李鳳偉，彭夢(mèng)黎，朱袁平，高文彬，余曉紅*

1(鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城，224051)2(滄州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 滄州，061001)

手掌參(GymnadeniaconopseaR.Br.)系蘭科手掌參屬多年生草本植物手參或粗脈手參的塊莖，主要分布于西藏、四川、云南、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古及東北等地區(qū)[1]。常用于蒙、藏藥中，具有止咳平喘、益腎健脾、理氣和血、止痛、抗氧化、抗腫瘤等功效[2-4]。手掌參除具有很高的藥用價(jià)值外，在西藏等地區(qū)手掌參常被作為泡酒、褒湯和烹煮的滋補(bǔ)食品使用，是一種藥食同源植物。手掌參不但含有蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有皂苷、甾醇、酚酸、生物堿、多糖等活性成分[5-6]。

多糖廣泛分布于植物物體內(nèi)，具有提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂、降血糖等作用，已被作為藥品、保健品和功能食品的添加劑使用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，提取方法對(duì)多糖提取率和生物活性具有一定的影響作用，因此篩選高效的提取方法對(duì)研究多糖具有重要意義[9-10]。多糖是手掌參主要活性成分之一，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于手掌參多糖研究報(bào)道較少，提取手掌參多糖的方法有熱水提取法和超聲輔助提取法2種方法[11-12]，因此手掌參多糖具有很好的研究開發(fā)前景。自由基具有強(qiáng)氧化性，它能夠使生物膜中多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)物增多，失去細(xì)胞本身的作用，最終引起細(xì)胞功能積累性退化衰老，對(duì)機(jī)體造成不可逆損傷。研究表明，多糖具有很好的清除自由基作用，并且與合成的抗氧化劑相比，天然的多糖具有低毒、副作用小、來(lái)源廣等特點(diǎn)。因此多糖的清除自由基能力常作為評(píng)價(jià)其抗氧化活性的重要指標(biāo)[13-14]。本文采用不同提取方法獲得手掌參多糖的提取物，并對(duì)多糖體外抗氧化活性進(jìn)行比較，分析不同提取方法對(duì)手掌參多糖理化性質(zhì)和抗氧化活性的影響，為手掌參多糖功能性食品開發(fā)提供依據(jù)，有助于提升其藥食兩用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

手掌參，四川小金縣，烘干、粉碎后備用；單糖標(biāo)準(zhǔn)品、纖維素酶(10 000 U/g)、間羥基聯(lián)苯、DPPH、ABTS、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP)，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；XH-300UL電腦微波超聲波紫外光組合催化合成儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XO-SM50超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐生物科技有限公司；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國(guó)；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；FTIR-8404傅里葉紅外交換光譜儀，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

手掌參粉末用石油醚回流脫脂，過(guò)濾，粉末揮干石油醚備用。

1.3.2 手掌參多糖的制備

稱取2.0 g預(yù)處理的手掌參樣品5份，分別按1∶30 (g∶mL)的料液比加入蒸餾水，90 ℃下提取3 h；磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)、10%纖維素酶(以手掌參質(zhì)量計(jì))、50 ℃下提取40 min，沸水浴滅酶活5 min；蒸餾水、超聲功率280 W、50 ℃下提取40 min；磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)、10%纖維素酶(以手掌參質(zhì)量計(jì))、超聲功率280 W、50 ℃下提取40 min，沸水浴滅酶活5 min；蒸餾水、微波頻率450 W、50 ℃下提取15 min。提取結(jié)束后，5 000 r/min離心15 min，提取液濃縮至約30 mL，加入4倍體積95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇沉淀24 h，5 000 r/min 離心15 min，沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到熱水法提取手掌參多糖(Gymnadeniaconopseapolysaccharides extracted by hot water，GCP-H)、酶輔助法提取手掌參多糖(Gymnadeniaconopseapolysaccharides extracted by enzyme，GCP-E)、超聲輔助法提取手掌參多糖(Gymnadeniaconopseapolysaccharides extracted by ultrasonic,GCP-U)、超聲-酶輔助法提取手掌參多糖(Gymnadeniaconopseapolysaccharides extracted by ultrasonic-enzyme，GCP-UE)、微波輔助法提取手掌參多糖(Gymnadeniaconopseapolysaccharides extracted by microwave，GCP-M)。

1.3.3 手掌參多糖提取率

分別將5種手掌參多糖樣品用蒸餾水溶解后定容至100 mL，再稀釋一定倍數(shù)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖濃度[15]，按如下公式計(jì)算多糖提取率。

手掌參多糖提取率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：C為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為多糖溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為稱取的手掌參粉末質(zhì)量，g。

1.3.4 手掌參多糖一般理化性質(zhì)分析

采用苯酚-硫酸法測(cè)定中性糖含量、間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量[16]、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[17]。

1.3.5 單糖組成分析[18-20]

1.3.5.1 多糖組分酸水解

分別稱取10 mg 5種手掌參多糖置于密封的水解瓶中，加入4 mL 4 mol/L三氟乙酸，110 ℃水解5 h。加入適量無(wú)水乙醇，氮?dú)獯蹈芍翢o(wú)酸味。

1.3.5.2 PMP衍生

分別稱取5 mg葡萄糖(glucose，Glc)、甘露糖(D-mannose，Man)、葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid，GlcA)、鼠李糖(L-rhamnose monohydrate，Rha)、半乳糖醛酸(D-galacturonic acid，GalA)、木糖(xylose，Xyl)6種單糖標(biāo)準(zhǔn)品置于容器中，再分別向水解蒸干的樣品和6種單糖標(biāo)準(zhǔn)品中加入200 μL 0.5 mol/L PMP溶液和200 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)30 min。待冷卻后，反應(yīng)液用0.3 mol/L HCl溶液調(diào)至中性，加入2 mL蒸餾水和4 mL乙酸異戊酯，渦旋混勻后靜置10 min，除去上層溶液，重復(fù)萃取2次。取下層溶液，加入4 mL氯仿，渦旋混勻后靜置10 min，除去下層溶液，取上清液用蒸餾水定容至5 mL，過(guò)0.22 μm濾頭后備用。

1.3.5.3 分析條件

Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱為Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1 mol/L 乙酸胺-乙腈溶液[V(乙酸胺)∶V(乙腈)=83∶17]，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.6 紅外光譜分析

將5種多糖樣品與 KBr 壓制成片，采用紅外光譜儀在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍測(cè)定光譜吸收值。

1.3.7 抗氧化性分析

將5種多糖樣品和維生素C分別配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL 5個(gè)濃度梯度溶液，備用。

1.3.7.1 對(duì)羥自由基的清除作用[21]

反應(yīng)體系中加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、2 mL待測(cè)多糖溶液、2 mL 10 mmol/L H2O2溶液，混勻，37 ℃水浴30 min，510 nm測(cè)吸光度值記為A樣品。用蒸餾水代替水楊酸，按上述方法測(cè)定吸光度A對(duì)照。用蒸餾水代替多糖提取液， 按上述方法測(cè)定吸光度A空白，維生素C做陽(yáng)性對(duì)照，羥自由基清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.3.7.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用[22]

取2 mL多糖溶液，加入2 mL 0.05 mg/mL DPPH乙醇溶液，混勻，暗室反應(yīng)30 min，517 nm測(cè)吸光度值記為A樣品，用蒸餾水代替 DPPH溶液，按上述方法測(cè)定吸光度A對(duì)照。用無(wú)水乙醇代替多糖溶液按上述方法測(cè)定吸光度為A空白，維生素C做陽(yáng)性對(duì)照，DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

1.3.7.3 對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用[23]

取10 mL 7 mmol/L ABTS溶液和10 mL 4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混勻，于室溫、暗處反應(yīng)16 h后用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋使其在734 nm下吸光度值為0.7左右，得到ABTS工作液。取0.1 mL待測(cè)多糖溶液，加入3.9 mL ABTS工作液，混勻，靜置6 min，734 nm測(cè)吸光度值記為A1。用蒸餾水代替多糖樣品做空白對(duì)照記為A0，維生素C做陽(yáng)性對(duì)照，按公式(4)計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率：

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)手掌參多糖提取得率的影響

5種手掌參多糖提取率結(jié)果如圖1所示。方差分析顯示，5種不同提取方法得到的手掌參多糖提取率差異顯著(P<0.05)，多糖提取率由高到低依次為：GPS-E、GPS-UE、GPS-U、GPS-H、GPS-M。通過(guò)提取率的比較可知，采用酶輔助提取方法所得多糖的提取率最高，原因可能是手掌參中多糖部分與細(xì)胞壁的纖維素和半纖維素結(jié)合，纖維素酶能夠水解和破壞纖維素空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的多糖擴(kuò)散到溶劑中，該結(jié)果與蘇平等[24]研究結(jié)果一致。有研究表明超聲功率和時(shí)間會(huì)對(duì)纖維素酶活力產(chǎn)生影響[25]，本研究的超聲條件可能導(dǎo)致了纖維素酶活力減弱，使得超聲-酶輔助法的提取率低于酶輔助法。超聲-酶輔助提取和超聲輔助提取多糖得率高于熱水提取法，同時(shí)超聲輔助提取所用的時(shí)間比熱水提取的短，超聲波的空化效應(yīng)對(duì)原料的組織和細(xì)胞壁產(chǎn)生了破壞作用，使原料和溶劑之間有更大的接觸面積，多糖更易溶出，提高了提取效率。超聲-酶輔助法提取率高于超聲輔助法，可能是纖維素酶協(xié)助超聲提取可以破壞植物組織的細(xì)胞壁，加速胞內(nèi)多糖的溶出。微波輔助法手掌參多糖提取率最低，一方面原因可能是微波較高功率破壞了手掌參多糖的結(jié)構(gòu)，另一方面原因可能是微波頻率的振動(dòng)增加了手掌參細(xì)胞內(nèi)其他小分子物質(zhì)的加劇溶出從而降低了手掌參多糖的提取率[26]。因此，采用微波輔助法提手掌參多糖時(shí)，需要將提取條件控制在相對(duì)較溫和的條件下。

圖1 提取方法對(duì)手掌參多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction methods on extraction yields of Gymnadenia conopsea polysaccharides注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.2 提取方法對(duì)手掌參多糖理化性質(zhì)的影響

如表1所示，5種方法制備的多糖中都含少量與糖類基團(tuán)緊密相連的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其中超聲輔助提取法中所含的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他方法，可能是超聲波對(duì)手掌參的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)造成了更大的破壞，釋放出了更多的非多糖成分。5種多糖中糖醛酸含量均較低，說(shuō)明手掌參多糖為中性多糖。此結(jié)果與張曉紅等[27]結(jié)果一致。

表1 手掌參多糖基本化學(xué)組成 單位:%Table 1 The chemical compositions of Gymnadenia conopsea polysaccharides

2.3 單糖組成分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用PMP柱前衍生法檢測(cè)手掌參多糖的單糖組成，通過(guò)比較圖2標(biāo)準(zhǔn)品和圖3樣品衍生物的保留時(shí)間定性分析結(jié)果，5種手掌參多糖水解PMP衍生物中均含有Man和Glc兩種單糖。結(jié)果表明手掌參中的多糖屬于葡甘聚糖，這與張曉紅等[28]研究結(jié)果一致。提取方法對(duì)手掌參多糖單糖組成種類沒(méi)有影響，但是對(duì)2種單糖的含量會(huì)有影響。

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生物HPLC色譜圖Fig.2 HPLC spectra of PMP derivatives of the standard monosaccharides

圖3 手掌參多糖水解PMP衍生物HPLC色譜圖Fig.3 HPLC spectra of PMP derivatives of monosaccharides from Gymnadenia conopsea polysaccharides

2.4 紅外光譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用紅外光譜對(duì)幾種不同提取方式提取的手掌參多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，結(jié)果如圖4 所示。5種多糖在4 000～500 cm-1均具有糖類物質(zhì)特征基團(tuán)吸收峰。3 365 cm-1處強(qiáng)而寬的吸收峰是多糖分子內(nèi)和分子間O—H伸縮振動(dòng)的結(jié)果。2 926 cm-1附近的吸收峰是CH2和CH3的C—H伸縮振動(dòng)形成的。1 027 cm-1附近的拉伸峰是由糖環(huán)C—O—C或C—O—H的拉伸形成的，為吡喃環(huán)的特征吸收峰[29]。874、870 cm-1是β-糖苷鍵的特征吸收峰。從圖4紅外光譜可知，5種方法提取的手掌參多糖紅外光譜圖基本一致，只是指紋區(qū)略有差異，表明提取方法對(duì)手掌參多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生影響，研究結(jié)果與劉江等[30]結(jié)果一致。

圖4 手掌參多糖紅外光譜圖Fig.4 Fourier transform infrared spectra of Gymnadenia conopsea polysaccharides

2.5 提取方法對(duì)手掌參多糖抗氧化活性的影響

2.5.1 對(duì)羥自由基的清除作用

羥自由基是一種反應(yīng)性極強(qiáng)的化學(xué)分子，作為損傷作用最強(qiáng)的自由基，能夠很容易穿過(guò)生物的細(xì)胞膜，與多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷或細(xì)胞死亡，因此清除羥自由基對(duì)于維持生命系統(tǒng)的健康狀態(tài)十分重要。由圖5可以看出，5種方法提取的手掌參多糖對(duì)羥自由基都有一定的清除作用，其清除能力隨多糖質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，GCP-E的清除作用最強(qiáng)，其清除率達(dá)到61.33%。原因可能是在酶解條件下，多糖結(jié)構(gòu)中更多的活性基團(tuán)得以暴露，從而提升了多糖的抗氧化能力[31]。

圖5 手掌參多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of Gymnadenia conopsea polysaccharides on hydroxyl free radical

2.5.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖6可以看出，5種方法提取的手掌參多糖對(duì)DPPH自由基清除能力隨多糖濃度的增大而增強(qiáng)。GCP-E清除DPPH自由基作用強(qiáng)于其他4種多糖，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)可到78.98%。有研究表明，多糖聚合度、單糖組成及糖苷鍵類型與DPPH自由基的清除能力有關(guān)[32]。

圖6 手掌參多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of Gymnadenia conopsea polysaccharides on DPPH free radicals

2.5.3 對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用

由圖7可以看出，手掌參多糖對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力隨多糖質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，但對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用顯著低于羥自由基和DPPH自由基。在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，GCP-U對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基發(fā)揮了較好的清除作用，其清除率為45.01%。GCP-M對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力低于其他4種多糖，這可能與微波處理改變了多糖構(gòu)象影響了其對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力有關(guān)，此結(jié)果與黃玉龍等[33]研究結(jié)果一致。

圖7 手掌參多糖對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of Gymnadenia conopsea polysaccharides on ABTS cationic free radicals

5種手掌參多糖對(duì)3種自由基的清除作用均低于陽(yáng)性對(duì)照維生素C的活性，這可能與手掌參多糖的單糖組成、分子質(zhì)量、連接方式等因素有關(guān)，其提供電子的基團(tuán)種類和數(shù)量與維生素C相比有一定差異。研究表明，多糖中糖醛酸含量與抗氧化活性呈正相關(guān)[34]，本研究發(fā)現(xiàn)5種方法制備的手掌參多糖均為中性多糖，這可能是其清除自由基活性低于維生素的原因之一。關(guān)于手掌參多糖的精制、結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系還有待于進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

采用了5種提取方法：熱水、酶輔助、超聲輔助、超聲-酶輔助、微波輔助法提取手掌參中的多糖，分別得到GCP-H、GCP-E、GCP-U、GCP-UE和GCP-M 5 種多糖。不同提取方法對(duì)手掌參多糖提取率有顯著影響(P<0.05),其中酶法提取的得率最高，為25.6%。5種多糖都富含中性糖，含量均高于75%，且含有少量蛋白質(zhì)。單糖組成結(jié)果表明，得到的5種多糖樣品單糖組成成分相同，主要由甘露糖和葡萄糖組成，但不同樣品的單糖比例有所不同。紅外光譜顯示，不同方法提取的多糖均具有多糖的特征官能團(tuán)，說(shuō)明提取方法不會(huì)對(duì)手掌參多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。對(duì)5種手掌參多糖的羥自由基、DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除作用進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)5種方法制備的手掌參多糖具有不同程度的抗氧化活性，呈劑量依賴性。其中，酶和超聲輔助提取的多糖在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性，說(shuō)明酶和超聲輔助提取的方法可能對(duì)多糖的生物活性產(chǎn)生了有利的影響。綠色提取技術(shù)已成為提取研究熱點(diǎn)和方向，酶和超聲2種輔助提取法具有提取時(shí)間短、溶劑環(huán)保、產(chǎn)品回收率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)。因此，可將酶或超聲輔助提取法作為提取功能性手掌參多糖的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為手掌參多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。