張桂娟，格日樂其木格，崢 嶸，張濤濤，董 丹，吳慧玲*

(1.北京市大興區(qū)植保植檢站，北京 102609；2.北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097；3.內(nèi)蒙古師范大學生命科學與技術(shù)學院，呼和浩特 010022)

生防微生物具有促進植物生長和防治多種植物病害的作用[1-4]。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)兼具芽孢特性和根際定殖能力，由于具有生長迅速、營養(yǎng)簡單、抗逆性強，能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)而在植物病害防治中扮演重要的角色；多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽孢，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖，是植物病害生防微生物的重要組成部分；多粘類芽孢桿菌對植物具有非致病性，同時具備防病和促生作用，作為生防菌普遍應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中；多粘類芽孢桿菌具有從土壤向植物根部移動定植的能力[5-6]，能通過固氮和溶磷作用為宿主植物提供養(yǎng)分[7-8]，已被美國環(huán)境保護署(Environment Protection Agency,EPA)列為可商業(yè)應用的微生物，可應用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)和醫(yī)藥等多個領(lǐng)域；中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種[9]。作為一株多功能促生和防病的根際細菌，多粘類芽孢桿菌被報道對多種作物有促生防病效果，包括對黃瓜、油菜、番茄等的促生作用和作物枯萎病、黃萎病、灰霉病、辣椒疫病、作物莖腐病等有防控作用[7,10-11]，對線蟲病害也有一定防治效果[12-13]。據(jù)報道，利用多粘類芽孢桿菌CCM1465和92的發(fā)酵液及其代謝產(chǎn)物胞外多糖處理小麥幼苗，可以提高小麥幼苗根部細胞有絲分裂指數(shù)，有效促進小麥生長[14]。Zhai等[15]從油菜根際土壤中分離到的多粘類芽孢桿菌HX-140可以使黃瓜幼苗枯萎病感染率降低55.6%。多粘類芽孢桿菌NBmelon-1對甜瓜幼苗的生長具有促生作用,對甜瓜枯萎病防治效果達到52.76%[16]。因此，具有“藥肥兼能”特點的多粘類芽孢桿菌在植物病害防治方面具有廣闊的應用前景。

前期，對分離自青海湖周邊土壤中的對多種病原菌具有抑制作用的多粘類芽孢桿菌246-1盆栽試驗表明該菌株具有非常好的抑制黃瓜枯萎病和促進黃瓜生長的作用。在完成了該菌株液體發(fā)酵工藝的前提下，進行了多粘類芽孢菌246-1的可濕性粉劑制備工藝的一個簡單研究，并比較了 2 種不同微生物菌劑(多粘類芽孢桿菌和小白鏈霉菌)及復配制劑，以及市售相關(guān)產(chǎn)品對溫室黃瓜生長、產(chǎn)量及病害發(fā)生情況的影響，以期為多粘類芽孢桿菌菌劑在溫室栽培中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

母液多粘類芽孢桿菌246-1發(fā)酵液(菌體密度大于2×109cfu/mL，芽孢率大于90%)由本實驗室制備。

載體：選用高嶺土、硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣和膨潤土為載體，全部過篩80 目。

保護劑：抗壞血酸(VC)、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)、糊精、十二烷基硫酸鈉(SDS)。

穩(wěn)定劑：碳酸鈣、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose Na，CMC-Na)。

1.2 測定方法

(1)懸浮率的測定：參考《農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測定》(GB/T 14825—2006)[17]。

(2)潤濕時間的測定：參考《可濕性粉劑潤濕性的測定》(GB/T 5451—2001)[18]。

(3)細度的測定：參考《農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測定》(GB/T 16150—1995)[19]。

(4)含水率的測定：參考《農(nóng)藥水分測定》(GB/T 1600—2001)[20]。

(5)pH測定方法：參考《農(nóng)藥pH值的測定》(GB/T 1601—1993)[21]。

(6)加速貯存試驗：采用《農(nóng)藥可濕性粉劑產(chǎn)品標準編寫規(guī)范》(GB/T 19136—2003)中的加速貯存試驗為參考標準：將一定量的母粉、分散劑、潤濕劑、填料混勻制得樣品，再將樣品裝入玻璃瓶中密封置于(54±2)℃的恒溫箱中，貯存14 d后取出樣品，測定菌含量，計算出菌存活率[22]。

(7)制劑穩(wěn)定性的測定：冷貯穩(wěn)定性：在(4±2)℃條件下貯存14 d和1 a測定菌存活率。室溫貯藏穩(wěn)定性：在25 ℃條件下貯存14 d和1 a測定菌存活率。熱貯穩(wěn)定性：在(54±2)℃條件下貯存 14 d后測定菌存活率。

1.3 填料的選擇

選取高嶺土、硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣和膨潤土為載體，均過篩80目，將載體與母液按照一定比例混勻，風干，粉碎。

按1.2節(jié)中的方法測定以上4種樣品的懸浮率、潤濕時間、細度和活菌數(shù)。根據(jù)測定結(jié)果選擇最適載體。

1.4 保護劑的選擇

將1.1節(jié)中的 4 種不同保護劑按一定比例加入母粉中混合，對照不加保護劑，將樣品在254 nm紫外燈(20 W)距離40 cm處照射12 h后，稀釋后涂布在平板上,每個處理重復 3 次，計算菌落數(shù)。

1.5 穩(wěn)定劑的選擇

初加工的母粉中添加不同穩(wěn)定劑，對照不加穩(wěn)定劑，在(54±2)℃條件下貯存，7 d后測定其芽孢含量的變化[22]。

1.6 貯存條件對制劑中活菌穩(wěn)定性的影響

1.6.1 活菌量及存活率的測定

活菌量測定方法參照文獻[23]，存活率=M1×100/M0×100%，其中，M1為測定時制劑的活菌量，M0為實驗前制劑的活菌量。

1.6.2 溫度、含水率及日光照射對制劑中活菌穩(wěn)定性的影響

對246-1芽孢制劑進行了不同溫度、不同含水率及日光照射對芽孢存活的影響，相關(guān)處理和檢測方法參照文獻[23]。

1.7 溫室試驗

1.7.1 供試作物

供試作物為黃瓜，品種為“京研綠秀F1”，試驗在北京市大興區(qū)龐各莊鎮(zhèn)丁村的日光溫室進行，前茬為黃瓜，土傳病害相對嚴重。設(shè)空白對照，每個處理3個重復。小區(qū)面積為22 m2，隨機排列。試驗共設(shè)5個處理，每個處理約 70 株。整地時常規(guī)施肥，定植時溝施不同菌劑。

1.7.2 供試菌劑

多粘類芽孢桿菌(本實驗室制備，2×109cfu/g)，市售多粘類芽孢桿菌菌劑(2×109cfu/g)，微生物復合菌劑[多粘類芽孢桿菌和小白鏈霉菌(2×109cfu/g，本實驗室制備)復配]

處理1：多粘類芽孢桿菌菌劑150 kg/hm；處理2：多粘類芽孢桿菌菌劑75 kg/hm2+小白鏈霉菌45 kg/hm；處理3：市售多粘類芽孢桿菌菌劑150 kg/hm；處理4：小白鏈霉菌90 kg/hm；處理5：清水對照。

1.7.3 試驗數(shù)據(jù)調(diào)查與測定

對各處理分別在黃瓜定植后 30、45、60、90 d時植株病害發(fā)生情況進行調(diào)查；在盛果期 45 d時測定株高、單瓜重，調(diào)查小區(qū)產(chǎn)量。進行發(fā)病植株調(diào)查并用 SPSS 16.0 處理數(shù)據(jù)[24]。

2 實驗結(jié)果

2.1 載體的確定

檢測數(shù)據(jù)顯示載體制備的可濕性粉劑的細度與潤濕時間均達到《農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測定》(GB/T 16150—1995)、《可濕性粉劑潤濕性的測定》(GB/T 5451—2001)要求，如表1所示。其中硅藻土和高嶺土除了濕潤時間比較短以外，懸浮率也相對較高。由于硅藻土吸附的菌劑在放置一周左右后活菌數(shù)最高，達到1.57×109cfu/g，因此選擇用硅藻土為載體。

2.2 保護劑的確定

添加保護劑可以提高制劑在不同逆境中的穩(wěn)定性。由表2可知，作為保護劑糊精、SDS和CMC對菌劑在紫外線照射下都具有保護作用，其中SDS作為穩(wěn)定劑，保護作用最好，活菌數(shù)最高。

表2 保護劑的篩選Table 2 Screening of protective agents

2.3 穩(wěn)定劑的確定

高溫對粉劑中活菌的含量有顯著影響，由表3可知，4種穩(wěn)定劑均在不同程度上降低熱貯分解率，提高了制劑的穩(wěn)定性。其中，CMC-Na作為穩(wěn)定劑時，熱貯分解率最低，芽孢存活率最高，因此選羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose Na,CMC-Na)作為穩(wěn)定劑。

表3 穩(wěn)定劑的篩選Table 3 Screening of stabilizers

2.4 菌劑中活細胞含量以及貯存條件對菌劑穩(wěn)定性的影響

2.4.1 溫度對246-1菌劑活菌穩(wěn)定性的影響

圖1顯示不同溫度處理下芽孢菌劑在貯存30 d過程中的活菌率的變化。芽孢制劑在-20、4、25 ℃儲存30 d后活菌存活率仍然高于90%。而隨著溫度的升高，37 ℃貯存條件下芽孢菌劑放置30 d后活菌率低于70%，54 ℃貯存條件下芽孢菌劑放置30 d后活菌率低于20%，因此該制劑應在常溫或低溫條件下保存。

圖1 溫度對246-1菌劑活菌穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on the stability of 246-1 preparation

2.4.2 含水率對246-1芽孢菌劑活菌穩(wěn)定性的影響

研究了芽孢桿菌不同含水率粉劑在25 ℃貯存條件下放置90 d后的芽孢存活率。實驗結(jié)果(圖2)表明，多粘類246-1芽孢制劑含水率越低，活菌存活率越高，含水率為18%時，隨著貯存時間的增加，活菌率顯著降低。含水率為8%時活菌含量較穩(wěn)定，有利于大規(guī)模儲存，含水率為3%雖能保持更高的活菌數(shù)，但生產(chǎn)過程能耗較大，所以選擇8%的含水率。

圖2 含水率對246-1芽孢制劑活菌穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of moisture content on the stability of 246-1 preparation

2.4.3 日光照射對246-1芽孢制劑活菌穩(wěn)定性的影響

實驗結(jié)果(圖3)表明，當日光照射時，多粘類246-1制劑的活菌量迅速下降，但是在3 d后達到平衡，之后活菌數(shù)相對穩(wěn)定。在室內(nèi)和黑暗的制劑活菌量基本保持不變，因此，菌劑的存放需要黑暗或者室內(nèi)保存，日光照射條件下，活菌數(shù)會受到影響。

圖3 光照對246-1芽孢制劑的活菌量的影響Fig.3 Effect of light on the viable bacterial quantity of 246-1 spore preparations

2.5 菌劑處理對黃瓜植株生長和產(chǎn)量的影響

黃瓜植株生長及產(chǎn)量調(diào)查如表4所示，可以看出施用微生物菌劑的處理與清水對照相比，黃瓜株高、單瓜重及小區(qū)產(chǎn)量都有所增加。其中株高增加4～6 cm、單瓜重提高了0.6～1.7 g。其中，多粘類芽孢桿菌與小白鏈霉菌混合施用的處理在株高、單瓜重及小區(qū)產(chǎn)量中都高于其他處理，尤其是小區(qū)產(chǎn)量，顯著高于對照，表明小白鏈霉菌和多粘類芽孢桿菌在提高黃瓜產(chǎn)量方面產(chǎn)生了協(xié)同作用。

表4 各菌劑對黃瓜生長及產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of different fungicides on growth and yield of cucumber

2.6 不同菌劑處理對黃瓜植株發(fā)病率的影響

分別在黃瓜定植后45、60、90 d對各處理植株病害發(fā)生情況進行調(diào)查，結(jié)果如表5所示，可以看出，CK1在黃瓜定植30 d時已初現(xiàn)病株，發(fā)病率為5.7%。市售多粘類芽孢桿菌有1株初現(xiàn)病狀。多粘類芽孢桿菌單獨處理在黃瓜定植45 d時出現(xiàn)發(fā)病植株，發(fā)病率為2.8%；此時，CK植株發(fā)病加重，發(fā)病率為10%，市售多粘類芽孢桿菌處理發(fā)病率為5.7%。多粘類芽孢桿菌和小白鏈霉菌混配菌劑處理以及小白鏈霉菌單獨處理在黃瓜定植60 d時出現(xiàn)發(fā)病植株，發(fā)病率分別為2.8%和4.3%；多粘類芽孢桿菌單獨處理發(fā)病率為5.7%，市售多粘類芽孢桿菌和對照植株病情繼續(xù)加重，發(fā)病率分別為10%和18.6%。在黃瓜定植90 d時，各處理植株發(fā)病率均有增加，但菌劑處理較CK發(fā)病植株增勢較緩，尤其是復合菌劑處理，發(fā)病率顯著低于對照。綜上結(jié)果，多粘類芽孢桿菌和小白鏈霉菌混合施用比單獨施用多粘類芽孢桿菌和小白鏈霉菌防控效果好，植株發(fā)病率低。說明兩種菌株混合施用具有協(xié)同作用。

表5 各菌劑處理對黃瓜發(fā)病情況的影響Table 5 Effects of different fungicides on cucumber disease

3 討論

目前，市場上關(guān)于多粘類芽孢桿菌的菌劑較多，其中康地蕾得(1×107cfu/g多粘類芽孢桿菌細粒劑)是最早以多粘類芽孢桿菌為有效成分登記的微生物農(nóng)藥。由華東理工大學海洋生化工程研究所研制、原上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司(現(xiàn)浙江省桐廬匯豐生物化工有限公司)生產(chǎn)。目前該產(chǎn)品在防治細菌性和真菌性土傳病害(重茬病)及促生長方面顯示了比較理想的效果[24]。目前關(guān)于多粘類芽孢桿菌的研究，尚沒有根據(jù)其生防機制對其發(fā)酵條件和制劑進行指導性優(yōu)化，進而篩選出特異性好的高效菌劑。

本課題組從分離自青海湖周邊土壤中得到的高效拮抗菌株多粘類芽孢菌246-1對果蔬作物灰霉病菌(Botrytiscinerea)、枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.spp.)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)等多種病原真菌和黃瓜角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.Lachrymans)、茄子青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)等部分細菌具有抑制作用。前期，開展了多粘類芽孢桿菌T99抗菌活性物質(zhì)的分析及溫室、田間防效研究。在溫室和田間防治試驗中，多粘類芽孢桿菌T99表現(xiàn)出對黃瓜和甘藍枯萎病、番茄灰霉病顯著的抑制效果，同時對黃瓜、油菜和甘藍等植株的生長有促進作用[3,25-26]。經(jīng)深入分析鑒定其對病原真菌的主要活性物質(zhì)為葡聚糖酶和殺鐮孢菌素。分析了葡聚糖酶活性并進行了高效異源表達[25]，并對殺鐮孢菌素進行了結(jié)構(gòu)鑒定和發(fā)酵工藝優(yōu)化，建立了殺鐮孢菌素制備和檢測體系，開展了基因簇分析和溫室防病促生研究，明確其優(yōu)良的促生、防病效果及其主要抑菌活性物質(zhì)。對多粘類芽孢桿菌的可濕性粉劑制劑進行了初步研究，并對該制劑田間對黃瓜生長及病害防控進行了分析，這些研究結(jié)果為多粘類芽孢菌高效生防菌劑的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

為了獲得高效多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑制劑并研究其對溫室黃瓜生長的影響，進行了制劑載體，保護劑及穩(wěn)定劑的篩選。通過檢測制劑懸浮性、潤濕性、分散性、貯藏穩(wěn)定性、抗氧化抗紫外性、水分含量、細度等初步獲得可多粘類芽孢桿菌246-1可濕性粉劑制劑。同時分析了高溫，含水量及日光照射對菌劑穩(wěn)定性的影響，通過溫室小區(qū)試驗研究了該菌劑及其與放線菌復配菌劑、市售芽孢桿菌菌劑對黃瓜生長的影響及對黃瓜土傳病害的防治效果。進一步通過溫室小區(qū)試驗研究了多粘類芽孢桿菌246-1可濕性粉劑，及其與小白鏈霉菌固體制劑復配對黃瓜生長及病害發(fā)生的影響，同時比較了本實驗室研制制劑與相關(guān)市售多粘類芽孢桿菌制劑對黃瓜的生長和病害控制情況。其中多粘類芽孢桿菌和小白鏈霉菌的復配菌劑處理的黃瓜植株長勢茂盛，葉色濃綠，在株高、單果重及小區(qū)產(chǎn)量都顯著高于其他處理，并能夠使黃瓜植株病害明顯減輕。