楊青青，陸強，劉佳

（蘇北人民醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 揚州225001）

嬰幼兒階段是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的高峰期和敏感期，該階段神經(jīng)系統(tǒng)可塑性強，易受外界刺激[1]。有研究顯示，圍生期使用麻醉藥物可能產(chǎn)生神經(jīng)毒性，損傷神經(jīng)元，進(jìn)而影響認(rèn)知功能[2]。依托咪酯是臨床圍生期患兒手術(shù)常用的全身麻醉藥[3]。有研究表明，依托咪酯可通過興奮γ-氨基丁酸受體，抑制神經(jīng)系統(tǒng)興奮，產(chǎn)生麻醉效果，但其對中樞神經(jīng)元的影響及對遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響尚存在爭議[4]。另有研究表明，中樞膽堿能系統(tǒng)，尤其是煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）功能與認(rèn)知功能關(guān)系密切[5]。本研究通過觀察新生大鼠依托咪酯暴露后的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能變化，并觀察nAChR 功能的變化，為臨床研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD 大鼠，48 只，7 d 齡，均為雄性，體質(zhì)量10～15 g，飼養(yǎng)于揚州大學(xué)動物實驗中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2017-0007，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0044。

1.2 主要試劑與儀器

依托咪酯注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32022379，規(guī)格10 ml：20 mg，批號20191022），α7nAChR 激動劑PNU-282987（北京百奧萊博科技有限公司，純度99.37%，規(guī)格10 mg，貨號M06398）。兔抗大鼠α7nAChR、乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）單抗購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 單抗（北京博生福生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號IG101），α7nAChR 和AChE 引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。XR-XY1032 Y 型電迷宮（上海欣軟信息科技有限公司），3-15 實驗室通用型離心機(jī)（德國SIGMA 公司），MRX A2000 型酶標(biāo)儀（韓國K LAB OPTIZEN 公司），ABI 7500 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（美國Applied Biosystems公司），DYY-6D 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及干預(yù) 將48 只新生大鼠隨機(jī)分為3 組：對照組、依托咪酯組、激動劑組，每組16 只。根據(jù)藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算等效劑量[6]，對照組、依托咪酯組、激動劑組分別單次腹腔注射生理鹽水10 ml/kg、依托咪酯5 mg/kg、依托咪酯5 mg/kg + α7nAChR 激動劑PNU-282987 5 mg/kg。

1.3.2 認(rèn)知功能行為學(xué)測試 麻醉清醒后2 h，各組隨機(jī)取8 只大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試，各組剩余8 只飼養(yǎng)至第4 周再進(jìn)行行為學(xué)測試。在安靜、環(huán)境溫度（24±2）℃條件下開展測試，所有測試由同一實驗人員完成。①洞板實驗：將新生大鼠放入洞板實驗箱（21 cm×21 cm 平臺，平臺高出臺面15 cm，平臺均勻分布16 個洞）中央，統(tǒng)計3 min 內(nèi)探洞次數(shù)[7]。②Y 電迷宮實驗：將大鼠放入Y 電迷宮，自由活動5 min 適應(yīng)環(huán)境，采用隨機(jī)不休息法，測試20 次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時間[8]。以受電擊后從起步區(qū)逃至安全區(qū)或通電10 s 內(nèi)直接跑至安全區(qū)為正確反應(yīng)次數(shù)；完成20 次測試時所需總反應(yīng)時間（通電至大鼠第一次逃至燈亮區(qū)的時間，包括正確反應(yīng)和錯誤反應(yīng)所需時間）。

1.3.3 海馬組織α7nAChR、AChE mRNA 的檢測 取完成行為學(xué)測試的各組大鼠（麻醉清醒后2 h 和4 周各組8 只），用二氧化碳CO2窒息處死，斷頭取雙側(cè)海馬組織，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。采用Trizol 法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，獲得cDNA，行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）反應(yīng)，按照試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性25 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，共38 次循環(huán)，擴(kuò)增至熒光信號閾值所需循環(huán)次數(shù)，以肌動蛋白（βactin）為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計算目的基因相對表達(dá)量。qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 海馬組織α7nAChR、AChE 蛋白的檢測 各組8 只，取-80℃保存海馬組織，冰上勻漿，加入放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液冰上孵育20 min，12 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清，測定總蛋白含量。取待測蛋白40 μg與等量上樣緩沖液混勻，100℃水浴變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離[9]，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用TBST洗滌后加入1∶400稀釋一抗，4℃孵育過夜，TBST 再次洗滌，加入1∶2 000 稀釋的二抗，37℃孵育1.5 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯影，蛋白相對表達(dá)量以α7nAChR、AChE與內(nèi)參β-actin 的灰度值比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依托咪酯對新生大鼠認(rèn)知功能的影響

新生大鼠麻醉清醒后2 h，對照組、依托咪酯組、激動劑組洞板實驗探洞次數(shù)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：依托咪酯組少于對照組和激動劑組（P＜0.05）。3 組Y 電迷宮實驗中正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組大鼠麻醉清醒后2 h認(rèn)知功能比較 （n=8，±s）

表2 3組大鼠麻醉清醒后2 h認(rèn)知功能比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與依托咪酯組比較，P ＜0.05。

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新生大鼠麻醉清醒后4 周，對照組、依托咪酯組、激動劑組洞板實驗探洞次數(shù)、Y 電迷宮實驗中正確反應(yīng)次數(shù)及全天總反應(yīng)時間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組大鼠麻醉清醒后4周遠(yuǎn)期認(rèn)知功能比較（n=8，±s）

表3 3組大鼠麻醉清醒后4周遠(yuǎn)期認(rèn)知功能比較（n=8，±s）

組別對照組洞板實驗探洞次數(shù)17.35±2.26 Y電迷宮實驗正確反應(yīng)次數(shù)14.51±3.63全天總反應(yīng)時間/s 64.94±10.98依托咪酯組激動劑組F 值P 值16.47±3.45 18.52±2.87 0.690 0.513 14.17±3.94 15.20±4.18 0.118 0.889 65.82±9.60 63.49±10.19 0.104 0.902

2.2 依托咪酯對海馬組織α7nAChR、AChE mRNA表達(dá)的影響

新生大鼠麻醉清醒后2 h，對照組、依托咪酯組、激動劑組海馬組織α7nAChR、AChE mRNA 相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：依托咪酯組海馬組織α7nAChR mRNA 相對表達(dá)量低于對照組和激動劑組（P＜0.05），AChE mRNA 相對表達(dá)量高于對照組和激動劑組（P＜0.05）。新生大鼠麻醉清醒后4 周，3 組α7nAChR、AChE mRNA 相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE mRNA相對表達(dá)量比較 （n=8，±s）

表4 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE mRNA相對表達(dá)量比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與依托咪酯組比較，P ＜0.05。

組別對照組α7nAChR mRNA 2 h 1.11±0.11 4周1.15±0.12 AChE mRNA 2 h 0.71±0.09 4周0.92±0.10依托咪酯組激動劑組F 值P 值0.46±0.07①0.87±0.09②117.567 0.000 1.09±0.11 1.13±0.12 0.263 0.771 1.14±0.13①0.88±0.09②41.895 0.000 0.98±0.11 0.91±0.12 1.058 0.365

2.3 依托咪酯對海馬組織α7nAChR、AChE 蛋白表達(dá)的影響

新生大鼠麻醉清醒后2 h，對照組、依托咪酯組、激動劑組海馬組織α7nAChR、AChE 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：依托咪酯組海馬組織α7nAChR 蛋白相對表達(dá)量低于對照組和激動劑組（P＜0.05），AChE 蛋白相對表達(dá)量高于對照組和激動劑組（P＜0.05）。新生大鼠麻醉清醒后4 周，3 組α7nAChR、AChE 蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5和圖1。

表5 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE蛋白相對表達(dá)量比較 （n=8，±s）

表5 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE蛋白相對表達(dá)量比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與依托咪酯組比較，P ＜0.05。

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圖1 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE蛋白的表達(dá)

3 討論

依托咪酯是咪唑類衍生物，屬于非巴比妥類短效麻醉藥，具有起效快、無明顯呼吸抑制、恢復(fù)迅速等優(yōu)點，廣泛用于臨床麻醉及麻醉誘導(dǎo)[10]。有研究顯示，依托咪酯用于胃癌根治術(shù)、老年骨折手術(shù)的麻醉對認(rèn)知功能影響較小，同時有利于穩(wěn)定血流動力學(xué)[11-12]。本研究以7 d 齡新生大鼠（相當(dāng)于人類1 歲內(nèi)嬰幼兒）為研究對象，觀察依托咪酯暴露后對認(rèn)知功能的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，麻醉清醒后2 h，依托咪酯組洞板實驗探洞次數(shù)減少，Y 電迷宮實驗中正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時間無明顯變化。麻醉清醒后4 周，依托咪酯組洞板實驗探洞次數(shù)、Y 電迷宮實驗中正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時間無明顯變化，說明依托咪酯暴露可影響一過性影響新生大鼠近期探索能力，對近期學(xué)習(xí)記憶能力無明顯影響。依托咪酯屬于咪唑類全身麻醉藥，作用時間短，對循環(huán)呼吸及血流動力學(xué)影響小，在臨床中多用于老年患者，尤其是血流動力學(xué)不穩(wěn)定、危重癥患者[13]。有研究顯示，依托咪酯用于老年患者骨折術(shù)中麻醉誘導(dǎo)和維持，血清皮質(zhì)醇和氧化應(yīng)激水平得到改善，手術(shù)前后認(rèn)知功能無變化[14]。

此外，本研究中新生大鼠麻醉清醒后2 h，依托咪酯組海馬組織α7nAChR mRNA 和蛋白相對表達(dá)量降低，AChE mRNA 和蛋白相對表達(dá)量升高；麻醉清醒后4 周，α7nAChR、AChE mRNA 和蛋白相對表達(dá)量無明顯變化，提示依托咪酯暴露可一過性下調(diào)α7nAChR，上調(diào)AChE 的表達(dá)。nAChR 屬于配體門控離子通道蛋白，分布于神經(jīng)元突觸及軸突區(qū)域，包括神經(jīng)型和肌肉型，其中神經(jīng)型nAChR 功能復(fù)雜多樣，與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，如隨意運動、記憶、情緒等關(guān)系密切[15-16]。nAChR 參與機(jī)體多種受體功能調(diào)節(jié)過程，且具有神經(jīng)保護(hù)作用。左紅艷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，微波輻射暴露可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能損傷，證實與海馬組織中nAChR 代謝紊亂有關(guān)。α7nAChR 是nAChR 的亞型之一，高表達(dá)于海馬和皮層組織中，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放及突觸的可塑性調(diào)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病患者存在α7nAChR 異常低表達(dá)、nAChR 代謝紊亂現(xiàn)象，推測與認(rèn)知功能下降有關(guān)[18-19]。本研究采用α7nAChR 激動劑PNU-282987 干預(yù)后，新生大鼠麻醉清醒后2 h，與依托咪酯組比較，激動劑組洞板實驗探洞次數(shù)增加，α7nAChR mRNA 和蛋白相對表達(dá)量升高，AChE mRNA 和蛋白相對表達(dá)量降低；而麻醉清醒后4 周洞板實驗、Y 電迷宮實驗及α7nAChR、AChE mRNA 和蛋白相對表達(dá)量無明顯變化，提示依托咪酯暴露對新生大鼠探索能力的一過性影響，可能是通過抑制海馬nAChR 功能實現(xiàn)。

綜上所述，新生大鼠咪酯麻醉對近期學(xué)習(xí)記憶能力和遠(yuǎn)期認(rèn)知能力無明顯影響，但可一過性影響新生大鼠近期探索能力，可能與抑制海馬nAChR 功能有關(guān)。在進(jìn)一步研究中將研究依托咪酯暴露是否能通過其他信號通路對新生大鼠近期探索能力產(chǎn)生影響，為臨床使用咪酯麻醉提供理論參考。