張麗蓉， 謝宋陽， 肖紫芬， 盧端萍， 陳 碩

(福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院，福建福州 350001)

磺胺類藥物是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物[1]，主要通過競爭性拮抗氨甲環(huán)酸，干擾細菌的葉酸代謝，抑制細菌生長繁殖從而起到抑菌作用，其抗菌譜廣、效果強、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉且易于生產(chǎn)，臨床上也常見于短期使用的皮膚外用藥中。臨床研究表明，磺胺類藥物對治療痤瘡有一定效果，因此某些化妝品商家在宣稱具有“祛痘/抗粉刺”功效的化妝品中，違禁添加磺胺類藥物以達到快速起效的目的，從而獲得更大的經(jīng)濟利益。但磺胺類藥物副作用較多，長期使用含有磺胺類藥物的化妝品會刺激皮膚，引起接觸性皮炎及耐藥性，更有甚者造成較嚴重的身體機能的損傷。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[2]及歐盟化妝品[3]等均明確規(guī)定磺胺類藥物為化妝品中禁用成分。

關(guān)于磺胺類藥物的研究報道多見于食品[4 - 6]、環(huán)境[7 - 9]、化妝品[10,11]等領(lǐng)域，其檢測方法主要有液相色譜法[12,13]、液相色譜-質(zhì)譜法[4 - 11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14]等?；瘖y品中磺胺類藥物的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品監(jiān)督管理局2019年發(fā)布的(國家局2019年第66號通告)《化妝品中抗感染類藥物的檢測方法》。本實驗室在實驗過程中發(fā)現(xiàn)按該標(biāo)準(zhǔn)中的方法對樣品進行處理后，樣品中的磺胺類藥物穩(wěn)定時間較短，且該標(biāo)準(zhǔn)檢測的磺胺類藥物僅6種，檢測范圍不夠廣，部分不法商家為躲避監(jiān)管可能添加標(biāo)準(zhǔn)外的磺胺類成分，用該標(biāo)準(zhǔn)進行檢測往往發(fā)現(xiàn)不了潛在的風(fēng)險。因此，本文在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)原有磺胺類成分的基礎(chǔ)上增加4種磺胺類藥物以加大檢測和監(jiān)管的范圍，并對該標(biāo)準(zhǔn)的樣品前處理方法及色譜條件進行優(yōu)化，使其更適合祛痘類化妝品中磺胺類藥物的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

UPLC-I-Class Plus超高效液相色譜儀(美國，Waters公司)；Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(美國，Waters公司)；電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；高速冷凍離心機(日本，日立公司)；Arium Combort超純水儀(德國，賽多利斯公司)；Elma超聲波儀(美國，IKA公司)。

磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺噻唑及磺胺苯酰，均購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99.5%；磺胺甲嘧啶購于Bepure公司，純度：99.6%；磺胺甲惡唑購于Dr.E公司，純度：99.6%；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，阿拉丁公司)。實驗用水均為超純水。

測定的樣品均來自于國家化妝品監(jiān)督抽檢任務(wù)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取10種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(-18 ℃保存)。精確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用甲醇稀釋至刻度，配制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用50%乙腈水溶液逐級稀釋成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。

1.3 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取祛痘類化妝品試樣0.2 g(精確至0.001 g)，置于15 mL離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋30 s，超聲提取30 min，渦旋混合搖勻，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速于0 ℃冷凍離心10 min，吸取上清液置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取濾液待測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脫：0～8 min，2%～25%B；9～12 min，25%～99%B；13～16 min，99%B；16～16.5 min，99%～2%B；16.5～20 min，2%B；流速：0.3 mL/min。柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。10種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/mL)、樣品加標(biāo)溶液，以及空白樣品溶液的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 10種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)、樣品加標(biāo)溶液(b)及空白樣品溶液(c)的總離子流色譜圖

質(zhì)譜條件:離子源：電噴霧電離，正離子模式(ESI+)掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：1 000 L/h。定性離子、化合物定量及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10種磺胺類成分的質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及流動相的選擇

比較了DIKMA Endeavorsil C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Phenomenex Luna C8柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)、Agilent ZORBAX SB-Aq柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)及Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) 4種色譜柱對10種磺胺類藥物的分離效果。結(jié)果顯示10種磺胺類藥物在Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱上的分離度及峰形優(yōu)于其它色譜柱，故最終選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱對10種磺胺類藥物進行分離。

磺胺類藥物具有伯胺基和磺胺氨基，具有酸堿兩性，其在甲醇-水或乙腈-水等中性流動相體系中呈現(xiàn)的峰形不好，且磺胺類藥物的氨基容易接收H+，形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，因此在流動相中添加甲酸以提高待測組分的離子化程度及降低pH值，從而起到增強響應(yīng)及改善峰形的作用。方法考察了甲酸的添加量為0.05%～0.5%，結(jié)果顯示隨著甲酸濃度的增大，響應(yīng)也隨之增強，且同時考察了乙腈和甲醇對于待測組分的分離情況，結(jié)果顯示乙腈優(yōu)于甲醇。鑒于高濃度甲酸對儀器造成的損傷以及0.1%的甲酸已能滿足響應(yīng)與峰形的要求，因此選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈(含0.1%甲酸)作為流動相。

2.2 前處理方法的考察

國家藥品監(jiān)督管理局于2019年發(fā)布了(國家局2019年第66號通告)《化妝品中抗感染類藥物的檢測方法》，本實驗室在實驗過程中發(fā)現(xiàn)采用該方法進行前處理后，供試液中的磺胺類藥物在酸性條件(0.1%～0.5%甲酸)下不穩(wěn)定，磺胺類藥物6 h后響應(yīng)值開始下降，8 h下降了30%～40%，10 h下降了40%～60%，因此本文選擇不加酸的溶劑進行提取。本文考察了甲醇、乙腈對樣品的提取效果，結(jié)果顯示用甲醇進行提取時出現(xiàn)較嚴重的起泡及乳化現(xiàn)象，乙腈不會出現(xiàn)該現(xiàn)象，此外乙腈有沉淀蛋白的作用，有利于樣品中雜質(zhì)的去除，因此選擇乙腈作為提取溶劑。使用乙腈從樣品中提取的成分較復(fù)雜，因此超聲提取后對其進行冷凍離心，除去提取液中脂溶性成分，吸取上清液，用水稀釋時有大量沉淀析出，將其過濾后能減少雜質(zhì)對待測組分的干擾，減小基質(zhì)效應(yīng)，并起到保護色譜柱及儀器的作用。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

化妝品中基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)中的共提取物與目標(biāo)組分競爭電離，可能會增強或減弱目標(biāo)組分的離子化程度，形成基質(zhì)效應(yīng)(ME)，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此有必要對其進行基質(zhì)效應(yīng)的考察，ME[15]按如下公式進行計算：ME(%)=(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%。當(dāng)ME為負值時說明存在抑制效應(yīng)，正值為增強效應(yīng)，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)ME的絕對值小于20%時，表示基質(zhì)效應(yīng)不明顯[15]。10種磺胺類藥物的ME值的絕對值均小于10%，說明基質(zhì)中的共提取物對這10種磺胺類藥物的離子化基本沒有造成干擾，10種磺胺類藥物的ME值結(jié)果見表2。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍和檢出限按“1.2”方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液并進行測定，以待測組分濃度為橫坐標(biāo)，待測組分定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，10種磺胺類藥物在0.5～10 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。取空白樣品，添加低濃度水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行前處理，以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限，10倍信噪比(S/N=10)計算定量限。10種磺胺類藥物的線性、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限結(jié)果見表2。

表2 10種磺胺類藥物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

2.4.2 加標(biāo)回收率及精密度取空白樣品，按0.05 μg/g、0.1 μg/g、0.4 μg/g 3個濃度水平添加10種磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平測定3個平行樣，按“1.3”樣品處理方法操作，進行加標(biāo)回收率的考察，10種磺胺類藥物的平均回收率為93.5%～110.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～5.7%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確度。取空白樣品6份，添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0.05 μg/g的加標(biāo)樣品進行測定，以定量離子峰面積計算精密度(RSD)，RSD均小于10%，表明精密度良好。10種磺胺類藥物的平均回收率、RSD結(jié)果見表3。

表3 10種磺胺類藥物的回收率及精密度結(jié)果

2.5 樣品測定

應(yīng)用本文建立的方法對市售的30批不同基質(zhì)的祛痘類化妝品(洗面奶、化妝水、乳液、膏霜及凝膠等)中的10種磺胺類藥物進行測定，均未檢出方法中的10種磺胺類藥物。

3 結(jié)論

本文在國家檢測標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上對前處理及色譜條件進行了優(yōu)化，并考察了基質(zhì)效應(yīng)，新增4種磺胺類藥物，建立了祛痘類化妝品中10種磺胺類藥物的UPLC-MS/MS檢測方法。該方法具有良好的選擇性，靈敏度高，且前處理簡單易操作，基質(zhì)效應(yīng)小。本文建立的方法擴大了檢測和監(jiān)管范圍，推廣應(yīng)用前景良好，可為祛痘類化妝品的安全監(jiān)管提供較好的技術(shù)支撐。