吳雪，邱超，王金鵬

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214000)

分支環(huán)糊精是在酶的作用下，通過α-1,6糖苷鍵將單糖或二糖結(jié)合到環(huán)糊精C-6位的羥基上形成的環(huán)糊精衍生物。麥芽糖基-β-環(huán)糊精(maltosyl-β-cyclodextrin，M-β-CD)的制備是以麥芽糖和β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)作為底物，在高底物濃度下通過普魯蘭酶逆向合成[1]，或以麥芽糖基氟化物和環(huán)糊精作為底物，在解支酶糖基轉(zhuǎn)移作用下制備的一類分支環(huán)糊精[2]。與β-CD相比，M-β-CD具有更低的溶血活性[3]、更高的水溶性和更優(yōu)的包埋性能以及靶向作用[4]等優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、精細(xì)化工等領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛。經(jīng)過前人研究，M-β-CD在底物應(yīng)用、生產(chǎn)工藝、菌種選擇等方面不斷優(yōu)化，合成體系中產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率已提高至50%以上[5]，但是仍然不能規(guī)?；a(chǎn)，其原因是分離成本過高。為保證反應(yīng)逆向進(jìn)行，底物的濃度高達(dá)83.3%，其中麥芽糖含量約為74.9%，M-β-CD含量?jī)H占10.5%，高濃度的麥芽糖導(dǎo)致反應(yīng)體系呈高黏稠狀態(tài)，大大增加了分離成本與難度，并且由實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)可知，高濃度麥芽糖的存在也會(huì)影響M-β-CD的分離，分離成為M-β-CD工業(yè)化的瓶頸。

為了高效地從合成體系中分離目標(biāo)產(chǎn)物，研究者嘗試了各種分離方法，如膜過濾、凝膠層析、色譜法等。其中，色譜法因精度高、分辨率好、獲得產(chǎn)物純度高，被認(rèn)為是最適用于M-β-CD分離的技術(shù)。如IWAHORI等[6]采用反相高效液相色譜法分離了M-β-CD，但上樣量不足1 mg；JINGRICH等[7]用紙層析和高效液相色譜分離麥芽糖基-α-環(huán)糊精酶制液中的產(chǎn)物；WATANABE等[8]利用色譜柱分離了單半乳糖基-α-環(huán)糊精和二半乳糖基-α-環(huán)糊精。上述的分離方法分離分支環(huán)糊精，需要用到大量有機(jī)溶劑作為洗脫劑，這不僅造成工藝復(fù)雜，而且大大增加生產(chǎn)成本，無法規(guī)?；a(chǎn)。因此亟需對(duì)M-β-CD分離方法進(jìn)行改進(jìn)。

高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)，結(jié)合了液液萃取和分配色譜的特點(diǎn)，無需任何固態(tài)載體或支撐，流動(dòng)相和固定相選擇更加多樣，組合更加靈活，同時(shí)具有單次進(jìn)樣量大，樣品不需精制的優(yōu)勢(shì)。HSCCC在實(shí)驗(yàn)室級(jí)別高純度天然產(chǎn)物制備方面得到了很多應(yīng)用[9-11]，但目前尚未有HSCCC分離M-β-CD的報(bào)道，因此有必要對(duì)此做研究。目前HSCCC對(duì)天然產(chǎn)物研究集中在中性化合物研究上，而對(duì)于糖類這類高極性物質(zhì)分離研究較少。糖類由于高度親水，難以找到合適的溶劑體系應(yīng)用于糖類的分離，因此起步較晚。有關(guān)HSCCC分離糖類的溶劑體系，目前存在：(1)傳統(tǒng)有機(jī)試劑兩相體系：溶劑體系極性不高，分離效率不大，且大量使用有機(jī)試劑[12-13]；(2)雙水相體系：極性很強(qiáng)，綠色環(huán)保，但是容易受溫度影響，體系不穩(wěn)定，且在色譜中固定相保留率低[14]；(3)醇鹽溶劑體系：極性強(qiáng)，利于糖類分配，所使用溶劑可回收再利用。SHINOMIYA等[15]初次使用乙醇-硫酸銨(2 mol/L)(體積比3∶5)兩相系統(tǒng)改進(jìn)了CCC中糖的早期分離，WARD等[16]在此基礎(chǔ)上加入二甲亞砜作為糖類分離改性劑，用乙醇-二甲基亞砜-硫酸銨(300 g/L)(體積比0.8∶0.1∶1.8)兩相體系成功分離得到純度大于90%的鼠李糖、阿拉伯糖，半乳糖和半乳糖醛酸。因此，研究合適的HSCCC溶劑體系，可讓HSCCC成為經(jīng)濟(jì)高效分離純化M-β-CD的方法。

實(shí)驗(yàn)室前期已采用膜分離對(duì)M-β-CD進(jìn)行了初步分離，但由于酶合成體系中麥芽糖含量過高，僅通過膜分離技術(shù)難以分離純化。本研究利用HSCCC技術(shù)進(jìn)一步對(duì)膜分離后的M-β-CD進(jìn)行分離純化。通過篩選和優(yōu)化HSCCC溶劑體系組成，建立了一套M-β-CD的HSCCC分離純化方法。該方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，提高了M-β-CD分離效率與純度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

乙醇、二甲基亞砜、丙酮、四氫呋喃、石油醚、異丙醇、氨水、硫酸銨、磷酸氫二鉀、β-環(huán)糊精均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；普魯蘭酶、麥芽糖(純度>95%)，上海源葉生物有限公司；乙腈(色譜級(jí))，上海阿拉丁有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

TBE-30A高速逆流色譜儀，上海同田生物技術(shù)有限公司；高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；LC-20T高效液相色譜，日本島津公司；色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國(guó)Waters公司；電子天平(分度值=0.000 1 g)，奧豪斯科技有限公司；移液器(1 000 μL)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 M-β-CD膜分離樣品的制備

稱取200 g麥芽糖和40 g β-CD到97 mL pH 5.0 的醋酸緩沖液中，加入普魯蘭酶(300 U/g β-CD)，60 ℃ 下恒溫下于振蕩水浴鍋內(nèi)反應(yīng)60 h后高溫滅酶，然后稀釋4倍，抽濾去除固體顆粒和沉淀的酶，接下來通過截留值為5 kDa的卷式膜進(jìn)行超濾去除殘留的酶蛋白，最后使用截留值為1 kDa卷式膜通過間歇滲濾實(shí)現(xiàn)麥芽糖的去除。設(shè)置滲濾條件為0.4 MPa、40 ℃，物料質(zhì)量濃度為100 g/L，間歇循環(huán)4次后得到的濃縮液，經(jīng)噴霧干燥后待用。

1.2.2 高速逆流色譜溶劑體系相圖制作

相圖的繪制采用濁點(diǎn)滴定法[17]。用乙醇緩慢滴定已知濃度的無機(jī)鹽溶液，并在混合器上混合，觀察溶液澄清程度，直到溶液開始出現(xiàn)渾濁為止(雙相區(qū))。然后逐滴加入去離子水，直到出現(xiàn)澄清的單相溶液，再繼續(xù)滴加乙醇。如此反復(fù)，記錄好每次滴加的乙醇體積以及水的體積，計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí)乙醇及無機(jī)鹽在系統(tǒng)總量中的百分含量。

1.2.3 高速逆流色譜溶劑體系的篩選

本實(shí)驗(yàn)借鑒常見的低聚糖的HSCCC分離體系，結(jié)合M-β-CD的極性，選取乙醇-鹽-水體系，為了防止添加有機(jī)相后發(fā)生鹽沉淀，因此在將有機(jī)溶劑添加到體系之前，先根據(jù)所選溶劑系統(tǒng)中的比例將無機(jī)鹽溶液與水充分混合，隨后測(cè)定不同溶劑體系下的分配系數(shù)。測(cè)定方法如下：分別稱取10 mg的麥芽糖、β-CD、M-β-CD，置于10 mL試管中，加入平衡后的上、下相各2 mL，振蕩使其完全溶解，靜置分層，分別取上、下相進(jìn)行HPLC分析，上相和下相峰面積比值即是分配系數(shù)[18]，分配系數(shù)之間的比值即是分離因子α。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 M-β-CD的高速逆流色譜分離純化

將固定相(上相)以20 mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相(上相)充滿螺旋管后，開啟高速逆流色譜儀，調(diào)整轉(zhuǎn)速為950 r/min，同時(shí)流動(dòng)相(下相)以1.5 mL/min的流速泵入充滿固定相后的螺旋管中，待末端有流動(dòng)相流出時(shí)，即螺旋管中上下相已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。將1.2.1中制備的樣品溶液從進(jìn)樣閥中注入高速逆流色譜儀，每隔5 min收集餾分。HPLC檢測(cè)分析各餾分并采用面積歸一化法計(jì)算純度。

1.2.5 HPLC分析條件

色譜條件：X Amide色譜柱(2.1 mm×75 mm，2.5 μm)；流動(dòng)相：65%(體積分?jǐn)?shù))乙腈-1%(體積分?jǐn)?shù))氨水；檢測(cè)器：RID-10A；柱溫：室溫；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽離子的雙水相圖繪制

HSCCC中用于分離高極性化合物最常用的溶劑體系是正丁醇-水，加入少量甲醇或乙酸作為改性劑[19]。但是由于正丁醇具有高黏度特性，因此這種溶劑體系固定相保留率低，導(dǎo)致分離效果差。而根據(jù)鹽析萃取理論，添加無機(jī)鹽可顯著降低高親水性化合物在水溶液中的溶解度，有利于極性化合物在有機(jī)相中的分配[20]，因此，醇鹽體系或可優(yōu)化高極性糖類化合物在HSCCC的分離純化。在此選擇磷酸氫二鉀、硫酸銨、磷酸二氫鈉與乙醇組成兩相體系，探究其與乙醇成相能力，并選擇實(shí)驗(yàn)中合適的鹽濃度。

由圖1可知，磷酸氫二鉀與乙醇成相能力最好，即在低濃度乙醇下也可成相。在雙水相形成過程中，鹽和水分子的相互作用起著非常重要的作用。離子所帶的電荷越多、離子半徑越小，則越容易形成雙水相，例如，陽離子鹽析效應(yīng)為Al3+>Fe3+>Mg2+>Ca2+>Li+>Na+>NH4+>K+。而在實(shí)驗(yàn)過程中又發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度越高，上下相體積比越小，體積比過小將不利于目標(biāo)物分配且會(huì)造成浪費(fèi)，因此為合理分配上下相體積，同時(shí)在兩相形成體積范圍內(nèi)，選取硫酸銨質(zhì)量濃度為250、300、350 g/L，磷酸二氫鈉與磷酸氫二鉀均為300、400、500 g/L。

圖1 不同鹽離子與乙醇的雙曲線相圖Fig.1 Binodal curves for the different salt with ethanol ATPS

2.2 鹽離子及其濃度篩選

鹽的種類和濃度對(duì)分配系數(shù)的影響主要反映在對(duì)相間電位和疏水性的影響。依據(jù)2.1中篩選的鹽離子濃度范圍，考察其成相時(shí)間及測(cè)定所形成的不同溶劑體系對(duì)麥芽糖、β-CD、M-β-CD分配系數(shù)的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同類型及不同濃度鹽離子對(duì)環(huán)糊精及麥芽糖分配系數(shù)的影響Table 1 Effects of different types and different concentrations of salt ions on the partition coefficient of cyclodextrin and maltose

由表1可知，在3種鹽與乙醇形成的兩相體系中，3種糖的分配系數(shù)各不相同，但都遵循著相同的規(guī)律：鹽的質(zhì)量濃度越高，分配系數(shù)越大，鹽所占體積比例越大，分配系數(shù)越大。這可能是隨著下相中鹽的質(zhì)量濃度增加，鹽析能力增強(qiáng)[21]，競(jìng)爭(zhēng)水分子能力增強(qiáng)，吸引上相中的水分子逐漸轉(zhuǎn)移至下層鹽相，而有機(jī)溶劑逐漸從鹽相轉(zhuǎn)移至有機(jī)相，因此分配系數(shù)逐漸增大[22]。其中磷酸氫二鉀中分配系數(shù)最大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過逆流色譜合適分配系數(shù)范圍(K=0.5～2)[18]，不適合用于分支環(huán)糊精的HSCCC分離。低濃度的硫酸銨分配系數(shù)尚在合理范圍內(nèi)，但均大于磷酸二氫鈉中的分配系數(shù)。這可能是由于硫酸銨的酸性小于磷酸二氫鈉，而環(huán)糊精易溶于堿性溶液，因此吸引更多環(huán)糊精溶于下相，使得分配系數(shù)變大。另外由于β-CD親水性弱，在水中的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及麥芽糖和M-β-CD，因此分配系數(shù)始終最小。而M-β-CD接枝一個(gè)麥芽糖單位，既又有環(huán)糊精內(nèi)親水外疏水性質(zhì)，又具有麥芽糖的親水性，因此在磷酸二氫鈉溶液中，分配系數(shù)小于麥芽糖。

在硫酸銨鹽體系中，M-β-CD與麥芽糖分離系數(shù)相差不大，α<1.5，這會(huì)使得這2種物質(zhì)分離不完全，影響分離純度，因此也不適合環(huán)糊精體系的分離。而磷酸二氫鈉體系的分層時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)造成出峰時(shí)間慢、峰圖變寬、固定相保留率低等問題，將影響逆流色譜最終分離效果，因此接下來需要進(jìn)一步改性磷酸二氫鈉體系以縮短分層時(shí)間。

2.3 改性劑選擇及其比例

選擇極性稍小的有機(jī)試劑加入兩相體系中，擴(kuò)大上下相極性的差異，可縮短分層時(shí)間。考慮到環(huán)糊精溶解度以及溶液自身極性等因素，選擇乙腈、丙酮、異丙醇、四氫呋喃、石油醚等5種有機(jī)試劑作為改性劑添加在兩相體系中，測(cè)定麥芽糖、β-CD、M-β-CD在新兩相體系中的分配行為(表2)。

表2 不同改性劑對(duì)分層時(shí)間及分層體積比的影響Table 2 The influence of different modifiers on settling time and volume ratio

由表2可以看出，在加入改性劑后，上下相極性差距變大，兩相體系分層時(shí)間明顯縮短，皆在30 s附近，符合逆流色譜對(duì)分層時(shí)間的要求，但石油醚加入后兩相體系分成三相，不適合此體系。

如表3所示，加入改性劑后，對(duì)上相有機(jī)相極性有所改變，因此3種糖的分配系數(shù)也隨之變化，均隨著上相極性的減小而增大，但變化幅度不同。四氫呋喃體系中未在上相中檢測(cè)出3種糖，因此不適合用作改性劑，而乙腈與異丙醇的加入使得麥芽糖與M-β-CD分配系數(shù)增大至3以上，且兩者之間分離因子差距變小，因此也不適合用作改性劑。丙酮在縮短分層時(shí)間的同時(shí)保持3種糖的分配系數(shù)依然在合適范圍內(nèi)，并未有較大影響，作為改性劑較為合適。

表3 不同改性劑對(duì)麥芽糖、β-環(huán)糊精、麥芽糖基β-環(huán)糊精分配系數(shù)的影響Table 3 Effect of modifiers on the partition coefficient of maltose, β-CD and M-β-CD

進(jìn)一步探究丙酮作為改性劑的濃度對(duì)分配系數(shù)的影響，由于麥芽糖與M-β-CD分配系數(shù)較為相近，因此只需考慮麥芽糖與M-β-CD分配系數(shù)即可，尋找合適的體積比使兩者差異更大。根據(jù)表1磷酸二氫鈉的分層時(shí)間以及分配系數(shù)的結(jié)果，選擇300 g/L以及350 g/L 2種鹽濃度，醇鹽體積比2∶3為基礎(chǔ)進(jìn)行研究。表4結(jié)果表明，當(dāng)磷酸二氫鈉質(zhì)量濃度為300 g/L，磷酸二氫鈉-乙醇-丙酮體積比為6∶2∶1.5時(shí)，麥芽糖分配系數(shù)為1.78, M-β-CD為1.04，兩者α達(dá)到最大值1.72，通常情況下，α>1.5代表兩者物質(zhì)可在高速逆流色譜儀器分開[23]。因此選擇此體系當(dāng)做逆流色譜兩相溶劑體系。

表4 丙酮濃度對(duì)麥芽糖和麥芽糖基β-環(huán)糊精分配系數(shù)的影響Table 4 Effect of acetone concentration on the partition coefficient of maltose and M-β-CD

2.4 分離效果

將膜分離后的樣品溶解于優(yōu)化后的溶劑體系中，進(jìn)行高速逆流色譜分離。

經(jīng)過高速逆流色譜分離后，在30～35 min收集到目標(biāo)餾分，目標(biāo)餾分HPLC色譜圖及組分含量如圖2、表5所示，在該時(shí)間段餾分中，幾乎沒有麥芽糖，M-β-CD純度由膜分離后的32.3%提高至93.2%，此時(shí)固定相保留率為60%，由此可證明HSCCC與膜分離技術(shù)聯(lián)用，是可行有效的分離純化M-β-CD的方法。

圖2 HSCCC目標(biāo)餾分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of HSCCC target fraction

表5 目標(biāo)餾分物質(zhì)含量Table 5 Target fraction substance content

3 結(jié)論

利用HSCCC結(jié)合膜分離技術(shù)，通過探索膜分離條件及HSCCC溶劑體系，成功分離純化出麥芽糖基β-環(huán)糊精，純度為93.2%。該方法相較于曾報(bào)道的反相高效液相色譜法，具有處理量大，耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。本文探討了HSCCC新型溶劑體系中的一種，另外還存在離子液體、深共溶溶劑等新型極性溶劑體系，后續(xù)也可研究用于糖類分離中。