段玉樺，余雍和，楊銳，王一丹，周欣，王璋倩

1(武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430023)2(武漢輕工大學(xué) 硒科學(xué)與工程現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，湖北 武漢，430040) 3(武漢輕工大學(xué)，國(guó)家富硒農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，湖北 武漢，430040)

硒是人和動(dòng)物必需的微量元素，硒與人類和動(dòng)物正常機(jī)體代謝和健康密切相關(guān)。微量的硒具有較強(qiáng)的生物活性，是很好的抗氧化劑[1]，有抗腫瘤[2]、防衰老和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種功能[3]。人體不能合成硒，其攝入途徑主要是通過食用來自富硒土壤的作物。土壤環(huán)境中硒含量異常會(huì)引起人類的地方性疾病。硒在生物活性和毒性之間范圍非常狹窄，容易進(jìn)入硒的毒性范圍[4]。20世紀(jì)60年代初在湖北恩施，發(fā)現(xiàn)人們食用了高硒土壤上生長(zhǎng)的蔬菜后出現(xiàn)脫發(fā),掉指甲,皮膚損壞等硒中毒癥狀[5]。

土壤硒污染會(huì)給當(dāng)?shù)氐娜撕蛣?dòng)物帶來重大傷害。采用傳統(tǒng)的土壤污染治理方法成本高、效果差，而近年來興起的生物修復(fù)技術(shù)是治理土壤硒污染的既有效又經(jīng)濟(jì)的方法[6-7]。硒在土壤中按形態(tài)主要分為元素硒、硒化物、有機(jī)硒、亞硒酸鹽和硒酸鹽。土壤中無機(jī)硒的毒性要大于有機(jī)硒及納米硒。土壤硒污染生物修復(fù)可以借助微生物自身作用分解土壤中的有毒無機(jī)硒，轉(zhuǎn)化得到的納米硒比無機(jī)硒或有機(jī)硒更能被生物有效利用，近年來使用納米硒處理的植物有銀杏[8]、小麥和水稻[9]等，使用生物納米硒處理銀杏幼苗，銀杏葉葉綠素、可溶性糖和總黃酮醇苷含量大幅提高，產(chǎn)量和品質(zhì)均有提升[8]，現(xiàn)階段耐硒菌株耐受能力普遍在0～20 mg/mL[10-11]，因此篩選高耐硒并能轉(zhuǎn)化無機(jī)硒為生物納米硒的微生物具有廣闊前景。

近年來，環(huán)境持久性自由基(environmental persistent free radicals, EPFRs)因具有環(huán)境毒性而受到廣泛關(guān)注，EPFRs的潛在危害主要?dú)w因于其在環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生活性的次生自由基如羥自由基等，可攻擊細(xì)胞膜、脂質(zhì)蛋白、DNA等，造成氧化損傷。LIAO等[12]研究表明持久性自由基具有抑制多種作物發(fā)芽率、質(zhì)膜損傷等現(xiàn)象。因此在處理土壤污染的時(shí)候要充分考慮到存在EPFRs，對(duì)EPFRs的清除可以通過清除過程中的次生自由基中間體的方法，研究土壤中微生物是否具有清除自由基能力，對(duì)修復(fù)環(huán)境、人類健康具有重要的意義。因此本文也對(duì)篩選得到耐硒菌株所制備的納米硒(nano-Se，SeNPs)以及次生代謝產(chǎn)物在體外清除自由基能力進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2020年9月在江漢平原富硒帶(湖北武漢東西湖區(qū))采集土壤深度10 cm以下的土樣。

1.2 試劑

酵母抽提物、蛋白胨，OXIOD；瓊脂粉，Biosharp；亞硒酸鈉，Sigma；DPPH，Phygene；ABTS底物，BOSF；水楊酸，SCR；FeSO4，天津永晟精細(xì)化工。

1.3 儀器與設(shè)備

FA-45-12-17Eppendorf 離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；BXM-30R立式壓力蒸氣滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；725G紫外可見分光光度計(jì)，Biobase。

1.4 耐硒菌株分離與篩選

1.4.1 菌株分離

將采集土樣顆粒均勻分散到LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)。次日將單菌落轉(zhuǎn)接。

1.4.2 耐硒能力篩選

1.4.2.1 初篩

從上述分離的單菌落分別接種到含9、17、26、35、43、52 mg/mL亞硒酸鈉的LB平板中。根據(jù)平板是否出現(xiàn)微紅至深紅色菌落，挑選能產(chǎn)生深紅色菌落的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.4.2.2 復(fù)篩

將初篩后的不同菌株種子液分別接種于含9、17、26、35、43、52 mg/mL亞硒酸鈉的LB液體培養(yǎng)基中。37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，觀察液體顏色是否轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒓t至深紅色，挑選能轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色時(shí)亞硒酸鈉濃度最高的菌株。

1.5 耐硒菌株D1鑒定

1.5.1 D1菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將D1接種到LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄菌落形態(tài)；進(jìn)行革蘭氏染色，在×100進(jìn)行顯微觀察菌體形態(tài)。

1.5.2 D1菌株生理生化鑒定

生理生化實(shí)驗(yàn)分別從細(xì)菌的氧化酶實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、碳源利用情況等幾個(gè)方面進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)參考《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]。

1.5.3 D1菌株16S rRNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

提取D1菌株的DNA送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行16S rRNA序列測(cè)定。將測(cè)序所得序列通過BLAST軟件在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用Clustal X和MEGA軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 D1菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

菌株D1種子液按1%的接種量分別接種于含0、9、17、26 mg/mL亞硒酸鈉的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔2 h進(jìn)行取樣。將上述取出的菌液，以滅菌水作為對(duì)照，測(cè)定OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 SeNPs及次生代謝產(chǎn)物的制備

1.7.1 納米硒純化

將活化好的D1菌株接種于含9 mg/mL亞硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中，連續(xù)搖培48 h。收集紅色菌液，9 000 r/min，離心20 min，收集沉淀。沉淀用液氮研磨，超聲，將紅色懸液分別過20、10、5、3、1.2、0.8 μm的濾膜，將過濾后紅色懸液用正己烷充分萃取，收集下層，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀即為產(chǎn)品，烘干稱重[14]。

1.7.2 菌株次生代謝產(chǎn)物的收集

將D1菌株接種于LB培養(yǎng)基中，連續(xù)搖培48 h。將上述培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，收集上清液。用等體積的乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層并干燥稱重。

1.8 D1菌株制備的納米硒表征

將分離純化的納米硒通過動(dòng)態(tài)光散射法(dynamic light scattering，DLS)對(duì)粒徑進(jìn)行測(cè)定。

1.9 D1菌株的清除自由基能力測(cè)定

1.9.1 供試品的制備

取適量純化后的納米硒，超純水溶解，配制為10 mg/mL的樣品母液。取適量D1菌株的乙酸乙酯萃取物，無水乙醇溶解，配制為10 mg/mL的樣品母液。并將樣品母液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為15、30、75、150、745、1 045 μg/mL的樣品溶液備用。

1.9.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考都鵬程等[15]的方法稍作修改。利用無水乙醇配制濃度為0.25 mmol/L的DPPH溶液。吸取DPPH溶液600 μL，加入不同濃度的納米硒及次生代謝物樣品溶液70 μL，于暗處反應(yīng)30 min，測(cè)定OD517nm值，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：DC，DPPH自由基清除率，%；As，樣品與DPPH溶液混合后的吸光值；Ac，樣品與無水乙醇混合后的吸光值；Ab，DPPH溶液與水混合后的吸光值。

1.9.3 ABTS陽離子自由基清除率的測(cè)定

配制7.4 mol/L ABTS溶液以及2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，等比混合，室溫避光反應(yīng)12 h，用無水乙醇溶液稀釋至OD734nm值為0.75，即為ABTS工作液。吸取ABTS工作液600 μL，加入不同濃度的納米硒及次生代謝物樣品溶液70 μL，于37 ℃恒溫反應(yīng)30 min，測(cè)定OD734nm值，計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：DC，ABTS陽離子自由基清除率，%；As，樣品與ABTS工作液混合后的吸光值；Ac，樣品與水混合后的吸光值；Ab，ABTS工作液與水混合后的吸光值。

1.9.4 羥自由基清除率的測(cè)定

參考范三紅等[16]方法稍作修改，在試管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液200 μL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液200 μL，不同濃度的納米硒及次生代謝物樣品溶液70 μL，再加入30%(體積分?jǐn)?shù))的H2O2溶液200 μL，靜置30 min，測(cè)定OD510nm值，計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：DC，羥自由基清除率，%；As，樣品與羥自由基的反應(yīng)體系混合后的吸光值；Ac，樣品與水混合后的吸光值；Ab，羥自由基的反應(yīng)體系與水混合后的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐硒菌株分離與篩選

2.1.1 菌株分離

從江漢平原富硒帶土壤樣品中共分離到具有不同菌落特征的微生物菌株85株。

2.1.2 耐硒能力篩選

2.1.2.1 初篩

經(jīng)過加硒濃度遞增篩選，能夠在硒質(zhì)量濃度43 mg/mL的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好的菌株有6株，分別命名為D1、R16、D131、ESW18、ESD9、ESD14。這些菌株均能將亞硒酸鈉還原成紅色單質(zhì)硒，在含硒平板上呈現(xiàn)紅色菌落(圖1)。

圖1 D1菌株在含硒平板紅色菌落形態(tài)Fig.1 Red-colored colonies of the D1 on agar plates that containing Na2SeO3

2.1.2.2 復(fù)篩

將初篩后的菌株活化后經(jīng)耐硒液體濃度梯度篩選，比較菌株在富硒培養(yǎng)液中產(chǎn)生的顏色變化，如表1所示，篩選1株耐硒能力最強(qiáng)的菌株，該菌株編號(hào)為D1。該菌株對(duì)亞硒酸鈉的耐受范圍為0～35 mg/mL。

表1 不同菌株在含硒LB液體培養(yǎng)基中的顏色變化Table 1 Color changes of different strains in LB broth containing selenite

2.2 耐硒菌株D1鑒定

2.2.1 D1菌株形態(tài)學(xué)鑒定

D1菌株菌落形態(tài)如圖2-a所示。菌株D1生長(zhǎng)良好，菌落為圓形，中間有凸起，邊緣不光滑，黏稠不透明，白色。菌株D1革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果如圖2-b所示，其細(xì)胞呈桿狀，兩端橢圓形,芽胞端生，卵圓形。

a-菌落形態(tài)；b-革蘭氏染色圖2 D1菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig.2 Colony morphology and gram staining of the Dl

2.2.2 菌株生理生化鑒定

由表2可知，菌株D1的已測(cè)特征與Lysinibacillusfusiformis菌株的主要特征基本一致，可從其形態(tài)特征和生理生化特征初步判斷該菌屬于Lysinibacillus屬。

表2 D1菌株與紡錘形賴氨酸芽孢桿菌生理生化特性比較Table 2 Differential characteristics of strain D1 and Lysinibacillus fusiformis

2.2.3 D1菌株16S rRNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

2.2.3.1 16S rRNA序列測(cè)定

L．fusiformisNBRC 15717是D1菌株16S rDNA序列在GenBank上Blastn同源性為99%的1株菌株。

2.2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

結(jié)果如圖3所示，D1菌株與各種Lysinibacillus屬菌株的遺傳距離很小，且D1與L．fusiformisNBRC 15717在同1個(gè)分支中。

圖3 菌株D1 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the D1 based on 16S rRNA sequences

2.3 D1菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

D1菌株在不同亞硒酸鈉濃度條件下的生長(zhǎng)曲線(圖4)顯示，D1菌株生長(zhǎng)在4 h進(jìn)入指數(shù)期，約28 h進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。亞硒酸鈉濃度的增加對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，亞硒酸鈉濃度變大導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)的滯后階段持續(xù)時(shí)間增加。

圖4 菌株D1在含不同濃度亞硒酸鈉培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of D1 in culture medium with different concentrations of sodium selenite

2.4 D1菌株制備納米硒表征

DLS分析表明紅色產(chǎn)物為納米單質(zhì)硒，粒徑為(306.20±1.64) nm(圖5)。

圖5 菌株D1制備SeNPs粒徑大小Fig.5 Preparation of SeNPs Particle size by Lysinibacillus fusiformis Dl

2.5 D1菌株的自由基清除能力測(cè)定

2.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

如圖6所示，D1次生代謝產(chǎn)物(圖6-b)具有一定的DPPH自由基清除能力，其質(zhì)量濃度為1 045 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)(66.38±0.67)%，且次生代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。D1菌株制備的SeNPs(圖6-a)和亞硒酸鈉(圖6-c)均具有較弱的DPPH自由基清除能力。

a-納米硒；b-次生代謝產(chǎn)物；c-亞硒酸鈉圖6 DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging ability注：ns表示無顯著性差異(P>0.1)；**表示差異顯著(P<0.05)；同一行不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.5.2 ABTS陽離子自由基清除率的測(cè)定

如圖7所示，D1次生代謝產(chǎn)物(圖7-b)和亞硒酸鈉(圖7-c)均具有較強(qiáng)的ABTS陽離子自由基清除能力。次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為150 μg/mL時(shí)，ABTS陽離子自由基清除率達(dá)(99.94±0.08)%。D1菌株制備的SeNPs(圖7-a)具有一定的ABTS陽離子自由基清除能力，在1 045 μg/mL的質(zhì)量濃度下，ABTS陽離子自由基清除率為(59.81±5.09)%。該3個(gè)樣品自由基清除能力均隨樣品溶液濃度增大而增強(qiáng)。

a-納米硒；b-次生代謝產(chǎn)物；c-亞硒酸鈉圖7 陽離子自由基清除能力Fig.7 ABTS radical scavenging ability

2.5.3 羥自由基清除率的測(cè)定

如圖8所示，D1菌株的次生代謝產(chǎn)物(圖8-b)和亞硒酸鈉(圖8-c)具有一定的羥自由基清除能力。次生代謝產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為745 μg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)(36.16±0.16)%。D1菌株制備的SeNPs(圖8-a)具有較弱的羥自由基清除能力。自由基清除能力均隨這3個(gè)供試品溶液濃度增大而增大。

a-納米硒；b-次生代謝產(chǎn)物；c-亞硒酸鈉圖8 羥自由基清除能力Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging ability注：*表示差異顯著(0.05

3 結(jié)論與討論

本研究從江漢平原土壤中分離得到了1株高耐硒菌株D1，鑒定為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)。已見報(bào)道的L.fusiformis主要分離自土壤，污染水體[17]，它們?cè)诃h(huán)境中具有降解石油[18]、還原鉻和降解纖維素[19]等功能，但其關(guān)于耐硒能力的報(bào)道較少。D1對(duì)35 mg/mL高質(zhì)量濃度亞硒酸鹽有一定的耐受性。該菌株制備的Se0粒徑大小為306.20 nm。研究表明D1能夠?qū)⒏邼舛葋單徕c轉(zhuǎn)化為高安全性的納米硒，對(duì)硒污染地域的微生物修復(fù)具有重要的意義，而且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生物納米硒可以更好地促進(jìn)土壤中植物的生長(zhǎng)發(fā)育[8]。D1的次生代謝產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的清除能力較強(qiáng)，D1菌株制備的納米硒具有一定的ABTS陽離子自由基和羥自由基清除能力，較次生代謝產(chǎn)物活性較弱，這可能是因?yàn)榧{米硒粒徑大小對(duì)清除自由基能力有一定的影響[20]。有待進(jìn)一步探究該菌株后續(xù)分離純化及活性物質(zhì)，為菌株的綜合利用以及研究清除持久性自由基能力奠定基礎(chǔ)。