歐紅艷，趙良忠*，李明,3，周曉潔

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽，422000)2(豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽，422000) 3(廣州佳明食品科技有限公司，廣東 廣州，510000)

豆清液是指在傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)過程中蹲腦與壓榨時(shí)產(chǎn)生的上清液，俗稱黃漿水[1]。豆清液中含有豐富的大豆異黃酮、低聚糖、蛋白質(zhì)、脂肪[2]，豆清飲料以豆清液為主要原料，通過添加輔料、菌種進(jìn)行發(fā)酵而成[3]。傳統(tǒng)利用豆清液方法主要包括物理方法回收利用功能物質(zhì)和微生物/酶法生產(chǎn)新化合物、功能性飲料生產(chǎn)和生物燃料等[4]。而豆清飲料既能解決豆清液排放引起的環(huán)境問題，又可以提高代謝產(chǎn)物，近年來被廣泛研究。

大豆異黃酮廣泛存在于豆科植物中，大豆種子中尤為豐富，在加工過程中，部分大豆異黃酮會流失到豆清液中[5]。大豆異黃酮具有多種生理功能，如抗氧化、抑制乳腺癌、前列腺癌、防治骨骼疏松癥、預(yù)防動脈硬化癥[6]等。其中染料木素是植物雌激素，除了具有上述功能特性之外，還能抑制脂肪細(xì)胞中脂肪的生成、降低膽固醇與甘油三酯、抗骨質(zhì)疏松等[7]。限制豆清液廣泛利用的主要原因之一是豆清液具有豆腥味、蘑菇味與青草味等不良風(fēng)味物質(zhì)，普通人很難接受該風(fēng)味，如果能夠?qū)⒉涣硷L(fēng)味降低到痕量水平具有重要研究意義。

本研究以豆清液為主要原料，通過添加鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmarxianus)、克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)進(jìn)行混菌發(fā)酵，探究豆清飲料發(fā)酵過程中大豆異黃酮、有機(jī)酸與風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律。對豆清液的綜合應(yīng)用及實(shí)際生產(chǎn)有很大意義，為豆清液發(fā)酵制備新型飲料開發(fā)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆清液、克魯維酵母、明串珠菌、鼠李糖乳桿菌，豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；大麥芽、麥芽糖、低聚果糖、酒花，市售；L-乳酸、L-酒石酸、琥珀酸、檸檬酸、富馬酸、丙酮酸、黃豆黃素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、黃豆黃素苷元，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IS-RDD3型臺式恒溫振蕩器，蘇州捷美電子有限公司；SB-5200 DTD型超聲清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華有限責(zé)任公司；VELOCITY 18R 型高速冷凍離心機(jī)，澳大利亞 Dynamica 公司；ULtiMate 3000型高效液相色譜儀，美國賽默飛有限公司；Agilent 7890A-5 975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；HP-INNOWax色譜柱(60 mm×320 mm，0.25 μm)，手動固相微萃取進(jìn)樣器50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(57328-U)，美國Supelco公司；

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生產(chǎn)工藝流程

豆清液過濾→添加配料→調(diào)節(jié)pH→滅菌→接種→發(fā)酵→離心→豆清飲料

豆清液過濾，添加低聚果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、酒花質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%，麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，調(diào)節(jié)pH 6.0，105 ℃、8 min進(jìn)行滅菌之后接種，接種量5%、菌液濃度108CFU/mL，菌液的制備：菌種分別在MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，分別接種于5 mL滅菌的豆清液培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，對已馴化的微生物分別先后以3%的接種量于28 ℃，24 h培養(yǎng)條件下進(jìn)行100、500 mL兩級擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，克魯維酵母、明串珠菌、鼠李糖乳桿菌按照1∶1∶1的比例進(jìn)行復(fù)配。28 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每隔2 h取樣測指標(biāo)的變化情況，22 h結(jié)束發(fā)酵。

1.3.2 大豆異黃酮測定

參照GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法》[8]，并做一定調(diào)整，取15 mL 樣品轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加入35 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))甲醇，室溫超聲處理提取1 h。將樣品提取液在5 000 r/min下離心12 min，離心之后的樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用10%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶，均勻取1 mL樣品提取液在10 000 r/min下離心10 min，吸取1 mL離心后的液體通過0.45 μm的濾膜，供高效液相色譜儀測定，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。色譜柱參數(shù)：流動相A為0.1%乙酸溶液、流動相B為0.1%乙酸乙腈溶液、波長260 nm、流速1 mL/min、柱溫40 ℃、進(jìn)樣量20 μL。根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度的關(guān)系建立線性回歸方程，見表1。

表1 大豆異黃酮回歸方程Table 1 Regression equation of soybean isoflavones

1.3.3 有機(jī)酸測定

參考王容等[9]的方法，并稍作修改，取樣液5 mL，在10 000 r/min下離心20 min，取上清液1 mL，過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜儀測定。液相色譜條件：色譜柱為CAPE-CELL PAK MG-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，流動相V(甲醇)∶V(pH=2.65 0.01 mol/L KH2PO4溶液)=3∶97；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度的關(guān)系建立線性回歸方程，見表2。

表2 有機(jī)酸回歸方程Table 2 Regression equation of organic acids

1.3.4 風(fēng)味物質(zhì)測定

樣品處理：均勻稱取2 g樣品放入萃取瓶內(nèi)，在55 ℃恒溫水浴攪拌平衡30 min。用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭吸附30 min，將纖維頭于GC進(jìn)樣口270 ℃解吸附5 min。

GC條件：色譜柱：HP-INNOWax色譜柱(60 mm×320 mm, 0.25 μm)；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，載氣流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口250 ℃。升溫程序：60 ℃保持5 min，以8 ℃/min升至100 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

動態(tài)電路總共會涉及滑動變阻器類型的串聯(lián)電路、滑動變阻器類型的并聯(lián)電路、開關(guān)類型的串聯(lián)電路、開關(guān)類型的并聯(lián)電路四個(gè)基本電路。本文采用從局部→整體→局部的分析方法，對四個(gè)基本電路進(jìn)行完整、準(zhǔn)確的分析，使學(xué)生能夠全面掌握動態(tài)電路中所遇到的問題，提高學(xué)生分析問題、解決問題的能力。

MS條件：電離方式：EI;色譜-質(zhì)譜接口溫度250 ℃；離子化能量70 eV；離子源溫度250 ℃；四級桿溫度180 ℃；MS掃描范圍m/z20～550。

數(shù)據(jù)處理：檢測的化合物與NIST.11 library相匹配，匹配度大于80(最大值為100)的鑒定結(jié)果予以確認(rèn)；采用峰面積歸一化法對各化合物進(jìn)行相對定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果每組重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Excel 2017、Origin 2018和IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行圖像繪制及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮的變化分析

由圖1可知，發(fā)酵0 h的豆清飲料中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷含量分別為(41.921±1.01)、(3.24±0.01)、(54.187±0) mg/kg，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，整體呈下降趨勢，經(jīng)過微生物發(fā)酵22 h之后，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷含量減少至(17.613±1.00)、(0.039±0.07)、(21.983±0.07) mg/kg，下降率分別達(dá)到57.98%、98.79%、59.43%。發(fā)酵0 h的豆清飲料中大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的含量為(10.643±0.30)、(3.273±0.01)、(6.945±1.01) mg/kg，隨著時(shí)間的延長，含量呈直線上升。發(fā)酵22 h大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的含量增加為(22.552±1.02)、(8.842±0.07)、(33.013±0.21) mg/kg，上升率達(dá)到52.81%、62.98%、78.96%。從整體看，黃酮苷下降率為60.10%、黃酮苷元上升率為67.61%。本研究結(jié)果表明可以得到富含染料木素的豆清飲料。黃酮類化合物清除自由基能力和螯合活性的能力與其化學(xué)結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，染料木素比大豆苷元和黃豆黃素具有更高的抗氧化活性[10]。發(fā)酵可以將黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元，可能是乳酸菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，MARAZZA等[11]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌CRL981產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，能夠在豆奶發(fā)酵過程中增加生物活性異黃酮，發(fā)酵12 h時(shí)黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元的生物轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。ZHU等[12]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌對大豆異黃酮苷元的富集具有很大的潛力，大豆苷元和染料木素的含量發(fā)酵后從4.6%提高到93.78%。在微生物發(fā)酵過程中，與不溶性纖維結(jié)合的黃酮類化合物被釋放出來，可以導(dǎo)致黃酮苷元含量的增加[13]。黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元不是單一的轉(zhuǎn)化方式，ZHU等[12]發(fā)現(xiàn)僅以β-葡萄糖苷酶活性作為轉(zhuǎn)化率篩選指標(biāo)是不可靠的。在發(fā)酵過程中，大豆異黃酮總含量呈遞減的趨勢，主要是大部分黃酮在離解條件下，容易與氧氣結(jié)合，發(fā)生氧化反應(yīng)，所以在過程中，出現(xiàn)含量的降低[14]。

a-大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷；b-大豆苷元、黃豆黃素、染料木素；c-黃酮苷、黃酮苷元、總大豆異黃酮圖1 發(fā)酵過程中大豆異黃酮的含量Fig.1 Contents of soybean isoflavones at different fermentation time

2.2 大豆異黃酮的變化曲線擬合

用Origin 2018對豆清飲料中的大豆異黃酮與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行曲線擬合，擬合結(jié)果見表3。根據(jù)以上擬合曲線，可以得到黃酮苷元達(dá)到的最高值的理論發(fā)酵時(shí)間。黃酮苷元含量與發(fā)酵時(shí)間之間的關(guān)系為：y=0.021 56x2+1.464 68x+21.030 53，對函數(shù)求導(dǎo)數(shù)得：y′=0.043 12x+1.464 68，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，黃酮苷元含量呈現(xiàn)一次函數(shù)的變化。同理，可以得到大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、黃酮苷的變化趨勢。

表3 發(fā)酵過程中大豆異黃酮含量變化擬合曲線Table 3 Fitting curve of soybean isoflavone content during fermentation

2.3 有機(jī)酸的變化分析

如圖2所示，發(fā)酵22 h時(shí)，丙酮酸的含量為0.000 g/L、乳酸(0.63±0.008) g/L、無水檸檬酸(2.672±0.002) g/L、富馬酸(0.12±0.02) g/L、琥珀酸(0.231±0.01) g/L。無水檸檬酸的含量占比約64%、乳酸占比約18%、琥珀酸12%、富馬酸占比約5%。無水檸檬酸占比重高存在以下原因，pH值的調(diào)節(jié)采用無水檸檬酸。乳酸占比重高主要是植物乳桿菌進(jìn)行了檸檬酸代謝，自身通過2-羥基羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸檸檬酸鹽，檸檬酸鹽在檸檬酸裂解酶復(fù)合物催化下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸鹽，再經(jīng)草酰乙酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生丙酮酸最后生成乳酸及芳香化合物。喬明武等[15]運(yùn)用乳酸菌、酵母菌發(fā)酵豆清液，有機(jī)酸含量均有顯著性提高，檸檬酸達(dá)(1.207±0.005) g/L、乳酸(1.044±0.004) g/L。TU等[16]發(fā)現(xiàn)檸檬酸在發(fā)酵過程中變化不大，基本保持在1.1～1.3 g/L。FEI等[17]發(fā)酵豆清液36 h，酒石酸、乳酸、檸檬酸分別達(dá)到(1.03±0.04)、(6.21±0.01)、(0.52±0.0) g/L，與本研究結(jié)果一致。

在發(fā)酵過程中，乳酸菌經(jīng)糖酵解途徑將原料中的還原糖降解成丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下，直接被還原為乳酸，所以在發(fā)酵過程中，乳酸含量不斷增加，丙酮酸作為中間代謝產(chǎn)物，發(fā)酵過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化，如圖2所示，在0～14 h時(shí)，丙酮酸含量檢測不到。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，含量處于動態(tài)變化中，由于蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中乳酸菌將檸檬酸分解成丙酮酸、乙酸或者乳酸。琥珀酸在蘋果酸-乳酸途徑中，可通過部分丙酮酸氧化為乙酸和H+，H+再將延胡索酸還原得到琥珀酸[18]，處于動態(tài)平衡。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間有機(jī)酸含量變化Fig.2 Changes of organic acid content in different fermentation time

2.4 豆清飲料品質(zhì)相關(guān)性分析

根據(jù)表4的品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析表明，乳酸與琥珀酸、大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、黃酮苷、大豆苷元、染料木素、黃豆黃素、黃酮苷元呈顯著關(guān)系(r為0.848、-0.809、-0.628、-0.785、-0.794、0.718、0.671、0.802、0.781)，檸檬酸與富馬酸、琥珀酸、黃豆黃苷、黃豆黃素呈顯著關(guān)系(r為0.637、0.689、-0.803、0.760)，其中，染料木素與各種有機(jī)酸中的乳酸之間的相關(guān)性最高(r為0.802)。有機(jī)酸可以促進(jìn)黃酮苷水解為黃酮苷元，乳酸可以促進(jìn)染料木素的生成。研究發(fā)現(xiàn)乳酸水溶液濃度2.0 mol/L，黃酮苷水解率可達(dá)100%[19]。乳酸與檸檬酸的濃度相對比較高，所以其他有機(jī)酸的相關(guān)性比較小。

表4 豆清飲料品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of quality index of soybean whey beverage

大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、黃酮苷相互之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，大豆苷元、染料木素、黃豆黃素、黃酮苷元相互之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。黃酮苷與黃酮苷元呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(r為-0.987)。大豆異黃酮苷的變化與其組成的各個(gè)物質(zhì)的變化呈顯著正相關(guān)，與黃酮苷元呈顯著負(fù)相關(guān)，可以得出黃酮苷元主要是由黃酮苷水解得到。

2.5 風(fēng)味物質(zhì)的變化分析

由表5可知，豆清液和豆清飲料共鑒定出37種化合物，包括醇類8種、烯烴類7種、酯類6種、醛類5種、酮類2種、酸類2種、芳香化合物2種、烷烴1種、其他類4種。由表6和圖3可知，不同發(fā)酵時(shí)間檢測的揮發(fā)性化合物有差別且總揮發(fā)性物質(zhì)含量存在顯著差異(P<0.05)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，其揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)量檢出呈先增加、后減少、再增加的趨勢。表6分析了不同時(shí)間中鑒定出不同化合物的種類與數(shù)量。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，豆清液中檢測出11種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要是醇類與醛類[20]，大部分醇類和醛類物質(zhì)是在大豆脂氧合酶的催化作用下，由亞油酸和亞麻酸氧化而形成的[21]。發(fā)酵至6 h時(shí)，烯烴類物質(zhì)和酯類物質(zhì)種類增加，發(fā)酵12 h時(shí)總計(jì)檢出24種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類、烯烴類、醛類和酯類物質(zhì)占主要比例，發(fā)酵至22 h時(shí)檢出17種風(fēng)味物質(zhì)。

圖3 豆清飲料不同發(fā)酵時(shí)間風(fēng)味物質(zhì)含量變化Fig.3 Variation of flavor substance content in soybean whey beverage with different fermentation time

表5 豆清飲料的風(fēng)味物質(zhì) 單位：%Table 5 Flavor substance of soybean whey beverage

續(xù)表5

表6 豆清飲料揮發(fā)性化合物數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 6 Statistical analysis of volatile compounds in soybean whey beverage

由表5可知，豆清液中正己醇、1-辛烯-3-醇、正己醛、壬醛占主要比例，占比分別為18.79%、10.49%、9.40%、2.29%。這些都被描述為產(chǎn)生令人不快的味道、香氣，在乳酸菌的代謝作用下，不愉快的風(fēng)味都被代謝到較低或檢測不到的水平，形成了新的風(fēng)味酯類和醛類。豆清液中檢測到的呋喃物質(zhì)2-戊基呋喃，它有一種豆類味，會導(dǎo)致豆制品的油脂味和豆類味，經(jīng)過發(fā)酵之后，被微生物完全代謝。醛類由于其閾值低，且具有類脂肪香味及清新果香，是構(gòu)成特征性風(fēng)味的主要成分。壬醛有橘子和玫瑰的氣味，發(fā)酵22 h時(shí)，增長到0.64%。正辛醇、苯乙醇這些高級醇在酵母的氨基酸合成途徑中形成，適量的高級醇可以提高香氣的層次感和濃郁度。苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰樣花香，發(fā)酵6 h時(shí)，相對含量達(dá)到10.88%，發(fā)酵后期，相對含量減少至4.35%。主要是在發(fā)酵過程中，醛類物質(zhì)可以被氧化或還原為各自的酸或醇。醇類物質(zhì)與酸類物質(zhì)形成酯類物質(zhì)，隨著發(fā)酵時(shí)間的變化，苯乙醇反應(yīng)生成丙酸-2-苯乙酯、丁酸苯乙酯、乙酸苯乙酯的含量也隨著增加。2-乙烯基-雙環(huán)-2-己烯在豆清飲料中占主要風(fēng)味物質(zhì)，從0.00%增加到23.48%，為豆清飲料提供香甜風(fēng)味。酯類化合物是構(gòu)成香氣的重要物質(zhì)，酯類具有花、果香，對主體香型及風(fēng)格具有重要的影響，乙酸苯乙酯會提供果香、花香、蜜糖及熱帶水果香氣、帶有酵母香的味道[22]，發(fā)酵6 h時(shí)達(dá)到14.67%，在整體風(fēng)味中具有重要貢獻(xiàn)值。β-石竹烯具有淡的似丁香香味，主要用于配制精仿制品和定香劑，屬于天然等同香料和人造香料，可從丁香葉油、丁香莖油、肉桂葉油等物質(zhì)中分離。環(huán)氧化蛇麻烯II是植物啤酒花球果提取精油中的成分之一，主要是原料中攜帶；酮類的風(fēng)味通常是令人滿意的風(fēng)味，例如，2-十一酮有油脂氣息，具有特有的類似蕓香的香氣，濃度低時(shí)具有類似桃子的香氣。1-辛烯-3-酮具有強(qiáng)烈的壤香、蘑菇香。發(fā)酵6、12 h時(shí)產(chǎn)生了丁烯酮，丁烯酮具有臭味，但是發(fā)酵完成時(shí)被微生物代謝。長葉松香芹醇、別香橙烯氧化物、喇叭烯氧化物、β-芹子烯、石竹素一般常見于植物提取物中，具有保濕，抗氧化、抑菌等功能特性。

3 結(jié)論

本研究以豆清液為原料，接種克魯維酵母、腸膜明串珠菌、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵成豆清飲料，發(fā)酵22 h之后，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷含量減少至(17.613±1.00)、(0.039±0.07)、(21.983±0.07) mg/kg，大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的含量增加為(22.552±1.02)、(8.842±0.07)、(33.013±0.21) mg/kg，在整個(gè)發(fā)酵過程中，黃酮苷下降率為60.10%、黃酮苷元上升率為67.61%，大豆異黃酮苷的變化與其組成的各個(gè)物質(zhì)的變化呈顯著正相關(guān)，與黃酮苷元呈顯著負(fù)相關(guān)，黃酮苷元與之相反，可以得出黃酮苷元主要是由黃酮苷水解得到。發(fā)酵22 h時(shí)，丙酮酸的含量為0.000 g/L、乳酸(0.63±0.008) g/L、無水檸檬酸(2.672±0.002) g/L、富馬酸(0.12±0.02) g/L、琥珀酸(0.231±0.01) g/L，進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)一定濃度的有機(jī)酸可以促進(jìn)黃酮苷水解為黃酮苷元。豆清液發(fā)酵形成豆清飲料的過程中，共鑒定出37種化合物。在微生物的代謝作用下，豆清液中令人不快的味道、香氣正己醇、1-辛烯-3-醇、正己醛、壬醛被代謝到較低或檢測不到的水平，形成了新的具有花、果香風(fēng)味酯類和醛類，生成具有抗氧化、抑菌等功能特性的風(fēng)味物質(zhì)。該研究可以為豆清飲料提供理論依據(jù)。