付鈺茹，劉連芬，錢關(guān)澤

（聊城大學生命科學學院，山東 聊城252059）

蘋果屬常見于北溫帶地區(qū)，隸屬于薔薇科(Rosaceae)，全球范圍內(nèi)該屬有38 個品種，廣泛分布于北美洲、亞洲和歐洲[1]。我國有30 個品種，其中有20 個為原產(chǎn)品種[2]，廣布于26 個省市和自治區(qū)，其中西部占比最大[3-4]，但日常生活中最常吃的綿蘋果（M.pumila Mill.）主要分布于山東[5]。在蘋果屬里，有些物種由于具有較高觀賞性，目前已作為我國重要的園林樹種，例如山荊子(M.baccata(L.)Borkh.)、垂絲海棠(M.halliana Koehne)和湖北海棠(M.hupehensis(Pamp.)Rehd.)等[1]。蘋果屬植物的繁殖方式主要有兩種，一種是通過種子進行繁殖[6]，另一種是通過組織培養(yǎng)[1]，雖然前者應(yīng)用廣泛，但其優(yōu)良性狀難以保存，且繁殖效率較低，此時組織培養(yǎng)就大顯優(yōu)勢[7]，因為它能夠顯著地提高植物的繁殖系數(shù)，但如何進一步優(yōu)化植物組織培養(yǎng)成為了現(xiàn)在最關(guān)心的問題。反觀之，目前關(guān)于蘋果屬植物種子微形態(tài)的研究尚未見報道。因此，本文將20 種蘋果屬植物種子置于掃描電鏡下，對其表面微形態(tài)進行詳細的研究，旨在為蘋果屬植物的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究提供可靠的理論依據(jù)。

分類學的研究歷程距今已超過250年[8]，雙名現(xiàn)象也日趨明顯。在各個種中，存在著普遍的不同作者使用不同名稱的現(xiàn)象，尤其本屬，僅蘋果這一個種就有100 多個學名[9]； 蘋果屬分類中的另一個難題是本屬普遍存在的種間雜交和無融合生殖現(xiàn)象，因此形成了多種中間類型，使本屬中的多份標本無法具體到某一具體的種[10]。之前的鑒別方式主要通過對其表面形狀的描述來進行，并沒有使用演化性狀來進行，所以其中存在有很大的主觀因素，不能夠正確地反映屬內(nèi)類群的進化關(guān)系和親緣關(guān)系。以上所有難題都會對本屬植物的實際應(yīng)用和理論基礎(chǔ)造成嚴重的影響，同時還會阻礙本屬在商品價值方面的發(fā)展。

在2010年，章黎黎和楊曉紅通過對蘋果屬植物果實表皮微形態(tài)特征進行觀察，發(fā)現(xiàn)蘋果屬果實表皮細胞間的長寬比和間隙，以及共有的紋孔數(shù)量和寬度等，都會有不可忽略的差異，對其進行分析后，推出了本屬植物系統(tǒng)演化的趨勢，由此證明果實表皮微形態(tài)特征在蘋果屬植物的分類上，能夠提供有清晰明確的分類依據(jù)[11]。不光可以通過果實表皮細胞微形態(tài)進行分類，種子由于受環(huán)境的影響較小，所以它們的微形態(tài)特征也可以為植物系統(tǒng)的分類提供有理可依的證據(jù)[12]。然而卻很少有人報道微形態(tài)特征在蘋果屬的分類中所起到的重要作用。為此，本文對蘋果屬植物種皮的微形態(tài)特征進行了詳細的比較研究，以期能夠為該屬的分類提供新的依據(jù)。

隨著種皮結(jié)構(gòu)逐漸多態(tài)性，已能夠為植物的分類提供新的有效信息[13-16]，并在20 世紀50年代時，已經(jīng)可以用在科、屬、種間進行物種鑒定[17]。2015年，江丹丹和周晶等曾將種皮紋飾作為劃分繡線菊屬（Spiraea L.）植物的依據(jù)，在其研究的25 種植物中，共發(fā)現(xiàn)有4 種類型的紋飾，而且差異顯著，可作為區(qū)分不同種類及種下分類群的依據(jù)[18]。2018年，苑景淇，薛歡等人對5 種忍冬屬植物（Lonicera L.）的種子進行了電鏡掃描，同樣是根據(jù)種皮紋飾進行分類，共分為兩類，為以后的分類學研究奠定基礎(chǔ)[19]。種皮微形態(tài)在多個屬中均可為種系分類提供依據(jù)，同樣，在蘋果屬這樣一個“困難屬”中，也可為其分類提供基礎(chǔ)資料，并且暫無人將種皮微形態(tài)作為蘋果屬的分類依據(jù)，因此此研究具有重要的奠基作用； 在亞顯微水平上，研究種皮微形態(tài)能為傳統(tǒng)的分類依據(jù)提供額外的微觀證據(jù)，指示出其系統(tǒng)地位。

本文在種皮的微形態(tài)特征方面進行研究，通過電鏡掃描和細致觀察，發(fā)現(xiàn)所研究的植物種皮細胞形狀主要有2 大類，短細胞和長細胞，可細分為8 種不同的類型，即圓邊多邊形、正六邊形、斜長方形、長五邊形、多邊形、細柱狀、長多邊形、細長帶狀； 紋飾類型有3 種，即無紋飾、微紋飾、縱向條狀皺紋，通過對種皮細胞和紋飾的比較，發(fā)現(xiàn)不同種間的差異，并進行分析討論，以期為本屬植物的分類提供新的依據(jù)，以此來區(qū)分屬內(nèi)類群的進化關(guān)系和親緣關(guān)系。

表1 蘋果屬植物種皮電鏡微形態(tài)實驗材料憑證標本Table 1 Specimen for the experiments of seeds coat of Malus

1 材料和方法

1.1 實驗材料

所選種子分別來自江蘇省植物研究所標本館(NAS)和南京林業(yè)大學標本館(NF)蠟葉標本，使所選日期相接近，并成熟。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理

先將材料置于超聲波下處理約1 min，然后在55℃下恒溫培養(yǎng)一夜，取出后，在表面噴金40 s，最后置于電子顯微鏡下對中皮表面微形態(tài)進行觀察。

1.2.2 觀察內(nèi)容

分別在350(或500)、1000、2000、3000、4000、5000、10000 倍下拍照，所選部分應(yīng)具有代表性并潔凈無污染。

2 結(jié)果

(1)臺灣林檎M.doumeri: 多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)不規(guī)則形，中間向內(nèi)凹陷(應(yīng)為外突，內(nèi)凹現(xiàn)象可能是高位掃描頭的顯示誤差)，凹陷程度或淺或深，細胞壁表面無紋飾(Plate I: Figure 1—2)。

(2)尖嘴林檎M.melliana: 多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)為不規(guī)則形，向外突出不均勻，細胞壁表面無紋飾(Plate I: Figure 3—5)。

(3)花冠海棠M.coronaria: 正六邊形，向外突出，突出程度較為均勻，少數(shù)地方有凹陷，細胞壁表面無紋飾(Plate I: Figure 6)。

(4)河南海棠M.honnanensis: 斜長方形，形狀邊界略微模糊，細胞壁表面輕微皺紋(Plate I: Figure 7)。

(5)西蜀海棠M.prattii: 六邊形，中間有輕微凹陷，整體比較平坦，細胞壁表面無紋飾(Plate I: Figure 8)。

(6)滇池海棠M.yunnanensis: 短長方形或長五邊形，邊界清晰，中間向內(nèi)凹陷，長寬比約為2:1，細胞壁表面無紋飾(Plate II: Figure 1—2)。

(7)保山海棠M.baoshanensis: 形狀不定，多變，外層表皮細胞在生長過程中首先發(fā)生破裂，形成管狀，然后由向內(nèi)的第二層細胞逐步形成新的種皮，細胞壁表面無紋飾(Plate II: Figure 3—5)。

(8)隴東海棠M.kansuensis: 長方形，整體平坦，長寬比約為3:1，細胞壁表面有皺紋，呈縱向排列，條狀(Plate II: Fig.6—8, Plate III: Figure 1—2 )。

(9)變?nèi)~海棠M.toringoides: 長方形，似長線，長寬比遠大于10:1，整體來看平坦，細胞壁表面有皺紋，較少，縱向分布，條狀(Plate III: Figure 3—6 )。

(10)花葉海棠M.transitoria: 長方形，排列不整齊，邊界往同一方向翹起，長寬約為2:1 或3:1，細胞壁表面有皺紋，數(shù)量較少，條狀(Plate III: Figure 7—8 )。

(11)小金海棠M.xiaojinensis: 長方形，中間凹陷較深，邊界明顯，長寬比多數(shù)約為2:1，有些是1:1，細胞壁表面無紋飾(Plate IV: Figure 1—2 )。

(12)三葉海棠M.toringo: 斜長方形，長寬比遠大于10:1，整體平坦，細胞壁表面皺紋，數(shù)量較少，縱向條狀(Plate IV: Figure 3—4 )。

(13)沙金海棠M.sargentii: 細長條狀，長寬比遠大于10:1，整體平坦，細胞壁表面有皺紋，縱向排列(Plate IV: Figure 5—8)。

(14)山荊子M.baccata: 細長條狀，長寬比遠大于10:1，細胞壁表面有皺紋，縱向排列(Plate V:Figure 1—2)。

(15)毛山荊子M.mandshurica subsp.: 細長長方形，長寬比遠大于10:1，細胞壁有少量縱向條狀皺紋(Plate V: Figure 3—4)。

(16)麗江山荊子M.rockii: 細長條狀，長寬比遠大于10:1，細胞壁表面有皺紋，縱向排列，少許褶皺有輕微扭曲(Plate V: Figure 5—6)。

(17)湖北海棠M.hupehensis: 神農(nóng)架所產(chǎn)種皮細胞長條狀，極細，整體平坦，長寬比遠大于10:1，細胞壁表面有皺紋，縱向排列，皺紋上有星星點點的不規(guī)則突起(Plate V: Figure 7—8)；而產(chǎn)于江蘇的細胞相對來說長寬比較小，邊界更為明顯，其上僅有少量皺紋，縱向排列，而無突起(Plate VI: Figure 1—3)。

Plate V.Figure 1 山荊子M.baccata 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 1 小金海棠M.xiaojinensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 1 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 1 滇池海棠M.yunnanensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 1 臺灣林檎M.doumeri 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 2 山荊子M.baccata 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 2 滇池海棠M.yunnanensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 2 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 2 滇池海棠M.yunnanensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 2 臺灣林檎M.doumeri 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 3 三葉海棠M.toringo 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 3 毛山荊子M.mandshurica subsp.種皮紋飾圖

Plate III.Figure 3 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 3 保山海棠M.baoshanensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 3 尖嘴林檎M.melliana 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 4 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 4 三葉海棠M.toringo 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 4 保山海棠M.baoshanensis 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 4 毛山荊子M.mandshurica subsp.種皮紋飾圖

Plate I.Figure 4 尖嘴林檎M.melliana 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 5 保山海棠M.baoshanensis 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 5 麗江山荊子M.rockii 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 5 沙金海棠M.sargentii 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 5 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 5 尖嘴林檎M.melliana 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 6 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 6 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 6 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 6 麗江山荊子M.rockii 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 6 花冠海棠M.coronaria 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 7 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 7 沙金海棠M.sargentii 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 7 花葉海棠M.transitoria 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 7 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 7 河南海棠M.honnanensis 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 8 沙金海棠M.sargentii 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 8 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 8 花葉海棠M.transitoria 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 8 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 8 西蜀海棠M.prattii 種皮紋飾圖

(18)多花海棠M.floribunda: 細長柱狀，長寬比遠大于10:1，整體平坦，細胞壁有縱向條紋，局部區(qū)域條紋上有顆粒狀突起(Plate VI: Figure 4—5)。

Plate VI.Figure 1 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate VI.Figure 2 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate VI.Figure 3 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate VI.Figure 5 多花海棠M.floribunda 種皮紋飾圖

3 分析與討論

根據(jù)蘋果屬種皮微形態(tài)顯示，其表面沒有形成復(fù)雜的特化結(jié)構(gòu)，而是直接以細胞的形式組成種皮，這樣可以更為直觀的觀察通過電鏡到種皮細胞的形狀和大小。類型主要有兩大類： 長寬等比的短細胞和長寬比遠超10:1 的長細胞，由短細胞演變?yōu)殚L細胞，體現(xiàn)了蘋果屬植物發(fā)展的不同趨勢，越原始的細胞長度越短；同樣，越進化的細胞長度也相對會更長。原始細胞的長寬比通常有固定數(shù)值，主要為原始蘋果亞屬、滇池海棠組、花楸蘋果組的部分種所有； 山荊子組的種皮細胞則呈長條狀或長帶狀。

（1）綠海棠組：僅檢測花冠海棠，種皮細胞呈正六邊形，向外突出，突出程度較為均勻，少數(shù)地方有凹陷，細胞壁表面無紋飾。

（2）多勝海棠組：檢測兩種，臺灣林檎和尖嘴林檎。臺灣林檎多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)不規(guī)則形，中間向內(nèi)凹陷(應(yīng)為外突，內(nèi)凹現(xiàn)象可能是高位掃描頭的顯示誤差)，凹陷程度或淺或深，細胞壁表面無紋飾。尖嘴林檎多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)為不規(guī)則形，向外突出不均勻，細胞壁表面無紋飾。共同點是均呈現(xiàn)近圓形的多邊形，每邊長度基本相等（等邊型），上組與之類似，在進化上都處于極為原始的形態(tài)。

（3）滇池海棠組：此時種皮細胞的長寬比逐漸加大，成為倍邊型，保山海棠頂面觀為近正五邊形，等邊型，細胞壁表面無紋飾，屬于較為原始的類群；西蜀海棠種皮細胞六邊形，但各邊不完全等長，有些邊稍微延長，但長寬比控制在兩倍以內(nèi)，未超過等邊型的范疇，因此與前者一樣，均為較為原始的類群，同樣也無紋飾；滇池海棠短長方形或長五邊形，邊界清晰，中間向內(nèi)凹陷，長寬比約為2:1，已超過等邊型的范疇，完全屬于倍邊型，細胞壁表面無紋飾，比前兩者的進化程度都要高，更近一層；河南海棠斜長方形，長寬比超過兩倍，形狀邊界略微模糊，細胞壁表面輕微皺紋，比滇池海棠更為進化，屬于本組最進化的種。這一結(jié)果與形態(tài)、葉表皮微形態(tài)分析的結(jié)果相似。

（4）花楸蘋果組：本組細胞比前一組的長度更長，前組長寬比超過兩倍的不多，而本組則全部超過兩倍，處于3～5 倍的水平，但仍屬于倍邊型范圍。隴東海棠長方形，整體平坦，長寬比約為3:1，細胞壁表面有皺紋，呈縱向排列，條狀。小金海棠也是長方形，中間凹陷較深，邊界明顯，長寬比多數(shù)約為2:1，有些是1:1，細胞壁表面無紋飾，小金海棠與變?nèi)~海棠雖然都是長方形，但變?nèi)~海棠的長寬比遠大于10 倍，因此將小金海棠歸為變?nèi)~海棠顯的并不是很合理，歸為隴東海棠反而更合適，長寬比相接近，并且也都是長方形；變?nèi)~海棠長方形，似長線，長寬比遠大于10:1，整體來看平坦，細胞壁表面有皺紋，較少，縱向分布，條狀，遠超倍邊型的范圍，與山荊子組較為相似；花葉海棠長方形，排列不整齊，邊界往同一方向翹起，長寬約為2:1 或3:1，仍屬于倍邊型的范疇內(nèi)，細胞壁表面有皺紋，數(shù)量較少，條狀，由此可知，變?nèi)~海棠與花葉海棠的關(guān)系并不是很近，分子系統(tǒng)學以及化學分類學分析的結(jié)果與此相符，因此二者間的關(guān)系還有待研究。

（5）山荊子組：該組種皮細胞均為細長帶形或長條形，長寬比遠超10 倍，是最進化的類群。由于形狀、特征相似，所以難以區(qū)分，無法細分到具體的種。只有湖北海棠能分為兩種，神農(nóng)架所產(chǎn)種皮細胞長條狀，極細，整體平坦，長寬比遠大于10:1，細胞壁表面有皺紋，縱向排列，皺紋上有星星點點的不規(guī)則突起；而產(chǎn)于江蘇的細胞相對來說長寬比較小，邊界更為明顯，其上僅有少量皺紋，縱向排列，而無突起；多花海棠局部區(qū)域條紋上有顆粒狀突起。

傳統(tǒng)的分類學觀點認為，綠海棠組和多勝海棠組處于最原始的狀態(tài)，滇池海棠組和花楸蘋果組則處于中間位置，山荊子組是最為進化的類群，以上均與本研究結(jié)果相一致，因此，種皮細胞微形態(tài)能夠為蘋果屬植物的分類提供有效的依據(jù)。種皮細胞由等徑開始，然后長寬比的倍數(shù)逐漸加大，最后長寬比可達10 倍以上，可知物種是在不斷進化的，長寬比倍數(shù)越大，進化越快，可見種皮細胞能體現(xiàn)各組間的演化關(guān)系。在紋飾方面，對于等邊型的類群來說，紋飾多呈向心狀或無紋飾，隨著長寬比逐漸加大，其紋飾也越來越明顯，多呈縱向條狀排列，由紋飾也能夠看出各組間的演化關(guān)系。不只能夠作為分類的依據(jù)，還能夠解決分類學上的一些疑難問題。綜上，本研究能夠為該屬植物的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究提供新依據(jù)，為之后種皮微形態(tài)的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究所拍攝的種皮紋飾并不是非常完美，還有待進一步加強。