉，于1983年在河南省野生經(jīng)濟(jì)植物資源考察中發(fā)現(xiàn)，以舞鋼市為中心，多分布在海拔230～700 m的疏林草地或山坡草叢，療效確切，是河南省特有的中藥材貝母資源[15]。舞陽貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)于2019年通過專家評(píng)審，現(xiàn)收入《河南省中藥飲片炮制規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)草案》，且已進(jìn)入“河南省中藥飲片炮制規(guī)范研究”課題品種名單。但由于相關(guān)研究基礎(chǔ)薄弱，特別是對(duì)其化學(xué)成份的研究較少，現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，只有性狀、鑒別、檢查、浸出物項(xiàng)目，沒有含量測(cè)定項(xiàng)目，未制定質(zhì)量等級(jí)，也未與其他川貝母、浙貝母等藥材進(jìn)行更加深入的質(zhì)量比較。因此，作為豫產(chǎn)特色中藥材，對(duì)舞陽貝母進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，在提高藥材質(zhì)量控制水平、確保藥材質(zhì)量、保證臨床用藥的穩(wěn)定性和有效性方面具有重要意義。

舞陽貝母入藥多為水煎口服，已有多項(xiàng)研究針對(duì)貝母中核苷類成份的含量進(jìn)行了測(cè)定[16-24]。核苷類物質(zhì)是生物機(jī)體細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素，具有多種生物活性[25]，可作為舞陽貝母的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。本研究對(duì)舞陽貝母中的9種核苷類成份進(jìn)行含量測(cè)定，并首次建立其水溶性成份HPLC指紋圖譜，以期為舞陽貝母的進(jìn)一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity液相色譜系統(tǒng)、AgilentDEAA311731二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)；XPE205萬分之一電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；粉碎機(jī)(漯河金田試驗(yàn)設(shè)備研究所)；SIGMA3-30KS高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)西格瑪公司)；Mili-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥

尿嘧啶對(duì)照品(批號(hào)：100469-201302，含量以99.6%計(jì)算)、次黃嘌呤對(duì)照品(批號(hào)：140661-200402，含量以99.0%計(jì)算)、腺苷對(duì)照品(批號(hào)：110879-200202，含量以100.0%計(jì)算)、尿苷對(duì)照品(批號(hào)：887-200202，含量以100.0%計(jì)算)、腺嘌呤對(duì)照品(批號(hào):110886-200001，含量以100.0%計(jì)算)、鳥苷對(duì)照品(批號(hào)：111977-201501，含量以93.6%計(jì)算)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；胸苷對(duì)照品(批號(hào):ML190825-06，含量以98.0%計(jì)算)、胞苷對(duì)照品(批號(hào):TI180107-17，含量以98.0%計(jì)算)、2′-脫氧腺苷對(duì)照品(批號(hào):AL181124-13，含量以98.0%計(jì)算)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇(德國(guó)默克股份兩合公司，色譜純)；超純水為自制。

實(shí)驗(yàn)用9批舞陽貝母樣品來自不同產(chǎn)地，采用3種不同加工方式加工而成，經(jīng)河南省食品藥品檢驗(yàn)所鑒定為百合科植物舞陽貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉。樣品信息見表1。

表1 9批舞陽貝母樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取舞陽貝母樣品適量，粉碎機(jī)粉碎，過3號(hào)篩。取約1.5 g，精密稱定，置50 ml具塞錐形瓶中，加純水10 ml，搖勻，稱定重量，室溫下超聲提取60 min(功率300 W，頻率50 kHz)，取出放冷至室溫，加純水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，轉(zhuǎn)移至10 ml離心管，離心5 min(10 000 r/min)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取尿嘧啶對(duì)照品、胞苷對(duì)照品、次黃嘌呤對(duì)照品、尿苷對(duì)照品、腺嘌呤對(duì)照品、鳥苷對(duì)照品、胸苷對(duì)照品、腺苷對(duì)照品、2′-脫氧腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成質(zhì)量濃度分別為118.325、101.528、103.356、101.520、102.400、91.653、109.760、111.520、119.717 μg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

2.3 色譜條件

采用YMC-Triart C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(見表2)；柱溫為30 ℃；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；進(jìn)樣量為10 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，色譜圖見圖1。

1：尿嘧啶；2：胞苷；3：次黃嘌呤；4：尿苷；5：腺嘌呤；6：鳥苷；7：胸苷；8：腺苷；9：2′-脫氧腺苷

各相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，表明上述色譜條件可有效分離各目標(biāo)成份，可用于舞陽貝母的含量測(cè)定研究。

2.4.2線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.1、1、2、4、8、10、20 ml，分別置于7個(gè)20 ml容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，制成系列濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，精密吸取10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由結(jié)果可知9種核苷類成份在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表3。

表3 9種核苷類成份的線性關(guān)系

2.4.3精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次。測(cè)得胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷、2′-脫氧腺苷峰面積的RSD分別為1.05%、1.23%、0.85%、0.34%、0.67%、0.34%、0.29%、0.48%和0.98%，表明儀器精密度良好。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)

取S4號(hào)樣品粉末1.5 g，共6份，精密稱定，平行制備6份供試品溶液(按“2.1”項(xiàng)下方法)，測(cè)定9個(gè)核苷類成份含量(按“2.3”項(xiàng)下色譜條件)，結(jié)果胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷、2′-脫氧腺苷RSD分別為1.86%、1.57%、2.11%、0.98%、1.84%、1.95%、1.49%、1.36%、1.77%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S4號(hào)樣品制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷、2′-脫氧腺苷峰面積的RSD分別為0.68%、0.91%、0.87%、0.77%、0.94%、0.75%、0.67%、0.96%、0.72%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的S4號(hào)樣品共6份，每份約0.75 g，精密稱定，分別精密加入尿嘧啶對(duì)照品溶液(49.10 μg/ml)、胞苷對(duì)照品溶液(10.82 μg/ml)、次黃嘌呤對(duì)照品溶液(9.18 μg/ml)、尿苷對(duì)照品溶液(541.82 μg/ml)、腺嘌呤對(duì)照品溶液(29.18 μg/ml)、鳥苷對(duì)照品溶液(420.36 μg/ml)、胸苷對(duì)照品溶液(200.12 μg/ml)、腺苷對(duì)照品溶液(301.17 μg/ml)、2′-脫氧腺苷對(duì)照品溶液(130.18 μg/ml)各1 ml，加水至10 ml，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”色譜條件下測(cè)定，并計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果表明回收率良好，見表4。

表4 9種核苷類成份加樣回收率結(jié)果

2.4.7含量測(cè)定

取各批次舞陽貝母樣品適量，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，不同批次舞陽貝母樣品中核苷類成份總量差異較大，且各成份含量也相差較大。

表5 9批舞陽貝母樣品的核苷類成份含量測(cè)定結(jié)果 n=3，μg/g

2.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

將各批次舞陽貝母樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，2012版)”，建立9批河南不同產(chǎn)地舞陽貝母指紋圖譜的共有模式。以S1號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，設(shè)定匹配模板，進(jìn)行譜峰多點(diǎn)校正，時(shí)間窗寬度為1.0 min，生成對(duì)照?qǐng)D譜(見圖2)，共確定15個(gè)共有色譜峰。通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了9個(gè)成份，即峰1為尿嘧啶、峰2為胞苷、峰4為次黃嘌呤、峰5為尿苷、峰8為腺嘌呤、峰9為鳥苷、峰11為胸苷、峰13為腺苷、峰14為2′-脫氧腺苷。對(duì)各批次舞陽貝母樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度計(jì)算，S1～S9的相似度分別為0.910、0.891、0.843、0.822、0.906、0.889、0.906、0.857、0.865，范圍為0.822～0.910。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，河南產(chǎn)舞陽貝母指紋圖譜基本一致，見圖3。

1：尿嘧啶；2：胞苷；4：次黃嘌呤；5：尿苷；8：腺嘌呤；9：鳥苷；11：胸苷；13：腺苷；14：2′-脫氧腺苷

圖3 9批舞陽貝母樣品HPLC疊加圖譜(S1～S9)

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

在制備供試品溶液時(shí)考察了不同提取方法(超聲、回流)和不同溶劑(純水，10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液)，發(fā)現(xiàn)純水超聲提取效率最高，操作簡(jiǎn)便，且提取過程中無需加熱、無化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，對(duì)測(cè)定組份的量沒有損失。進(jìn)一步考察了溶劑用量(10、20、30 ml)及提取時(shí)間(30、60、90 min)，最終確定提取方法為10 ml純水超聲提取60 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相，在不同的梯度洗脫條件下進(jìn)樣，采用5種不同色譜柱Waters-Symmetrm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、JADE-PAKRS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agela-Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，同時(shí)比較了不同進(jìn)樣量(5、10、15 μl)，不同流速(0.5、0.8、1.0 ml/min)、不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，根據(jù)色譜圖基線、出峰數(shù)目、理論塔板數(shù)及分離度確定了本實(shí)驗(yàn)的色譜條件。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用DAD檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)對(duì)照品及樣品進(jìn)行掃描，綜合考慮不同波長(zhǎng)下色譜峰的數(shù)目、紫外吸收、分離度、峰面積大小，最終確定260 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 測(cè)定結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)首次建立了舞陽貝母藥材中水溶性成份(胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、2′-脫氧腺苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷)的含量測(cè)定方法。該方法可使舞陽貝母水提取物中9種核苷類成份有效分離，且精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性較好。9批舞陽貝母樣品中的9種核苷類成份(胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、2′-脫氧腺苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷)含量平均值分別為45.54、24.87、10.39、103.58、407.45、32.45、189.17、441.08、368.17 μg/g，其中次黃嘌呤含量普遍較低(≤21.77 μg/g)，鳥苷含量普遍較高(≥318.39 μg/g)，可見不同批次的舞陽貝母樣品中9種核苷類成份含量差異較大；其次，9批舞陽貝母樣品(S1～S9)中9種核苷類成份的總量分別為1014.08、1526.59、1513.57、1563.99、1578.57、2256.64、1876.04、1884.99、1389.76 μg/g，可見各批次間核苷類成份總量也相差較大。

本實(shí)驗(yàn)收集的9批舞陽貝母樣品是由硫熏、傳統(tǒng)炕制和烘箱烘干3種不同的產(chǎn)地加工方法加工而成，由測(cè)定結(jié)果中的9種核苷類成份總量可知，烘箱烘干的樣品含量最高[(2005.89±217.20)μg/g]，其次是傳統(tǒng)炕制[(1514.50±74.60)μg/g]，硫熏含量最低(1014.08 μg/g)，表明不同產(chǎn)地加工方法對(duì)9種核苷類成份總量會(huì)產(chǎn)生較大影響，烘箱烘干損失較小，而硫熏損失較大。有研究表明硫黃熏蒸不僅使中藥材及飲片殘留大量二氧化硫，還伴隨有復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致多種有效成份的化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生改變[26-27]。硫黃熏蒸對(duì)中藥核苷類成份的影響及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.5 指紋圖譜分析

中藥指紋圖譜能全面地反映中藥所包含的復(fù)雜化學(xué)成份信息，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的中藥質(zhì)量控制有效手段。中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫作為中藥鑒定發(fā)展的有效平臺(tái)，其研究和建立是中藥質(zhì)量控制規(guī)范化、全面化、標(biāo)準(zhǔn)化的重要途徑[28]。HPLC法以其應(yīng)用范圍廣、分離效能高、使用自動(dòng)化、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)成為建立中藥指紋圖譜的常用方法[29]。本研究構(gòu)建了舞陽貝母水溶性成份HPLC指紋圖譜，同時(shí)對(duì)其含量進(jìn)行評(píng)定，建立9批舞陽貝母水溶性成份指紋圖譜的共有模式，確定了15個(gè)共有色譜峰，并通過對(duì)照品保留時(shí)間定位對(duì)其中9個(gè)峰進(jìn)行了指認(rèn)。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，2012版)”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，9批舞陽貝母相似度在0.822～0.910，表明河南不同產(chǎn)地舞陽貝母水溶性成份指紋圖譜基本一致，為舞陽貝母的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定依據(jù)。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)建立了河南特色藥材舞陽貝母中核苷類成份的含量測(cè)定方法并初步建立了HPLC指紋圖譜，對(duì)不同批次舞陽貝母進(jìn)行了質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)，為從整體上控制舞陽貝母藥材的質(zhì)量提供了更加簡(jiǎn)便直觀的方法。