樊輕亞， 王萬好

(1.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，河南信陽 464000;2.河南同源制藥有限公司，河南信陽 464000)

還亮草(DelphiniumanthriscifoliumHance)屬毛茛科、翠雀屬多年生草本植物,分布于我國廣東、廣西、貴州、浙江、江西、河南等省，用于治療風(fēng)濕痛、半身不遂、癰瘡癬癩等疾病。藥用還亮草中的主要有效成分是生物堿類物質(zhì)，發(fā)揮重要的藥理作用[1]。因此，研究還亮草中生物堿成分具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

濁點(diǎn)萃取(Cloud Point Extraction，CPE)是一種新型分離技術(shù)，該技術(shù)主要利用表面活性劑溶液的增溶和分相實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)的分離和富集。濁點(diǎn)萃取不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，無毒，操作方便，同時(shí)具有很高的富集效率，在中藥材有效成分的萃取分離中具有良好的應(yīng)用前景[2 - 12]。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)具有精密度高、準(zhǔn)確度好、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在中藥的定性定量分析中具有廣泛的應(yīng)用[13 - 17]。本文采用濁點(diǎn)萃取方法分離富集還亮草中的生物堿成分，并與UPLC-MS/MS聯(lián)用測定該藥材中5種生物堿的含量，為還亮草的開發(fā)和應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

美國 Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源。DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司)。

洋翠雀堿、高硬飛燕草堿、硬飛燕次堿、硬飛燕草堿、巴比翠雀堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。精密稱取洋翠雀堿、高硬飛燕草堿、硬飛燕次堿、硬飛燕草堿、巴比翠雀堿5種對(duì)照品各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，得各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別吸取儲(chǔ)備溶液各1 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容后即得混合對(duì)照品溶液。甲醇、乙腈(色譜純，德國默克)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

還亮草藥材均購于網(wǎng)絡(luò)藥材市場，經(jīng)鑒定為還亮草(DelphiniumanthriscifoliumHance)全草。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微波輔助提取稱取一定量100目的還亮草藥材粉末于提取罐中，按照1∶60的料液比加入95%乙醇后，置于密閉微波瓶中，加熱提取(80 ℃，10 min)，提取液在60 ℃下?lián)]干，用甲醇定容至200 mL，備用[18]。

1.2.2 濁點(diǎn)萃取取一定量的Triton X-114，加入一定量的水，超聲溶解，配制成4%的Triton X-114溶液，加入0.4 g的NaCl振搖，靜置，使形成濁點(diǎn)體系。取“1.2.1”濃縮液于離心管中，揮干溶劑，加入配制好的Triton X-114濁點(diǎn)體系溶液，超聲溶解，用稀HCl調(diào)節(jié)pH值為8，55 ℃水浴平衡25 min，分層后在3 000 r/min下離心5 min。取下相置于圓底燒瓶中，揮干，用甲醇定容至10 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后，用UPLC-MS/MS法測定。

1.2.3 溶劑法萃取取“1.2.1”濃縮液減壓抽濾，濾液旋干，用30 mL HCl(pH=2)超聲溶解，傾出，置于分液漏斗，用氯仿萃取后的水相用1%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為10，再用氯仿萃取3次，每次30 mL，收集氯仿層，旋干，用甲醇溶解，定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3 樣品分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BHE C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm；美國Waters公司)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%三乙胺(B)；梯度洗脫程序:0～3 min，2%～10%A；3～8 min，10%～50%A；8～10 min，50%～70%A； 10～15 min，70%～2%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子(ESI+)模式；離子源溫度：130 ℃；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣(N2)流速：9.0 L/min；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：2.5 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 濁點(diǎn)體系的篩選及萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 濁點(diǎn)體系的選擇本實(shí)驗(yàn)分別選用Triton X-100、Triton X-114、Span-80、Tween-80、 PONPE 7.5、Genapol X-080、油酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯作為表面活性劑，加入NaCl和一定量的水超聲溶解形成濁點(diǎn)萃取體系溶液，水浴加熱，測定其濁點(diǎn)溫度。結(jié)果顯示：Tween-80、Span-80、PONPE 7.5分相較慢；Genapol X-080、油酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯表面活性劑聚集成糊狀；Triton X-100、Triton X-114分相較快，表面活性劑富集在下相。但Triton X-100濁點(diǎn)溫度為65 ℃，而Triton X-114濁點(diǎn)溫度為35 ℃，濁點(diǎn)溫度較低，因此選擇萃取體系中Triton X-114作為表面活性劑，NaCl作為添加劑進(jìn)行萃取。

2.1.2 Triton X-114濃度和 NaCl添加量對(duì)萃取率的影響本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的表面活性劑和不同NaCl的添加量對(duì)還亮草中生物堿萃取率的影響。從圖1(a)中可以看出生物堿的提取率隨Triton X-114濃度的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢。這是因?yàn)楸砻婊钚詣舛冗^低時(shí)，萃取分層時(shí)表面活性劑富集相過少，無法進(jìn)行相分離，隨著濃度的增大，形成的膠束越來越多，增溶作用越強(qiáng)，越有利于生物堿的提取。但在Triton X-114濃度高于4%之后，提取效率呈下降趨勢。因?yàn)殡S著表面活性劑濃度的增大，溶液黏度增大，擴(kuò)散能力減弱，膠束難滲入到基質(zhì)的內(nèi)部，導(dǎo)致膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致提取率降低。因此，Triton X-114的最佳濃度為4%。圖1(b)表明，隨著NaCl用量的增加，萃取效率一直呈上升趨勢， NaCl用量增加到0.4 g，達(dá)到了平衡。這是因?yàn)槿芤褐屑尤腚娊赓|(zhì) NaCl 可增大表面活性劑膠團(tuán)的聚集數(shù)，增大溶液離子強(qiáng)度，使水相密度增大，加速兩相分離，降低了濁點(diǎn)溫度，從而提高對(duì)還亮草生物堿的增溶能力。因此選擇NaCl的加入量為0.4 g。

圖1 Triton X-114的濃度和 NaCl的用量對(duì)還亮草生物堿萃取率的影響

2.1.3 pH對(duì)萃取率的影響在濁點(diǎn)萃取中，待測物與非離子表面活性劑膠束以疏水分配為主要方式，樣品溶液pH值影響兩相分配的效果，通常情況下會(huì)將其酸度值調(diào)至物質(zhì)呈電中性狀態(tài)，易于與膠束結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中的5種生物堿均顯弱堿性，加稀HCl或稀氨水調(diào)節(jié)pH值至5～10。由圖2可知pH為8時(shí)，萃取率最大。這是因?yàn)樵谒嵝原h(huán)境下，弱堿性物質(zhì)易電離成離子狀態(tài)，不易與表面活性劑結(jié)合，難以被膠束萃取，故萃取率較低。而當(dāng)萃取物pH過高時(shí)，使表面活性劑富集相由下相轉(zhuǎn)移至溶液上層，不便于兩相分離。因此選擇HCl調(diào)節(jié)pH值為8比較合適。

圖2 pH值對(duì)還亮草中生物堿萃取率的影響

2.1.4 平衡溫度和平衡時(shí)間對(duì)萃取率的影響本文分別考察了在25～85 ℃水浴中平衡5～30 min對(duì)萃取率的影響。結(jié)果如圖3所示，萃取體系在水浴溫度55 ℃下平衡25 min時(shí)萃取率達(dá)到最大。這是因?yàn)楫?dāng)平衡溫度低于表面活性劑濁點(diǎn)時(shí)，兩相系統(tǒng)無法形成；平衡溫度上升，在水溶液中，以水合形式存在的表面活性劑會(huì)使膠束中氫鍵斷裂脫水，使表面活性劑富集相體積減小，表面活性劑更易沉降，引發(fā)更好的相分離，所以平衡溫度要稍高于濁點(diǎn)溫度約15～25 ℃，當(dāng)溫度過高時(shí)，容易引起藥物氧化分解，故萃取率下降[19]。延長平衡時(shí)間有利于目標(biāo)物在濁點(diǎn)體系中的分配，當(dāng)平衡時(shí)間為25 min時(shí)，萃取率基本達(dá)到平穩(wěn)的狀態(tài)，若過長的平衡時(shí)間反而會(huì)增加樣品的處理時(shí)間，同時(shí)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)周期。

圖3 平衡溫度和平衡時(shí)間對(duì)還亮草生物堿萃取率的影響

通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化得到了濁點(diǎn)萃取還亮草中5種生物堿的最優(yōu)條件：4%的Trion X-114，NaCl的添加量為0.4 g，溶液的pH值調(diào)節(jié)為8，平衡溫度55 ℃，平衡時(shí)間25 min。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化對(duì)還亮草濁點(diǎn)萃取后的提取液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，考察了有機(jī)相溶劑(乙腈、甲醇)與水，以及不同種類的緩沖溶液作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果和對(duì)離子化程度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，分離度更好，且能明顯縮短分析時(shí)間，而在流動(dòng)相中加入一定比例的三乙胺可以改善峰形，減少色譜峰拖尾。因此，本實(shí)驗(yàn)以乙腈-0.1%三乙胺溶液為流動(dòng)相，選擇梯度洗脫方式，5種生物堿成分可以得到良好分離，且各色譜峰的峰形好、柱效高。所得總離子流色譜圖如圖4所示。

圖4 藥用還亮草濁點(diǎn)萃取后提取液的總離子流(TIC)色譜圖

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化和裂解一級(jí)質(zhì)譜在全掃描模式下，同時(shí)采集正、負(fù)離子信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESI-模式下幾乎無質(zhì)譜響應(yīng)，因此選擇 ESI+模式，分別找出5種化合物的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。并對(duì)干燥氣體、霧化器壓力、干燥氣流量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，然后對(duì)母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，選取所得豐度較高的兩個(gè)子離子作為特征離子，選擇響應(yīng)最高的子離子作為定量離子。5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 5種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)

在ESI+-MS/MS條件下，5種化合物主要發(fā)生側(cè)鏈斷裂，根據(jù)二質(zhì)譜級(jí)數(shù)據(jù)，可以推測5種化合物均發(fā)生A和B兩種裂解路徑。5種化合物的 A裂解方式都相同，即16位脫甲氧基；B裂解途徑中硬飛燕次堿和硬飛燕草堿發(fā)生1位羥基的斷裂，高硬飛燕草堿和洋翠雀堿發(fā)生4位酯基的斷裂，巴比翠雀堿發(fā)生6位的脫羧反應(yīng)。5種化合物質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 5種生物堿的質(zhì)譜裂解途徑

2.3 線性范圍、檢出限與加標(biāo)回收率

取5種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化濁點(diǎn)萃取及UPLC-MS/MS法分析測定。以目標(biāo)定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取已知含量的還亮草樣品 3 份，分別添加 0.1 mg/g、0.25 mg/g、0.50 mg/g 3個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品溶液，采用“1.2.1”及“1.2.2”方法進(jìn)行提取和萃取，在優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)樣定量分析，每個(gè)水平做6個(gè)平行，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。5種生物堿的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(S/N=3)及加標(biāo)回收率結(jié)果見表2。

表2 5種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍、檢出限及加標(biāo)回收率

2.4 穩(wěn)定性與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取供試樣品和混合對(duì)照品溶液，于室溫下放置0～24 h后，分別于0、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣進(jìn)行測定。結(jié)果表明供試樣品和對(duì)照品溶液在24 h穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD小于2.5%。

2.5 萃取方法的比較及應(yīng)用

精密稱取3個(gè)產(chǎn)地還亮草藥材各100 g，按照“1.2.1”方法提取后，分別按照“1.2.3”濁點(diǎn)萃取法(CPE)和“1.2.4”溶劑法(SE)萃取，然后按“1.3”方法測定其含量，結(jié)果見表3。由表3可知，3個(gè)產(chǎn)地的還亮草生物堿含量分布不同，3個(gè)產(chǎn)地中硬飛燕草堿含量最高，廣西產(chǎn)地的5種生物堿含量明顯高于其它兩地，可能和該植物生長時(shí)所需的溫度與地質(zhì)條件有關(guān)。3批還亮草中采用濁點(diǎn)萃取法的萃取率是傳統(tǒng)溶劑萃取法的2倍左右，可能由于傳統(tǒng)溶劑萃取法操作復(fù)雜，提取后需經(jīng)過多次萃取，在進(jìn)行氯仿萃取時(shí)每次都需要蒸發(fā)溶劑，導(dǎo)致待測物在蒸發(fā)及多次的轉(zhuǎn)移過程中損失較多；而濁點(diǎn)萃取法集分離富集與一體，操作簡便，和傳統(tǒng)溶劑法相比不需要蒸發(fā)溶劑，避免了待測物的損失，所以萃取率比傳統(tǒng)溶劑法高。且濁點(diǎn)萃取法中所用表面活性劑無毒無害，用量小，降低了污染，且能夠保護(hù)被萃取物質(zhì)的原有特性，能夠提供較高的萃取率，是一種環(huán)境友好型的萃取富集方法，符合綠色化學(xué)發(fā)展的要求。

表3 3個(gè)批次還亮草藥材5種生物堿的提取分析結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本文將濁點(diǎn)萃取技術(shù)應(yīng)用于還亮草中生物堿的萃取，并優(yōu)化了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定生物堿的條件。該萃取方法簡單快速，萃取效率高，是一種高效的、具有極大發(fā)展前景的萃取技術(shù)；超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，分離度好，可以縮短分析時(shí)間，滿足還亮草藥材中5種生物堿成分的同時(shí)檢測要求，可為還亮草制劑的開發(fā)及質(zhì)量控制提供了可靠依據(jù)。