尤偉靜，蔣欣如，凌慶枝

（寧波衛(wèi)生職業(yè)技術學院，浙江寧波 315000）

子囊菌綱、炭角菌科的黑柄炭角菌［Xylaria nigripes（KI.）Sacc.，XN］別名烏靈參、雞茯苓、地炭棍，主要產于江蘇省、浙江省、四川省、云南省等地，生長在地下0.5～2.0 m 黑翅土棲白蟻遺棄的菌圃腔內，是一種傳統(tǒng)的藥用真菌、食用菌，具有豐富的生物活性成分、特殊的生物學特性及廣泛的藥理作用，被世界藥用真菌、應用研究等領域均視為名貴、珍稀藥材。黑柄炭角菌菌粉在臨床上用于鎮(zhèn)靜安神、抗焦慮、抗抑郁，且其效果己經得到證實，并且不良反應較少，顯示出其在中醫(yī)藥方面的獨特優(yōu)勢［1］。

盡管黑柄炭角菌在臨床上的應用療效得到了認可，但因其生長在地下深處黑翅土棲白蟻廢棄的蟻巢上，生長環(huán)境奇特、采掘困難，使得野外采集的黑柄炭角菌樣品量有限，單一化合物的分離純化和相應的藥理學報道較少，所以對其的研究及推廣非常緩慢［2］。目前，國內僅有黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲生產的報道。作為一個具有廣闊開發(fā)潛力的藥用真菌，資源短缺是限制其開發(fā)利用的瓶頸，而人工培育藥用真菌是擴展其自然資源行之有效的途徑，因此開發(fā)黑柄炭角菌這一珍貴藥用真菌資源，解決野生黑柄炭角菌因自然資源有限、科學試驗和研究難以展開和市場開發(fā)利用受限的實際問題，對野外采集的黑柄炭角菌進行菌株分離與鑒定，并對其生物學特性進行優(yōu)化研究，旨在為后續(xù)的馴化栽培和進一步深入研究及開發(fā)利用等奠定基礎，以期進一步擴大其藥源［3-4］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種的來源

本研究以在浙江省麗水市山區(qū)采集的野生黑柄炭角菌子實體為實驗材料，通過組織分離純化得到菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

1）菌種的分離與保藏培養(yǎng)基（改良PDA）：磷酸氫二鉀0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀1 g·L-1、蠶蛹粉5 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1，自然pH 值。

2）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1、石膏10 g·L-1、硫酸鎂10 g·L-1、硫酸鋅l0 g·L-1、磷酸二氫鉀10 g·L-1、米糠200 g·L-1、木屑750 g·L-1，自然pH 值。

1.2 黑柄炭角菌菌種的分離、純化及鑒定

采用子實體組織分離法對野生鮮品黑柄炭角菌進行菌種分離。將黑柄炭角菌子實體在嚴格無菌條件下用無菌水沖洗數次，再用75%的酒精表面消毒滅菌處理，用刀片將其切取3 mm×3 mm 大小的塊狀體，接種于PDA 斜面培養(yǎng)基上面，于25 ℃下培養(yǎng)7 d 左右，即可獲得菌絲體。將上述分離得到的菌種運用PCR 擴增技術測定ITS 序列，并與Genbank 中序列對比證明分離得到的菌種為黑柄炭角菌，人工培育菌絲體及子實體亦為黑柄炭角菌［3-4］。

1.3 黑柄炭角菌人工栽培及條件優(yōu)化選擇

1.3.1 黑柄炭角菌人工栽培工藝流程

培養(yǎng)基的配制→滅菌→接種→生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)→室內培養(yǎng)→子座形成。

1.3.2 黑柄炭角菌人工栽培條件優(yōu)化選擇

培養(yǎng)基常規(guī)滅菌，待溫度降至室溫后，取生長時間和長勢一致的菌種，用直徑5 mm 的打孔器進行接種，生化培養(yǎng)箱暗光培養(yǎng)（菌絲生長階段）。菌絲滿瓶取出，去掉封口紙后置于室內培養(yǎng)（原基分化及子座生長階段），同時分別進行不同營養(yǎng)條件、pH 值、濕度、溫度及光照等因子對其生長影響的實驗，每瓶裝100 mL，每個處理10 次重復，每瓶為1 次重復。以菌絲體產量，原基分化時間、形態(tài)、數量，子座成熟時間、形態(tài)、數量、顏色及生長高度為依據進行比較選擇［3-4］。

2 結果與分析

2.1 菌絲體的生長與形態(tài)特征

接種后，接種處周圍長出薄薄的一層灰白色的基生菌絲，再經過一定時間后，菌絲幾乎布滿整個培養(yǎng)基表層，基生菌絲上面長出茂密的一層白色的氣生菌絲，氣生菌絲相互扭結形成菌索，最后形成子座。

2.2 黑柄炭角菌人工栽培條件優(yōu)化實驗

2.2.1 碳源對黑柄炭角菌菌絲體產量的影響

以不加葡萄糖基本培養(yǎng)基為對照，分別加入不同的碳源，接種后25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱暗箱培養(yǎng)168 h，然后分別過濾、干燥、稱菌絲體重量［4］。實驗結果表明：黑柄炭角菌菌絲體生長中碳源以葡萄糖、果糖的利用效果較好，麥芽糖、甘露醇、淀粉的利用效果一般，對蔗糖的利用效果最差，實驗結果見表1。

表1 不同碳源條件下菌絲體產量（干重）情況

2.2.2 氮源對黑柄炭角菌菌絲體產量的影響

在基本培養(yǎng)基中不加黃豆粉為對照，分別加入不同的氮源，接種后25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱暗箱培養(yǎng)168 h，然后分別過濾、干燥、稱菌絲體重量。實驗結果表明：黑柄炭角菌菌絲體生長中氮源以黃豆粉的利用效果較好，蠶蛹粉、蛋白胨、酵母浸膏的利用效果次之，花生粉最差，實驗結果見表2。

表2 不同氮源條件下菌絲體產量（干重）情況

2.2.3 pH 值對黑柄炭角菌菌絲體產量的影響

黑柄炭角菌菌絲生長階段，葡萄糖作為碳源、黃豆粉作為氮源添加至培養(yǎng)基，用HCl 或NaOH 調節(jié)培養(yǎng)基自然pH 值，分別設pH 值處理：4.0、4.5、5.0、5.3、5.5、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接種后25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱暗箱培養(yǎng)168 h，最后分別過濾、干燥、稱菌絲體重量。實驗結果表明：黑柄炭角菌菌絲在pH 值為4.5～8.0 均能生長，但以5.5 左右為最佳，菌絲體直徑較大，生長旺盛、粗壯，干重較重。在pH值低于4.5 或者高于8.0 時，前期生長緩慢（72 h 之前），中期停止生長開始凋亡（72～96 h），后期甚至死亡（96～168 h）；在pH 值為5.0～5.8 時，菌絲前期生長較慢（72 h 之前），中后期生長速度加快（72～168 h)，可能是菌絲生長過程中分泌的堿性物質使培養(yǎng)基的pH 朝著合適的條件生長，結果見表3。

表3 不同pH 值下菌絲體生長情況

2.2.4 溫度對黑柄炭角菌菌絲體產量及原基分化的影響

黑柄炭角菌菌絲生長階段，葡萄糖作為碳源、黃豆粉作為氮源添加至培養(yǎng)基，用HCl 或NaOH 調節(jié)培養(yǎng)基至自然pH 值5.5，分別設溫度處理：0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，空氣相對濕度保持85%～95%，散射光一致（100 lx）。分別記錄過濾干燥后菌絲體重量及原基形態(tài)、原基分化的數量、所需天數［3］。實驗表明：黑柄炭角菌是一種中溫性真菌，在15～35 ℃下均能夠生長和原基分化。從菌絲體產量及原基分化所需天數、分化數量考慮，最適合培養(yǎng)的溫度為25 ℃，實驗結果見表4。

表4 溫度對黑柄炭角菌原基分化的影響

原基數量：分多（+++）、中（++）、少（+）、無（-）4 級；菌絲體、原基、子座形態(tài)：按直徑和長度分粗壯（較長）、粗短、細弱（短小）、衰老4 級（以下表格都適用）。

2.2.5 光照對菌絲體生長及黑柄炭角菌原基分化的影響

菌絲生長階段及其他培養(yǎng)條件同2.1.4，黑柄炭角菌原基分化階段分別設散射光處理：0（黑暗）、100 lx（室內自然散射光）、1 000 lx（5 m2的房間4盞60W 日光燈），溫度保持25 ℃，記錄菌絲體生長情況，原基形態(tài)、原基分化的數量、所需天數［3］。實驗表明：1 000 lx散射光條件下完成原基分化的速度快，但形態(tài)細弱、數量少；黑暗條件下有原基分化，但形態(tài)細弱、色白、數量少、速度慢。100 lx 自然散射光最適合栽培黑柄炭角菌生長，實驗結果見表5。

表5 光照強度對黑柄炭角菌原基分化的影響

2.2.6 濕度對黑柄炭角菌原基分化及子座的影響

菌絲生長階段及其他培養(yǎng)條件同2.1.4，黑柄炭角菌原基分化及子座生長階段分別設濕度處理：70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%，保持散射光一致（100 lx），保持溫度25 ℃，記錄原基分化的形態(tài)、數量、所需天數及子座形態(tài)、數量及成熟時間［3］。實驗表明：黑柄炭角菌的子實體發(fā)育要求高濕度，濕度在85%～100%下均能夠原基分化和子座成熟。從原基分化及子座成熟所需天數、數量考慮，最適合濕度為85%～90%，實驗結果見表6。

表6 濕度對黑柄炭角菌原基分化的影響

3 結論與討論

二十世紀八九十年代，我國科研人員陳宛如等對黑柄炭角菌的菌種分離、生物學特性、深層發(fā)酵及功效做了較多的研究，但是近20 年來相關的培養(yǎng)特性和栽培馴化的研究寥寥無幾，這可能與黑柄炭角菌的特殊生境、自然資源稀少、采集與分離困難有關［4］。因此，需要加快它的研究與開發(fā)利用，為進一步擴大其藥源奠定基礎。

在人工培育環(huán)境影響因子實驗研究中，通過單因素和正交試驗，確定溫度對黑柄炭角菌的生長影響最大，在溫度25 ℃、濕度85%條件下，原基及子座形成早、數量多、質量好，這與其生長的土棲黑翅土白蟻巢中穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境溫度25 ℃左右是相吻合的，并且黑柄炭角菌菌絲體不耐低溫，在5 ℃下即解體死亡，因此菌種切不可放入冰箱內，而應在13 ℃左右溫度下保存，同時溫度高于35 ℃時菌絲體幾乎不萌發(fā)，以上證明黑柄炭角菌屬于中溫型菌類［5-6］。其次是pH 值的影響，黑柄炭角菌菌絲最適合的pH 值為5.5 左右，當低于4.5 或者高于8.0 時都生長緩慢至停止生長，并且在黑柄炭角菌生長過程中培養(yǎng)基的pH 值有所提高，這說明其在代謝過程中可能分泌某些堿性物質。另外，根據觀察，在黑暗和室內通常光照條件下，菌絲均能生長，在明亮條件下的斜面上，菌絲7 d 后就形成菌索，15 d 后開始衰老；而在全暗條件下菌絲生長密又粗壯，這可能是因為黑柄炭角菌菌絲適應了長期生長在完全沒有光線的黑翅土白蟻菌圃上這一特殊的環(huán)境，因此在保存菌種時，使菌種處于黑暗條件下較合適，但當由菌絲形成菌索和子座時，則產生明顯的向光生長，這也是與它的生態(tài)相一致的［5-6］。