楊雪晴，徐 偉，肖春萍，孫 金，馮禹壯

米泔水制北蒼術(shù)炮制工藝及其抗腹瀉藥效作用研究

楊雪晴，徐 偉，肖春萍*，孫 金，馮禹壯

長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117

對米泔水制北蒼術(shù)的最佳炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對其抗腹瀉作用進(jìn)行研究。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，以蒼術(shù)素、浸出物和外觀性狀為綜合評價(jià)指標(biāo)，對米泔水用量、悶潤時(shí)間、炒制溫度和炒制時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察，確定米泔水制北蒼術(shù)的最佳炮制工藝。建立脾虛泄瀉癥大鼠模型，比較給藥前后大鼠體質(zhì)量和糞便含水率變化，并采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和分泌型免疫球蛋白（secreted immunoglobulin，SIgA）含量。響應(yīng)面法得出米泔水制北蒼術(shù)的最佳炮制工藝為米泔水中米水比例為1∶60，米泔水用量25 mL，炒制溫度160 ℃，炒制時(shí)間30 min；與模型組比較，高劑量組米泔水制北蒼術(shù)醇提取物可使脾虛泄瀉大鼠的糞便含水率和DAO含量顯著降低（＜0.01），體質(zhì)量和SIgA含量顯著增加（＜0.01），且接近陽性藥水平；生蒼術(shù)醇提取物對脾虛泄瀉大鼠的糞便含水率、體質(zhì)量、SIgA和DAO含量改善效果低于米泔水制北蒼術(shù)（＜0.05、0.01）。響應(yīng)面法簡便穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠，可用于優(yōu)化米泔水制北蒼術(shù)炮制工藝，且米泔水制北蒼術(shù)醇提物的抗腹瀉作用藥效顯著。

北蒼術(shù)；米泔水；炮制工藝；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；抗腹瀉；蒼術(shù)素；脾虛泄瀉癥；酶聯(lián)免疫吸附法；二胺氧化酶；分泌型免疫球蛋白

北蒼術(shù)是《中國藥典》蒼術(shù)藥材來源之一，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效[1-2]。生蒼術(shù)性燥，古籍中收載的蒼術(shù)泔水制、麥麩炒、炒焦等20多種炮制方法[3]，其炮制原理多為“炮制減燥”。其中，最早記載的蒼術(shù)炮制方法為米泔水制，見于《銀海精微》[4]，被認(rèn)為具有緩和燥性、增強(qiáng)健脾和胃的作用，而《中國藥典》2020年版中只收載“麩炒”法，這極大地限制了米泔水制北蒼術(shù)的傳承和發(fā)展。

北蒼術(shù)的主要活性成分為蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮和β-桉葉醇等揮發(fā)油成分[5-6]，具有抗?jié)兒涂咕?、抗炎等藥理作用[7]。據(jù)報(bào)道，蒼術(shù)中揮發(fā)油過量會(huì)對人體產(chǎn)生副作用（“燥性”），通過炮制可降低蒼術(shù)中揮發(fā)油含量，從而降低燥性、緩和藥性并增強(qiáng)健脾作用，而對蒼術(shù)素含量影響較小[7-8]。宋代《太平惠民和劑局方》中的和氣散、參術(shù)散等方中均有應(yīng)用蒼術(shù)“米泔浸品”治療脾胃不和及泄瀉病癥的歷史[9]。在日本漢方醫(yī)學(xué)中，蒼術(shù)也常作為利尿藥和止痛藥，被用來治療胃腸疾病[10-12]。腹瀉是臨床上常見的消化道疾病之一，其中脾虛泄瀉導(dǎo)致腹瀉的主要原因是脾虛、氣虛，脾胃運(yùn)化功能失調(diào)導(dǎo)致水谷不化、濕熱內(nèi)生，從而導(dǎo)致腸道運(yùn)輸功能障礙[13]。中醫(yī)藥理論認(rèn)為，治療脾虛泄瀉根本在于補(bǔ)氣健脾[14]，通過補(bǔ)脾，改善胃腸功能達(dá)到止瀉效果。米泔水制可去除部分油脂，降低藥材的辛燥之性，增強(qiáng)其補(bǔ)脾和中作用[15]。然而，應(yīng)用米泔水制北蒼術(shù)治療脾虛泄瀉的研究尚未見報(bào)道。

因此，本研究以蒼術(shù)素、浸出物和外觀性狀為綜合評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選米泔水制北蒼術(shù)最佳炮制工藝；同時(shí)以脾虛泄瀉癥大鼠為模型，考察了大鼠體質(zhì)量、糞便含水率、血清中二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和分泌型免疫球蛋白（secreted immunoglobulin，SIgA）等指標(biāo)，進(jìn)一步評價(jià)蒼術(shù)米泔制前后的抗腹瀉藥效作用，旨在完善米泔水制北蒼術(shù)炮制工藝并明確其治療腹瀉作用，為米泔水制北蒼術(shù)規(guī)范化應(yīng)用提供參考，也為進(jìn)一步拓展米泔水制北蒼術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 儀器與材料

LC-2030高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理中國有限公司；MS-5型炒貨機(jī)，浙江邁斯機(jī)械制造有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

生蒼術(shù)飲片，批號20200206，河北省安國市榮華本草中藥材有限公司，由長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為菊科蒼術(shù)屬植物北蒼術(shù)(DC.) Koidz.的干燥根莖。生大黃飲片，批號200802，河北省安國市安興中藥飲片有限公司，由長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為廖科大黃屬植物藥用大黃Baill.的干燥根莖；鹽酸小檗堿片，批號H51022193，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司；蒼術(shù)素對照品，批號P29N9F76159，HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)用SPF級雄性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量200～220 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號SCXK（遼）2020-0001，質(zhì)量合格證號210726210100208713，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號2020317。

2 方法與結(jié)果

2.1 米泔水制北蒼術(shù)的制備

將適量米泔水（用2 kg大米粉過7號篩后加入100 kg水中充分?jǐn)嚢韬蟠鎇16]）均勻噴淋至100 g北蒼術(shù)飲片上，拌勻，悶潤一定時(shí)間后，置于炒藥機(jī)內(nèi)炒至飲片表面呈黃色或棕黃色后取出，晾干，即得蒼術(shù)米泔水制品。

2.2 米泔水制北蒼術(shù)中蒼術(shù)素的含量測定

2.2.1 對照品溶液和供試品溶液的制備 參照《中國藥典》2020年版I部蒼術(shù)藥材項(xiàng)下含量測定方法制備蒼術(shù)素對照品溶液和北蒼術(shù)供試品溶液，并按藥典規(guī)定色譜條件進(jìn)行檢測[1]。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取蒼術(shù)素對照品溶液（40 μg/mL），分別稀釋成質(zhì)量濃度為4、8、12、16、20、28、36、40 μg/mL的溶液，各吸取10 μL測定其峰面積，以不同質(zhì)量濃度的蒼術(shù)素對照品溶液為橫坐標(biāo)（），相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蒼術(shù)素線性回歸方程為＝130 776＋86 970，＝0.999 7，結(jié)果表明蒼術(shù)素在4～40 μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取同一批次（批號20200206）北蒼術(shù)供試品溶液，按藥典色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得蒼術(shù)素峰面積的RSD為0.53%，表明所使用的儀器具有良好的精密度。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次（批號20200206）北蒼術(shù)供試品溶液，按藥典色譜條件分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測定，測得蒼術(shù)素峰面積RSD為0.94%，結(jié)果表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次（批號20200206）北蒼術(shù)飲片，同法制成6份供試品溶液，按藥典色譜條件分別進(jìn)樣測定，測得蒼術(shù)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.66%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批次北蒼術(shù)樣品（批號20200206）6份，每份約0.10 g，精密稱定，分別精密加入約含0.3 mg蒼術(shù)素對照品溶液，按供試品溶液制備方法操作，按藥典色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算蒼術(shù)素的加樣回收率，結(jié)果測得蒼術(shù)素平均加樣回收率為99.28%，RSD為0.76%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

通過文獻(xiàn)查閱[8,27-28]及飲片廠生產(chǎn)實(shí)際，選擇米泔水用量、炒制時(shí)間、炒制溫度、米泔水中米水比例和悶潤時(shí)間進(jìn)行單因素考察。

2.3.1 悶潤時(shí)間 取4份蒼術(shù)飲片，每份100 g，加入米水比例為1∶50的米泔水20 mL，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，悶潤1 h內(nèi)北蒼術(shù)飲片不能完全潤透，故選取悶潤1、2、3、4 h，150 ℃下炒制30 min即得。由表1可知，悶潤4 h時(shí)，悶潤效果最好，但考慮悶潤時(shí)間過長，炮制成本和效率不高，參考飲片加工廠炮制實(shí)際參數(shù)，綜合比較選擇悶潤2 h進(jìn)行后續(xù)研究，可將蒼術(shù)飲片完全潤透，成品性狀完全達(dá)到制品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，有效成分蒼術(shù)素含量相對較高。

2.3.2 米泔水用量 取4份蒼術(shù)飲片，每份100 g，加入米水比例為1∶50的米泔水10、20、30、40 mL，悶潤時(shí)間2 h，150 ℃炒制30 min即得。由表2可知，隨米泔水用量增加，蒼術(shù)素含量逐漸升高；當(dāng)米泔水用量達(dá)30 mL時(shí)，蒼術(shù)素含量最高，而當(dāng)米泔水用量達(dá)40 mL時(shí)，掰斷飲片發(fā)現(xiàn)藥材有“傷水”現(xiàn)象[17]，對藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響，故選擇米泔水用量為10～30 mL進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 悶潤時(shí)間對蒼術(shù)素含量的影響(, n = 3)

Table 1 Effect of moistening time on content of atractylodin (, n = 3)

悶潤時(shí)間/h蒼術(shù)素/% 10.533±0.050 20.530±0.044 30.577±0.085 40.627±0.025

表2 米泔水用量對蒼術(shù)素含量的影響(, n = 3)

Table 2 Effect of rice swill dosage on content of atractylodin (, n = 3)

米泔水用量/mL蒼術(shù)素/% 100.343±0.012a 200.373±0.068a 300.470±0.035b 400.443±0.006b

同列不同小寫字母表示不同組別間差異顯著（＜0.05），下表同

different lowercase letters in the table indicate significant differences among different groups (< 0.05), same as below tables

2.3.3 米泔水中米水比例 取4份蒼術(shù)飲片，每份100 g，加入米水比例1∶25、1∶50、1∶75、1∶100的米泔水20 mL，悶潤時(shí)間2 h，150 ℃炒制30 min即得。由表3可知，隨米水比例增加，蒼術(shù)素含量先升高后降低，并于米水比例1∶75時(shí)蒼術(shù)素含量最高，1∶100時(shí)含量最低，結(jié)合1987年版《吉林省中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)》相關(guān)參數(shù)[18]，故選擇米水比例為1∶25、1∶50、1∶75進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3.4 炒制溫度 取4份蒼術(shù)飲片，每份100 g，加入米水比例1∶50的米泔水20 mL，悶潤時(shí)間2 h，130、140、150、160 ℃炒制30 min即得。由表4可知，隨炒制溫度升高，蒼術(shù)素含量呈波浪形變化，但當(dāng)炒制溫度低于130 ℃時(shí)，炒制時(shí)間過長，超過170 ℃時(shí)，飲片容易產(chǎn)生焦斑或糊化現(xiàn)象，綜合考慮蒼術(shù)素含量和飲片外觀性狀，本研究選擇炒制溫度140、150、160 ℃進(jìn)行后續(xù)研究。

表3 米水比例對蒼術(shù)素含量的影響(, n = 3)

Table 3 Effect of rice water ratio on content of atractylodin (, n = 3)

米水比例蒼術(shù)素/% 1∶250.585±0.007a 1∶500.535±0.021a 1∶750.685±0.049b 1∶1000.530±0.026a

表4 炒制溫度對蒼術(shù)素含量的影響(, n = 3)

Table 4 Effect of frying temperature on content of atractylodin (, n = 3)

炒制溫度/℃蒼術(shù)素/% 1300.483±0.006a 1400.577±0.006b 1500.543±0.015b 1600.600±0.026b

2.3.5 炒制時(shí)間 取4份蒼術(shù)飲片，每份100 g，加入米水比例1∶50的米泔水20 mL，悶潤時(shí)間2 h，150 ℃炒制10、20、30、40 min即得。由表5可知，隨炒制時(shí)間增加，蒼術(shù)素含量逐漸增高且在30 min達(dá)到最大；當(dāng)炒制時(shí)間小于20 min時(shí)，炒制后飲片半干，外觀性狀不符合要求，故綜合考慮，本研究選擇炒制時(shí)間20、30、40 min進(jìn)行后續(xù)研究。

表5 炒制時(shí)間對蒼術(shù)素含量的影響(, n = 3)

Table 5 Effect of frying time on content of atractylodin (, n = 3)

炒制時(shí)間/min蒼術(shù)素/% 100.525±0.007a 200.595±0.050b 300.607±0.023b 400.597±0.021b

2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化蒼術(shù)米泔水制工藝

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步選取米泔水用量（1）、米水比例（2）、炒制溫度（3）、炒制時(shí)間（4）為優(yōu)化因素，采用Design-Expert 8.0.7.1軟件進(jìn)行4因素3水平Box- Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。參考藥典規(guī)定和文獻(xiàn)方法[19]，以蒼術(shù)素含量（1）、醇溶性浸出物得率（2）、水溶性浸出物得率（3）及外觀評分（4）4個(gè)指標(biāo)的綜合評分值（）為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。水溶性浸出物和醇溶性浸出物的測定參考《中國藥典》2020版IV部浸出物規(guī)定進(jìn)行[1]，外觀評分參照表6。根據(jù)所測指標(biāo)在蒼術(shù)飲片質(zhì)量控制中的重要性，令1占30%、2占25%、3占25%、4占20%，得計(jì)算公式＝2/2max×0.25＋3/3max×0.25＋4/4max×0.2－1/1max×0.3[8]，其中1max、2max、3max、4max分別為蒼術(shù)素含量、醇溶性浸出物得率、水溶性浸出物得率及外觀評分的最大值，總分計(jì)為1.0。設(shè)計(jì)因素與水平見表7。米泔水制后北蒼術(shù)進(jìn)行外觀評價(jià)[8]：以片形完整、表面深黃色、散有多數(shù)棕褐色油室、散發(fā)焦香氣為標(biāo)準(zhǔn)，不得出現(xiàn)焦斑或糊化現(xiàn)象，滿分為10分。

表6 米泔水制北蒼術(shù)外觀性狀評分規(guī)則(, n = 3)

Table 6 Scoring rules for appearance characters of AC prepared with rice swill (, n = 3)

斷面顏色顏色、氣味分值 深黃色片形完整、表面散有多數(shù)棕褐色油室、散發(fā)焦香氣者9～10 淺黃色片形完整、表面散有棕褐色油室、微有焦香氣者7～8 深褐色有碎片，表面帶有焦斑、出現(xiàn)糊化5～6 其余 5分以下

2.4.2 模型擬合與方差分析 各因素回歸擬合后建立多元二次效應(yīng)面回歸模型，回歸方程為＝?0.476＋1.7321－2.0722＋9.2373＋0.093 384＋2.48012＋6.100 113－6.12614＋4.56523＋1.71124＋4.30434－4.97412－9.88422－4.14332－9.38642，2＝0.917 6。由表8方差分析結(jié)果可知，該擬合模型具有顯著性（＜0.001），且失擬項(xiàng)為0.109（＞0.05），差異不顯著，說明該模型擬合度較好，無明顯失擬因素存在。另外，2項(xiàng)的＜0.05，說明該模型中米水比例對米泔水制北蒼術(shù)飲片綜合評分有顯著影響。由各1次項(xiàng)、交互項(xiàng)、2次項(xiàng)值可知，12、23的交互作用顯著（＜0.05），12、22、32、42均達(dá)到極顯著水平（＜0.01）。

2.4.3 響應(yīng)面分析 為進(jìn)一步評價(jià)1、2、3、4之間的交互作用對米泔水制北蒼術(shù)綜合評分的影響，并確定各因素的最佳水平范圍，根據(jù)分析結(jié)果作相應(yīng)響應(yīng)曲面圖（圖1）。結(jié)果表明，米水比例（2）和炒制溫度（3）的交互作用對綜合評分影響顯著，其他因素交互作用影響較小。按照模擬方程進(jìn)行優(yōu)化，得出優(yōu)化后炮制工藝為米泔水量用量為24.72 mL，米水比例1∶64，炒制溫度160.8 ℃，炒制時(shí)間30.5 min。預(yù)測值為0.492。

2.4.4 最佳炮制工藝的確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 為方便實(shí)際工廠化操作，將優(yōu)化后的米泔水制北蒼術(shù)炮制工藝調(diào)整為將米水比例為1∶60，米泔水用量25 mL，悶潤2 h，炒制溫度160 ℃，炒制時(shí)間30 min。取3份北蒼術(shù)飲片（批號20200206）500 g，按調(diào)整后米泔水制北蒼術(shù)最佳炮制工藝進(jìn)行炮制（圖2），分別測定蒼術(shù)素含量、水溶性和醇溶性浸出物得率以及外觀評分并計(jì)算出值。由表9可見，3次驗(yàn)證結(jié)果分別為0.489、0.488、0.493，平均值為0.490（RSD為0.54%），與預(yù)測值（0.492）接近，表明調(diào)整后的米泔水制北蒼術(shù)工藝與響應(yīng)面優(yōu)化工藝結(jié)果一致，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

Table 7 Design and result of Box-Behnken response surface

編號X1/mLX2X3/℃X4/minM1/%M3/%M2/%M4Y 120 (0)1∶75 (+1)150 (0)40 (+1)0.56237.3909.2267.00.360 230 (+1)1∶50 (0)140 (?1)30 (0)0.60139.4469.2718.00.386 3301∶5015020 (?1)0.61737.2129.7447.50.358 4201∶50150300.52536.80911.26210.00.500 5201∶50150300.57738.42611.8559.00.468 6201∶25 (?1)150400.55935.67811.1886.00.356 7201∶50160 (+1)400.58633.93811.2317.00.364 8201∶25140300.64431.80311.0388.00.351 9201∶50150300.62635.93512.41310.00.470 10201∶75150200.66129.05712.3337.00.319 11201∶25150200.60730.31713.1627.00.367 12201∶50140400.61831.74911.9516.00.319 13201∶50160200.57127.08412.2767.00.346 1410 (?1)1∶75150300.61727.69011.1937.00.310 15101∶50150400.58434.4509.9268.00.374 16201∶25160300.55932.7537.8065.50.261 17301∶50150400.58034.9748.7327.50.343 18101∶50150200.60937.2538.0577.00.317 19201∶50140200.62236.1848.0697.50.319 20201∶50150300.55335.81112.2709.00.470 21301∶25150300.55033.9167.8186.00.288 22101∶50160300.56334.4669.6377.50.364 23101∶50140300.56636.48310.7008.00.409 24301∶75150300.53935.48213.2387.50.447 25201∶50150300.57434.92513.71310.00.511 26301∶50160300.55832.41312.8188.00.426 27201∶75140300.58435.03611.8627.50.398 28101∶25150300.57335.42012.3067.00.399 29201∶75160300.48734.65311.8008.50.469

表8 方差分析結(jié)果

Table 8 Results of variance analysis

來源平方和自由度均方F值P值顯著性來源平方和自由度均方F值P值顯著性 模型0.102 813147.344×10?36.0820.000 9極顯著X3X48.170×10?518.170×10?50.0680.798 6 X14.750×10?414.750×10?40.3930.540 7 X120.016 04910.016 04913.2900.002 6極顯著 X26.574×10?316.574×10?35.4440.035 1顯著X220.024 75210.024 75220.4980.000 5極顯著 X31.880×10?411.880×10?40.1550.699 5 X320.016 70410.016 70413.8330.002 3極顯著 X46.710×10?416.710×10?40.5560.468 3 X420.046 28710.046 28738.3320.000 1極顯著 X1X20.015 37610.015 37612.7340.003 1極顯著總殘差0.016 906141.208×10?3 X1X31.824×10?311.824×10?31.5100.239 4 失擬誤差0.015 253101.525×10?33.6930.109 8 X1X41.351×10?311.351×10?31.1190.308 1 純誤差1.652×10?344.130×10?4 X2X36.383×10?316.383×10?35.2860.037 4顯著總和0.119 71828 X2X46.580×10?416.580×10?40.5450.472 5

圖1 各因素對綜合評分的響應(yīng)面圖

圖2 蒼術(shù)米泔水制前(A)、后(B)飲片圖

表9 驗(yàn)證結(jié)果

Table 9 Verification results

批號M1/%M2/%M3/%M4Y 10.4313.1438.65100.489 20.4212.8338.66100.488 30.4313.3438.72100.493

2.5 蒼術(shù)提取物抗腹瀉藥效學(xué)研究

2.5.1 藥液制備

（1）大黃藥液的制備：采用常規(guī)煎煮法，取100 g生大黃切碎，加入5倍量水煮沸30 min后濾過，藥渣再加3倍量水煮沸20 min，合并2次濾液并濃縮至50 mL，即得200%大黃水煎液。

（2）蒼術(shù)的醇提物溶液制備：取“2.4.4”項(xiàng)下米泔水制北蒼術(shù)（飲片中蒼術(shù)素為0.422%）和生蒼術(shù)（飲片中蒼術(shù)素為0.500%）各75.6 g，粉碎過三號篩，分別用10倍量體積80%乙醇浸泡12 h后超聲提取，共提取3次，每次2 h，濾過，分別合并濾液，經(jīng)40 ℃減壓濃縮至100 mL，利用“2.2”項(xiàng)下蒼術(shù)素測定方法，經(jīng)3次重復(fù)驗(yàn)證測得米泔水制北蒼術(shù)醇提物中蒼術(shù)素為0.367%，RSD為1.37%；生蒼術(shù)醇提物中蒼術(shù)素為0.402%，RSD為0.44%。取米泔水制北蒼術(shù)醇提物和生蒼術(shù)醇提物，按人鼠劑量換算公式濃縮得到高、低劑量（756、189 mg/mL，按生藥量計(jì)[20]）組。

（3）陽性對照藥液的制備：取適量鹽酸小檗堿片，研磨后加水制成質(zhì)量濃度為9.45 mg/mL的混懸液后，得到陽性對照組藥液。

2.5.2 動(dòng)物分組、造模和給藥 將42只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成7組，每組6只，分別為對照組，模型組，陽性對照組（鹽酸小檗堿），生蒼術(shù)高、低劑量組[20-22]，米泔水制北蒼術(shù)高、低劑量組。除對照組，其余各組均需造模，按20 mL/kg ig給予200%大黃水煎液，早晚各1次，共造模10 d。造模結(jié)束后，各組分別ig給予對應(yīng)藥液（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)期間對照組ig給予等量生理鹽水。

2.5.3 大鼠一般行為狀態(tài) 試驗(yàn)期間，對照組大鼠活動(dòng)正常，背毛光澤，反應(yīng)靈敏，糞便正常。除對照組外，隨造模時(shí)間延長，造模組大鼠逐漸出現(xiàn)精神抑郁、瞇眼倦怠、食欲不振、大便疏松、色臟無光澤、怕寒喜歡聚堆、肛門黏液帶糞、部分大鼠肛門脫垂，說明脾虛泄瀉模型建立成功。

由表10可知，隨飼養(yǎng)天數(shù)增加對照組的大鼠體質(zhì)量增長速度緩慢；造模期間，與對照組相比，其余各組大鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)極顯著性下降趨勢（＜0.01）；給藥治療7 d后，與模型組相比，生蒼術(shù)、米泔水制北蒼術(shù)醇提物高劑量組大鼠的活動(dòng)及背毛情況均恢復(fù)正常，大鼠體質(zhì)量顯著上升（＜0.05、0.01），且與陽性對照組差異不顯著；米泔水制北蒼術(shù)醇提物低劑量組體質(zhì)量雖有好轉(zhuǎn)，但與模型組差異不顯著，精力、食欲及毛發(fā)光澤仍欠佳。綜上可知，末次給藥后，米泔水制北蒼術(shù)和生蒼術(shù)醇提物高劑量對上述癥狀均有顯著改善（＜0.05、0.01）。

表10 脾虛泄瀉模型大鼠體質(zhì)量變化量(, n = 6)

Table 10 Summary of body weight changes degree in rats with diarrhea due to spleen deficiency (, n = 6)

組別劑量/(mg?mL?1)體質(zhì)量變化量/g 造模第1天造模第7天造模第10天給藥第7天 對照?042.22±12.2261.40±15.2423.48±5.46 模型?0?39.78±5.25##?59.05±6.17##56.07±9.25## 陽性對照9.450?39.27±5.94**?56.44±10.28**78.48±1.44** 米泔水制北蒼術(shù)1890?38.09±6.91**?57.82±8.15**59.95±6.94b 7560?39.56±2.27**?57.91±2.47**66.50±6.80**a 生蒼術(shù)1890?40.32±13.78**?58.38±9.85**57.86±4.69b 7560?40.30±4.34**?58.40±5.00**63.40±1.60*a

與對照組比較：##＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01；同列不同小寫字母表示不同組別相同劑量間差異顯著（＜0.05）；下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group; different lowercase letters in the same column indicated that there was significant difference between different doses (< 0.05); same as below tables

2.5.4 糞便含水率 于造模第0、7、10天和給藥第7天收集大鼠新鮮糞便，105 ℃干燥5 h，測定糞便含水率。由表11可知，與對照組相比，第7～10天各造模組糞便含水率均極顯著升高（＜0.01），糞便稀溏不成形，說明造模成功。給藥治療7 d后，與模型組相比，各組糞便含水率顯著降低（＜0.05、0.01），米泔水制北蒼術(shù)醇提物高劑量組糞便含水率極顯著降低，且與陽性對照組差異不顯著。由此說明，米泔水制北蒼術(shù)和生蒼術(shù)醇提物均能顯著改善大鼠腹瀉狀況，降低糞便含水率，但米泔水制北蒼術(shù)醇提物高劑量組止瀉效果更顯著。

表11 脾虛泄瀉模型大鼠糞便含水率匯總表(, n = 6)

Table 11 Summary of fecal water content of rats with spleen deficiency diarrhea model (, n = 6)

組別劑量/(mg?mL?1)含水率/% 造模第1天造模第7天造模第10天給藥第7天 對照?63.20±0.0463.32±0.8763.42±0.3163.39±0.14 模型?62.51±1.2977.27±0.10##86.14±0.95##78.74±0.26## 陽性對照9.4563.51±1.5277.20±0.0785.40±0.4465.42±3.00** 米泔水制北蒼術(shù)18962.08±0.9377.10±0.0685.92±1.8976.14±0.31*c 75663.60±1.0177.12±0.1186.05±1.4469.95±0.52**a 生蒼術(shù)18963.54±1.0677.10±0.0585.96±1.6377.80±0.69*c 75662.63±1.8077.30±0.0385.85±1.3071.59±1.05*b

2.5.5 血清DAO、SIgA含量 各組大鼠于末次給藥前12 h禁食不禁水，用20%烏拉坦（0.008 mL/g）麻醉，腹主動(dòng)脈取血后脫頸處死，4 ℃下3000 r/min離心20 min，分離血清，按照酶聯(lián)免疫吸附法說明書對血清中各指標(biāo)含量進(jìn)行測定。由表12結(jié)果可知，與對照組相比，模型組及各給藥組大鼠血清DAO含量均極顯著上升（＜0.01），SIgA含量極顯著降低（＜0.01）趨勢；與模型組相比，米泔水制北蒼術(shù)醇提物高、低劑量組和生蒼術(shù)高劑量組DAO含量均極顯著降低（＜0.01），米泔水制北蒼術(shù)醇提物高、低劑量組和生蒼術(shù)高劑量組SIgA含量均顯著升高（＜0.01）。

以上結(jié)果說明，米泔水制北蒼術(shù)醇提物高、低劑量和生蒼術(shù)高劑量組均有利于改善脾虛泄瀉癥大鼠胃腸道生理功能，但米泔水制北蒼術(shù)醇提物治療效果顯著優(yōu)于生蒼術(shù)醇提物組。

3 討論

蒼術(shù)“米泔水制”在古方中應(yīng)用廣泛，且以治療泄瀉為最佳，如《太平惠民和劑局方》《世醫(yī)得效方》及《仁術(shù)便覽》在治療腹痛泄瀉時(shí)所用的蒼術(shù)均為“米泔浸”品?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒼術(shù)醇提物抗腹瀉效果優(yōu)于其水提物[23-24]。因此，本研究在優(yōu)化米泔水制北蒼術(shù)炮制工藝的基礎(chǔ)上，初步探討了米泔水制北蒼術(shù)醇提物對脾虛泄瀉模型大鼠體質(zhì)量、糞便含水率及腹瀉相關(guān)指標(biāo)等的影響。

表12 蒼術(shù)對脾虛泄瀉模型大鼠血清DAO、SIgA含量的影響(, n = 6)

Table 12 Effects of AC on DAO and SIgA contents in serum of spleen deficiency catharsis rats(, n = 6)

組別劑量/(mg?mL?1)DAO/(ng?L?1)SIgA/(ng?L?1) 對照 218.17±11.98118.44±3.76 模型 617.38±27.46##56.58±1.68## 陽性對照9.45291.98±9.01**98.02±1.65** 米泔水制189461.03±9.62**b60.69±1.42**c 北蒼術(shù)756324.52±2.38**c85.82±3.43**a 生蒼術(shù)189505.39±8.47*a57.45±0.84d 756456.75±5.56**b68.75±2.38**b

正交試驗(yàn)優(yōu)選中藥飲片炮制工藝，因其結(jié)果無法反映整個(gè)區(qū)域因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，所得結(jié)果精確程度低[25]。故本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用Box-behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，根據(jù)蒼術(shù)素含量、浸出物及外觀性狀在蒼術(shù)飲片質(zhì)量控制中的重要性賦予相應(yīng)權(quán)重[8]，并充分考慮各因素的交互作用[26]，通過模型選出米泔水制北蒼術(shù)最優(yōu)工藝，即將米水比例為1∶60的米泔水25 mL，均勻噴淋在蒼術(shù)飲片上，悶潤2 h，160 ℃炒制30 min后取出，放涼即得。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法也被應(yīng)用于炒赤芍、麩炒蒼術(shù)及酒大黃等炮制工藝優(yōu)化[8,27-29]。

蒼術(shù)“燥性”，常需炮制減燥后入藥[30]，其炮制方法均涉及加熱過程，說明蒼術(shù)中燥性物質(zhì)是揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定性成分。研究表明，蒼術(shù)經(jīng)不同方法炮制后，其揮發(fā)油的含量均呈下降趨勢，并以麩炒和米泔水制品效果為佳，去油效果分別達(dá)39%[31]和47%。對同屬白術(shù)炮制原理研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)中燥性成分（蒼術(shù)酮）經(jīng)炮制后部分可轉(zhuǎn)化為白術(shù)內(nèi)酯I、II、III等內(nèi)酯類成分[32-33]。結(jié)合前期試驗(yàn)，米泔水制北蒼術(shù)揮發(fā)油含量顯著下降，但較大程度保留了北蒼術(shù)浸出物和蒼術(shù)素的含量，既達(dá)到降噪目的，又保證有效成分含量無過度流失，進(jìn)而為保證臨床療效提供保障。

利用苦寒瀉下中藥大黃致大鼠脾虛泄瀉模型是我國經(jīng)典的脾虛模型之一[34-35]。本實(shí)驗(yàn)以脾虛泄瀉大鼠為模型，探索米泔水制北蒼術(shù)醇提物的抗腹瀉藥效作用。研究表明，與模型組相比，高劑量米泔水制北蒼術(shù)和生蒼術(shù)醇提物均能顯著改善大便溏稀、食少、體質(zhì)量減輕等癥狀，大鼠體質(zhì)量顯著上升（＜0.05、0.01）；但米泔水制品醇提物高劑量組的大鼠糞便含水率顯著降低，血清DAO含量極顯著下降，SIgA表達(dá)極顯著增加（＜0.01），且接近陽性藥水平（＞0.05），原因可能是生蒼術(shù)中也含有抗腹瀉活性成分，但含量較少；結(jié)合蒼術(shù)藥性[30]可知，米泔水制北蒼術(shù)醇提物止瀉作用優(yōu)于生蒼術(shù)，且副作用小，高劑量米泔水制品醇提物不僅有效緩解脾虛泄瀉模型大鼠便溏等癥狀，增加大鼠體質(zhì)量，還在一定程度上改善腸黏膜通透性和免疫功能，修復(fù)腸黏膜損傷。有證據(jù)顯示，蒼術(shù)醇提物可從不同方面改善脾虛大鼠的胃腸功能障礙，對脾虛引起的胃腸功能障礙有良好的調(diào)節(jié)和治療作用[36-37]。

綜上，本研究確定了米泔水制北蒼術(shù)的最佳炮制工藝，并論證了米泔水制北蒼術(shù)醇提取物可改善脾虛泄瀉模型大鼠的腸道功能，這種作用可能與其調(diào)節(jié)腸道DAO和SIgA等因子分泌有關(guān)，為深入研究米泔水制北蒼術(shù)抗腹瀉作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究將進(jìn)一步探索蒼術(shù)米泔水制前后的藥效物質(zhì)變化及對腸道菌群多樣性的影響，深入挖掘其量效關(guān)系和作用機(jī)制，為拓寬米泔水制北蒼術(shù)的合理應(yīng)用提供重要依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on processing technology ofwith rice water and its pharmacodynamics of anti-diarrhea

YANG Xue-qing, XU Wei, XIAO Chun-ping, SUN Jin, FENG Yu-zhuang

School of Pharmaceutical Science, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130017, China

To optimize the processing technology of(AC) with rice water, and to study its anti-diarrhea efficacy.Based on single factor test, the Box-Behnken response surface methodology was also used to determine the optimal processing technology of AC preparation with rice water investigated four factors, including the amount of rice water, moistening time, processing temperature and processing time, of which atractydin, extract and appearance traits were used as comprehensive evaluation indexes. Furthermore, with the establishment of spleen deficiency diarrhea model in rats, the changes of body weight and fecal moisture content before and after administration were compared, and the contents of diamine oxidase (DAO) and secreted immunoglobulin (SIgA) in serum were determined by enzyme-linked immunosorbent assay.Response surface methodology showed that the best processing technology of AC with rice water was as follows: The ratio of rice to water in rice water was 1:60, the amount of rice water was 25 mL, the processing temperature was 160 ℃, and the processing time was 30 min. Compared with model group, the content of fecal moisture content and DAO were significantly decreased (< 0.01), meanwhile the body weight and SIgA content were significantly increased (< 0.01) in high dose ethanol extract group of AC with rice water, which were close to the positive drug level to rats with spleen deficiency diarrhea. The effect of ethanol extract in raw products of AC on improving fecal moisture content, body weight, SIgA and DAO content in rats with spleen deficiency was lower than that of rice water treatment (< 0.05, 0.01).Response surface method is simple, stable, accurate and reliable, which can be used to optimize the processing technology of AC prepared with rice water, and the anti-diarrhea effect of ethanol extract from AC with rice water is significant.

(DC.); rice water; processing technology; Box-Behnken response surface methodology; anti-diarrhea; atractylodin; diarrhera duo to spleen deficiency; enzyme linked immunosorbent assay; diamine oxidase; secretory immunoglobulin

R283.1

A

0253 - 2670(2022)01 - 0078 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.011

2021-08-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803649）；吉林省科技廳科技項(xiàng)目（20191102035YY）；吉林省中醫(yī)藥管理局科技項(xiàng)目（2020047）

楊雪晴（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。Tel: (0431)81672193 E-mail: 1900056792@qq.com

肖春萍，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與栽培理論和技術(shù)。Tel: (0431)81672193 E-mail: btxnw@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]