劉愛娟， 劉雪婷， 薄曉文， 孟 凱， 亓?xí)詰c， 沈 永*

(1.山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心,山東濟(jì)南 2501012.山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 2501013.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250101)

N-亞硝胺是具有-N-N=O官能團(tuán)的—類物質(zhì)的總稱，屬于強(qiáng)致癌有機(jī)化合物。橡膠制品中的N-亞硝胺主要產(chǎn)生于橡膠的高溫硫化成型過程。在特定的使用環(huán)境下，橡膠制品中殘留的N-亞硝胺可能被釋放出來，進(jìn)而通過呼吸道、消化道、皮膚吸收或血液循環(huán)等方式進(jìn)入人體，對(duì)人體造成巨大危害[1]。我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心2018年發(fā)布的《化學(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》中，明確要求密封件中應(yīng)關(guān)注亞硝胺及類似結(jié)構(gòu)化合物的檢出。亞硝胺、亞硝基類物質(zhì)在現(xiàn)有分析技術(shù)條件下應(yīng)不得檢出(歐盟指令為亞硝胺浸出不得過0.01 mg/kg彈性體，亞硝基類物質(zhì)浸出不得過0.1 mg/kg彈性體)。由于現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 24153-2009)《橡膠及彈性體材料N-亞硝基胺的測(cè)定》中的方法的測(cè)定下限為0.5 mg/kg，不能滿足安全性評(píng)價(jià)的需求，因此需建立更加靈敏的分析方法。

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)亞硝胺殘留測(cè)定的研究較多，但多集中在食品[2 - 6]、水[7,8]和各種日用橡膠制品，如橡膠密封材料[9,10]、嬰兒奶嘴[11,12]、橡膠玩具[13 - 15]，橡膠手套[16,17]及避孕套[18,19]，在藥劑中也有涉及[20]，而對(duì)醫(yī)用橡膠材料中殘留的亞硝胺類物質(zhì)評(píng)價(jià)工作開展較少[21]。由于各種不同種類的橡膠制品在藥品包裝材料及醫(yī)療器械中均有相當(dāng)數(shù)量的使用，如橡膠塞、注射器活塞及植入類硅橡膠器械等，其臨床使用的特點(diǎn)及與人體接觸方式的特殊性也要求更合理的設(shè)計(jì)樣品浸提條件，從而科學(xué)評(píng)估該類產(chǎn)品的安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究針對(duì)醫(yī)療器械及藥品包裝材料中使用的橡膠彈性體，采用極限浸提法對(duì)樣品中的亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行浸提，并利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式，對(duì)49批次醫(yī)用橡膠彈性體中的亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，為醫(yī)用橡膠材料中殘留的亞硝胺類物質(zhì)的評(píng)價(jià)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ-8000 Evo氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)，Thermo Fisher公司)；超聲波恒溫清洗機(jī)(寧波新芝)；Vortex-2渦旋振蕩器(美國(guó)，Scientific Industries)；高速離心機(jī)(德國(guó)，Sigma公司)；Cleanert Nitro亞硝胺專用凈化管(艾吉爾公司)。

12種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品(表1)：o2si，批號(hào)：353499，純度100 mg/L；內(nèi)標(biāo)N-亞硝基二異丙胺(NDiPA)標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批號(hào)：157733ME，純度100 mg/L；丙酮：色譜純，F(xiàn)isher。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制精密吸取12種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品適量于容量瓶中，加入丙酮稀釋至1 mg/L，得到亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃下避光保存。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液的配制精密吸取NDiPA標(biāo)準(zhǔn)品適量于容量瓶中，加入丙酮稀釋至10 mg/L，得到NDiPA內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃下避光保存。精密移取NDiPA內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液適量，加入丙酮稀釋至20 ng/mL，得到NDiPA內(nèi)標(biāo)工作溶液，于4 ℃下避光保存。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：HP-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；柱升溫程序：40 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速率升溫至140 ℃，保持5 min，以50 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持10 min(共計(jì)31.5 min)；載氣：高純氦；柱流速：1.5 mL/min。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)電離源，電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃，溶劑延遲：3.5 min；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 13種亞硝胺SRM條件

1.4 樣品前處理

對(duì)膠塞、活塞、護(hù)帽、硅橡膠產(chǎn)品，將其剪碎成3 mm×3 mm左右的小顆粒，按照2 mL/g的比例加入內(nèi)標(biāo)溶液，將容器密封并充分混勻，置于40 ℃水浴中超聲浸提1 h，放至室溫后，取浸提液于亞硝胺專用凈化柱中，渦旋混勻后離心，取上清液進(jìn)樣分析測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的建立

2.1.1 色譜柱篩選采用12種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜柱篩選。本研究主要對(duì)DB-WAX柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)和HP-FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)兩種色譜柱進(jìn)行考察。結(jié)果表明，HP-FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)能夠較好地實(shí)現(xiàn)12種亞硝胺的分離，且峰形良好，基線背景較低，出峰時(shí)間最短，故選擇該色譜柱進(jìn)行亞硝胺分離。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化通過優(yōu)化色譜分離條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)12種亞硝胺的有效分離，縮短總體運(yùn)行時(shí)間，并增加內(nèi)標(biāo)1種。優(yōu)化后的色譜圖見圖1。

圖1 13種亞硝胺總離子流(TIC)色譜圖

2.1.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化對(duì)13種亞硝胺進(jìn)行質(zhì)譜全掃描，選取特征離子作為母離子，通過二級(jí)質(zhì)譜選擇相應(yīng)的子離子對(duì)，采用儀器自動(dòng)優(yōu)化SRM離子對(duì)的方式進(jìn)行碰撞能量?jī)?yōu)化，最終確定了定量和定性離子對(duì)以及最優(yōu)碰撞能量。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1，定量質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 13種亞硝胺MRM色譜圖

2.2 樣品極限浸提條件優(yōu)化

2.2.1 浸提溶劑選擇考慮到不同種類亞硝胺的溶解性，首先進(jìn)行浸提溶劑的篩選。選擇甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷、水5種不同極性的溶劑，分別對(duì)廠家A的樣品(已知含有NDPHA和NDBzA)進(jìn)行浸提，將樣品活塞剪碎成3 mm×3 mm小顆粒，稱取1 g并加入5 mL溶劑，于25 ℃超聲1 h，浸提液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后進(jìn)樣分析。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，丙酮對(duì)樣品中NDPHA、NDBzA提取效果最好。

此外，為考察溶劑效應(yīng)，分別使用甲醇、丙酮配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測(cè)試，12種亞硝胺峰面積相近，故可判定甲醇及丙酮對(duì)12種亞硝胺溶解及測(cè)試無影響。同時(shí)，由于甲醇作為溶劑時(shí)可能對(duì)某些化合物有溶劑效應(yīng)，因此本研究選用丙酮作為浸提溶劑。

2.2.2 浸提溫度選擇考慮到橡膠彈性體在使用時(shí)可能會(huì)接觸人體，也可能在較高的室溫下使用，故比較了25 ℃與40 ℃的浸提能力。選用廠家A的樣品，分別在25 ℃和40 ℃超聲0.5 h浸提，取浸提液過濾后測(cè)試。結(jié)果表明，40 ℃時(shí)的浸提效果優(yōu)于25 ℃。同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的超聲穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)，配制一定濃度的亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，分別在25 ℃和40 ℃超聲0.5 h后進(jìn)樣測(cè)試，結(jié)果表明兩種溫度下超聲對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積無明顯影響。綜合樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試結(jié)果，選擇40 ℃為浸提溫度。

2.2.3 極限浸提條件按照2 mL/g的比例加入丙酮，在40 ℃超聲下分別浸提0.5、1.0、1.5 h后，將浸提液過濾后進(jìn)樣測(cè)試，按時(shí)間段計(jì)算目標(biāo)物的浸提量，以浸提出測(cè)得的累積殘留量無明顯增加的時(shí)間作為極限浸提。結(jié)果表明，樣品在超聲1 h后，浸提得到的量無明顯增加，故選擇1 h作為極限浸提時(shí)間。

2.3 樣品前處理方式優(yōu)化

本研究對(duì)C18小柱、亞硝胺專用柱及直接過濾進(jìn)樣幾種前處理方式進(jìn)行了比較。傳統(tǒng)的C18小柱需進(jìn)行柱活化、上樣、淋洗、濃縮等過程，操作比較復(fù)雜，而且濃縮過程會(huì)導(dǎo)致亞硝胺的揮發(fā)而使回收率偏低；直接過濾進(jìn)樣會(huì)使得萃取液中大量的抗氧劑、添加劑等雜質(zhì)直接進(jìn)入色譜柱，帶來系統(tǒng)污染。而使用亞硝胺凈化專用柱只需取浸提液渦旋混勻后離心，即可取上清液進(jìn)樣測(cè)試，該方法操作簡(jiǎn)單，可不經(jīng)過濃縮直接進(jìn)樣，并能有效減少浸提液中雜質(zhì)的干擾，減少了樣品損失。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性對(duì)空白溶液及樣品溶液分別進(jìn)樣分析，得到色譜圖3、圖4(標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2)。由圖可知，13種亞硝胺可得到完全分離，且空白溶液及樣品基質(zhì)對(duì)化合物出峰無干擾。

圖3 空白溶劑色譜圖(丙酮)

圖4 樣品溶液色譜圖

2.4.2 檢出限與定量限配制不同濃度亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測(cè)試，以信噪比(S/N)=3時(shí)的濃度作為該化合物的檢出限；配制不同濃度亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白橡膠樣品(不含亞硝胺)中，經(jīng)過極限浸提后過凈化柱，進(jìn)樣測(cè)試，以S/N≥10時(shí)的濃度作為該物質(zhì)的定量限，結(jié)果見表2。

表2 12種亞硝胺的檢出限(LODs)及定量限(LOQs)

2.4.3 線性范圍以內(nèi)標(biāo)溶液作為溶劑，配制濃度為0.6～200 ng/mL的12種亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化條件下進(jìn)樣分析。各化合物的線性范圍見表3。

表3 12種亞硝胺的線性方程及線性范圍

2.4.4 精密度與準(zhǔn)確度選取低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行精密度測(cè)試，結(jié)果見表4。選取空白鹵化丁基膠塞樣品(無亞硝胺)，剪成3 mm×3 mm顆粒，按照2 mL/g的比例加入內(nèi)標(biāo)溶液，并分別加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，超聲提取，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。每個(gè)化合物選取低、中、高3個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行3次?；厥章式Y(jié)果見表4。

表4 12種亞硝胺精密度及回收率

(續(xù)表4)

2.5 樣品測(cè)試

選取鹵化丁基橡膠塞產(chǎn)品25批次(來源12個(gè)生產(chǎn)廠家，其中進(jìn)口2家，國(guó)產(chǎn)10家)，鹵化丁基橡膠活塞18批次，聚異戊二烯橡膠護(hù)帽1批次，硅橡膠醫(yī)療器械5批次進(jìn)行分析測(cè)試。25批次鹵化丁基橡膠塞中有14批次有檢出，檢出NDEA、NDBA、NEPHA、NPIP、NPYR、NMOR及NDBzA 7種亞硝胺。18批次鹵化丁基橡膠活塞均檢出亞硝胺物質(zhì)，共檢出NDMA、NDEA、NDBA、NEPHA、NPIP、NPYR、NMOR、NDPHA及NDBzA 9種亞硝胺。1批次聚異戊二烯橡膠護(hù)帽中檢出NDBzA，5批次硅橡膠醫(yī)療器械中有3批次檢出亞硝胺物質(zhì)，共檢出NDEA及NDBzA 2種亞硝胺。通過49批次樣品中檢出的N-亞硝胺的種類及含量情況可以看出，12種N-亞硝胺類物質(zhì)除NEMA、NDPA、NMPHA外，其余9種均有檢出，且NEPHA、NDPHA及NDBzA最高含量均已超過200 ng/g。

從以上試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹵化丁基橡膠活塞中檢出的亞硝胺物質(zhì)種類最多，共9種，鹵化丁基橡膠塞中檢出了7種亞硝胺物質(zhì)，醫(yī)用硅橡膠中亞硝胺檢出的種類最少，且含量較低。

膠塞和活塞樣品屬于藥品包裝材料中最為常用的橡膠彈性體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活塞中檢出的亞硝胺種類及數(shù)量均高于膠塞。就材質(zhì)來講，膠塞和活塞均屬于鹵化丁基橡膠，而活塞中檢出的亞硝胺種類及含量均高于膠塞，可能是由于活塞的生產(chǎn)過程中加入了炭黑，而炭黑的表面積較大，容易吸附氮氧化物，在一定程度上促進(jìn)了N-亞硝胺的形成[1]，故殘留量較多。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)醫(yī)用橡膠彈性體及硅橡膠等藥品包裝材料和醫(yī)療器械，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式，對(duì)膠塞、活塞、護(hù)帽及硅橡膠醫(yī)療器械等產(chǎn)品中的亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。建立的方法可對(duì)12種亞硝胺及1種亞硝胺內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)良好分離，線性范圍寬，靈敏度高。對(duì)49批次樣品定量分析發(fā)現(xiàn)，目前醫(yī)用橡膠彈性體中仍然有不同程度的亞硝胺殘留。由于檢測(cè)的產(chǎn)品種類多數(shù)量大，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有助于生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門對(duì)目前市場(chǎng)上醫(yī)用橡膠彈性體中亞硝胺殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定提供技術(shù)依據(jù)。