范琦琦，李芝奇，陳美琳，趙崇軍，林瑞超

基于斑馬魚模型的中藥安全性評價研究進(jìn)展

范琦琦，李芝奇，陳美琳，趙崇軍*，林瑞超*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室，北京 102488

毒性中藥的臨床使用是中醫(yī)藥的特色，在慢性疾病和重大疾病的救治過程中應(yīng)用廣泛。但是毒性中藥的毒性研究數(shù)據(jù)相對較少，在一定程度上不能為系統(tǒng)闡述毒性中藥的理論和臨床安全使用提供充分的參考依據(jù)。中藥配伍、炮制是中醫(yī)藥臨床減毒增效的有效手段，準(zhǔn)確而系統(tǒng)闡釋配伍、炮制原理對中醫(yī)藥安全有效性至關(guān)重要。近年來，由于特定的生理學(xué)優(yōu)勢，斑馬魚已經(jīng)逐步成為藥物（中藥）毒性研究的模型生物，逐步被用于各種有毒物質(zhì)的篩選和評價。對近年來利用斑馬魚進(jìn)行中藥毒性評價、炮制減毒、配伍減毒及毒性機(jī)制研究等進(jìn)行總結(jié)，以期為斑馬魚在中藥毒性評價中的廣泛應(yīng)用和相關(guān)毒性標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

中藥；斑馬魚模型；毒性；安全性評價；炮制；配伍；減毒

長期以來，中藥一直被認(rèn)為具有有效、安全、無不良反應(yīng)的特點。然而，隨著中藥的推廣與應(yīng)用，其不良反應(yīng)的報道逐漸增加，從而引起了人們對臨床用藥的關(guān)注。毒性中藥是中醫(yī)藥臨床使用的一大特色，通常廣泛應(yīng)用于重大疾病的治療。但是，毒性中藥缺乏中藥安全性評價數(shù)據(jù)，尤其是其毒性作用的靶器官和機(jī)制不明確，在一定程度上阻礙了中藥新藥、中藥現(xiàn)代化和國際化的發(fā)展。因此，如何客觀、正確、系統(tǒng)地評價中藥安全性，降低和避免中成藥的不良反應(yīng)成為了研究熱點。

生物評價是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與臨床功效和安全性評價的重要手段和途徑，已成為現(xiàn)代中藥研究發(fā)展的重要方向之一。選擇合理的動物模型、建立和完善相應(yīng)的評價方法和指標(biāo)對于系統(tǒng)評價中藥安全性至關(guān)重要。近年來，斑馬魚模型由于特殊的生理優(yōu)勢被逐漸應(yīng)用于中藥安全性評價[1]，與哺乳動物相比，實驗成本相對較低，胚胎透明，體外發(fā)育，繁殖力強(qiáng)，適合于大規(guī)模的遺傳篩選；藥物暴露（異種生物、激素、藥物以及環(huán)境污染物）能夠引起斑馬魚出現(xiàn)與哺乳動物類似的生理反應(yīng)和病理響應(yīng)。斑馬魚模型在中藥安全性評價中的應(yīng)用和意義見圖1。因此，本文整理了斑馬魚在中藥安全性評價方面的研究進(jìn)展，以期完善基于斑馬魚模型的中藥安全性評價技術(shù)與方法，為進(jìn)一步促進(jìn)和開發(fā)斑馬魚模型在中藥安全性評價中廣泛應(yīng)用提供參考。

1 斑馬魚模型在中藥毒性研究中的適用性

斑馬魚作為一種新型的動物模型，早期主要是用于基礎(chǔ)研究和環(huán)境評價，近10年才被廣泛用于藥物研究，包括中藥的安全性評價。而作為一種新的模式生物，在被研究者和制藥行業(yè)廣泛接受和應(yīng)用之前，必須要對該模型的一些基本性質(zhì)進(jìn)行考察和評價，如可靠性、相似性等。因此，針對斑馬魚模型的適用性進(jìn)行討論。

1.1 斑馬魚模型評價中藥毒性具有可靠性

前期本課題組利用斑馬魚模型，采用客觀的可量化的指標(biāo)體系對《中國藥典》中明確記載有毒性的19種中藥進(jìn)行毒性評價，實驗結(jié)果具有明顯的可重復(fù)性，表明斑馬魚模型對于篩選毒性中藥具有一定的可靠性[2]。發(fā)現(xiàn)暴露于肝毒性中藥與非肝毒性中藥中的斑馬魚在肝臟表型、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著性差異，斑馬魚模型能夠準(zhǔn)確地將肝毒性中藥與非肝毒性中藥進(jìn)行區(qū)分。對于中成藥來說，郭勝亞等[3]選擇已上市且報道有肝毒性的5種中成藥（壯骨關(guān)節(jié)丸、益腎烏發(fā)口服液、牛黃解毒片和雷公藤多苷等）為評價樣本，以斑馬魚肝臟形態(tài)學(xué)變化、肝變性程度和卵黃囊吸收情況為指標(biāo)，快速評價中成藥的肝毒性。結(jié)果表明5種藥物均能夠引起斑馬魚肝臟組織表型發(fā)生顯著變化，影響卵黃囊吸收，對斑馬魚幼魚具有不同程度的肝臟毒性。也進(jìn)一步表明斑馬魚模型評價中藥肝臟毒性具有較好的可靠性。

1.2 斑馬魚臟器毒性響應(yīng)機(jī)制具有相似性

陳影等[4]基于斑馬魚急性毒性實驗和體外細(xì)胞實驗評價山豆根生物堿部位和非生物堿部位的毒性大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)非生物堿部位對斑馬魚模型致死性最強(qiáng)，抑制肝癌HepG2細(xì)胞活力的作用也是最強(qiáng)的，表明斑馬魚模型與體外細(xì)胞模型在藥物肝毒性評價中具有一致性。韓沁等[5]同時以斑馬魚及SD大鼠為模型評價芫花的肝臟毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定條件下，斑馬魚和SD大鼠肝臟組織均出現(xiàn)顯著的結(jié)構(gòu)改變，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散、紊亂和細(xì)胞空泡化等，表明斑馬魚與SD大鼠在芫花肝毒性反應(yīng)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性。

為了從轉(zhuǎn)錄水平驗證斑馬魚模型與傳統(tǒng)評價模型在肝毒性藥物評價中的相似性，Zhao等[6]選取重樓提取物為樣本，同時對體外正常肝L02細(xì)胞、體內(nèi)斑馬魚和SD大鼠模型進(jìn)行暴露處理，以肝細(xì)胞表型、斑馬魚和SD大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)、生化指標(biāo)為評價指標(biāo)進(jìn)行相似性評價，發(fā)現(xiàn)重樓提取物能夠抑制L02細(xì)胞的細(xì)胞活性，引起細(xì)胞表型變化、斑馬魚和SD大鼠模型的肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、三者肝功酶發(fā)生顯著變化，意味著重樓提取物對3種評價模型均有顯著的肝毒性。同時，現(xiàn)代分子生物技術(shù)（如系統(tǒng)組學(xué)技術(shù)、Western blotting和實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）實驗結(jié)果表明，經(jīng)重樓給藥處理后，3種模型在脂質(zhì)代謝、能量代謝等相關(guān)基因的表達(dá)水平方面呈現(xiàn)高度一致性，進(jìn)一步從分子水平證實了斑馬魚模型與傳統(tǒng)評價模型在中藥肝毒性評價中具有極強(qiáng)的相似性[7-8]，為斑馬魚在中藥肝毒性篩選和評價中的應(yīng)用提供了有力支撐。

2 斑馬魚模型在中藥毒性研究中的應(yīng)用

2.1 篩選和確認(rèn)毒性部位及成分（群）

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)有安全性評價研究主要優(yōu)先靶向選擇毒性中藥中的主要毒性成分進(jìn)行篩選和評價，其余大多數(shù)成分的安全性尚不明確。因此，如何從復(fù)雜體系中快速辨識毒性部位以及相關(guān)成分是重點和難點問題。傳統(tǒng)方法常用化學(xué)分離結(jié)合毒性評價追蹤毒性成分，但是化學(xué)分離純化獲得的化合物量少，尤其是許多微量成分，常不能滿足安全性評價所需樣本量?，F(xiàn)有的毒性評價模型如哺乳動物模型具有耗時長、工作強(qiáng)度大、樣品用量大等缺點，不適合進(jìn)行規(guī)?；Y選；體外細(xì)胞模型作用環(huán)節(jié)相對單一，不能體現(xiàn)在體實驗的綜合效果。近年來，斑馬魚模型以其快速篩選的優(yōu)勢主要被應(yīng)用于中藥毒性部位的確認(rèn)以及主要毒性成分的篩選。

羅雋等[9]和梅雪等[10]利用斑馬魚模型探討了非致死劑量下甘遂及其醋制品不同溶劑提取物對斑馬魚幼魚的毒性及毒性可逆性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘遂不同溶劑提取物對斑馬魚的毒性大小與醋甘遂相同，依次為石油醚提取物＞二氯甲烷提取物＞醋酸乙酯提取物＞乙醇提取物。石油醚提取物對斑馬魚的主要靶器官為肝臟和胃腸道。此外，張橋[11]將萃取、減壓硅膠柱色譜法、制備液相等現(xiàn)代分離技術(shù)與斑馬魚高通量篩選技術(shù)相結(jié)合，對甘遂中的不同提取部位及單體成分進(jìn)行篩選和評價，發(fā)現(xiàn)醋甘遂各成分群的半數(shù)致死量明顯大于生品，主要毒性成分為萜類化合物，而醋炙后能夠降低萜類成分的含量進(jìn)而降低甘遂的毒性作用。

何首烏所含化學(xué)成分主要有蒽醌類、芪類、鞣質(zhì)類、黃酮類、磷脂類等，然而何首烏致肝臟毒性作用部位及其物質(zhì)基礎(chǔ)尚無定論。逐漸有研究者利用斑馬魚模型對何首烏肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行篩選和評價。鄭海洋等[12]制備何首烏氯仿部位、醋酸乙酯部位及剩余水相部位固體提取物進(jìn)行何首烏毒性部位的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯仿和醋酸乙酯提取部位能夠引起斑馬魚幼魚肝臟顏色變?yōu)榘祷疑?，透明度降低，面積變大；肝細(xì)胞數(shù)量降低，空泡變性且排列不規(guī)則；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartic transaminase，AST）活性顯著上升，出現(xiàn)明顯肝損傷。提示何首烏氯仿部位和醋酸乙酯部位可能是何首烏中誘導(dǎo)肝毒性的主要毒性部位。全云云等[13-14]利用肝臟熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚，對何首烏18種成分進(jìn)行肝毒性初步篩選，發(fā)現(xiàn)何首烏中蘆薈大黃素能降低斑馬魚的肝臟面積和肝臟熒光強(qiáng)度，降低斑馬魚體內(nèi)ALT、AST和谷胱甘肽的活力以及升高總膽紅素的含量，引起斑馬魚肝組織出現(xiàn)大片片狀壞死，肝組織細(xì)胞發(fā)生明顯形態(tài)改變，肝細(xì)胞排列不規(guī)則等。Li等[15]利用斑馬魚模型對何首烏70%乙醇部位以及19個化合物進(jìn)行肝毒性篩選和評價，發(fā)現(xiàn)大黃素、大黃酚、大黃素-8--β--吡喃葡萄糖、-emodin-emodin dianthrones和-emodin-emodin dianthrones的肝毒性較強(qiáng)，而多酚類化合物的毒性較弱，這也是首次報道dianthrones有明顯的肝毒性。目前對何首烏肝臟毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)依舊無明確定論，仍需要找到合適的評價指標(biāo)對何首烏中的主要物質(zhì)如蒽醌類、芪類及鞣質(zhì)類進(jìn)行系統(tǒng)比較。

為了克服傳統(tǒng)分離方法耗時、費(fèi)力的缺點，研究者嘗試通過斑馬魚高效評價毒性與分析技術(shù)相結(jié)合，建立一種高效辨識毒性成分群的技術(shù)與方法，以期克服傳統(tǒng)評價方法導(dǎo)致的毒性追蹤低效、高成本的缺陷。林青華等[16]采用溶劑萃取法和明膠沉淀法分別制備生檳榔的總生物堿、總鞣質(zhì)部位并對其進(jìn)行含量測定及斑馬魚急性毒性評價。結(jié)果表明溶劑萃取法和明膠沉淀法制得總生物堿、總鞣質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為6.67 mg/mL、53.74%；二者對斑馬魚幼魚的半數(shù)致死濃度（median lethal concentration，LC50）值分別為136.14、21.52 μg/mL，進(jìn)而確定生檳榔中鞣質(zhì)類成分是生檳榔的主要毒性成分。李佳妍等[17]以不同批次補(bǔ)骨脂為評價樣本，將現(xiàn)代分析方法與毒性評價相結(jié)合，同時測定18批補(bǔ)骨脂中香豆素、黃酮和補(bǔ)骨脂酚的含量以及對斑馬魚急性毒性和臟器損傷，并通過建立各類成分含量與斑馬魚LC50值之間的相關(guān)分析進(jìn)而來辨識補(bǔ)骨脂的毒性成分群。結(jié)果表明不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液對斑馬魚的毒性差異較大，但斑馬魚毒性與不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂中所含黃酮類成分、補(bǔ)骨脂酚具有一定的相關(guān)性，同時研究結(jié)果提示補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂乙素可能是補(bǔ)骨脂的主要毒性成分。

2.2 確定中藥的毒性靶器官及其毒性機(jī)制

斑馬魚主要臟器（肝臟、心臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)）的結(jié)構(gòu)和功能與傳統(tǒng)哺乳動物具有高度保守性[18]，斑馬魚臟器發(fā)育較快且具有顯著的光學(xué)透明性，因此被廣泛用于中藥潛在臟器損傷評價和機(jī)制探討。

Quan等[19]發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠降低斑馬魚肝臟的熒光面積和強(qiáng)度，蘇丹黑B處理能夠使斑馬魚肝臟和卵黃囊變黑，其肝毒性機(jī)制與核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥通路和p53凋亡通路的激活有關(guān)，增加p65的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤壞死因子-α釋放，上調(diào)氨基末端激酶表達(dá)，抑制抗凋亡基因B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，）表達(dá)，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，）、凋亡相關(guān)因子Bcl-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2/ Bcl-2 associated X protein，）等促凋亡基因表達(dá)水平，表明蘆薈大黃素對斑馬魚具有一定的肝毒性。付曉春等[20]發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷亞致死濃度給藥48 h后能誘導(dǎo)斑馬魚肝細(xì)胞凋亡，上調(diào)凋亡蛋白Caspase-3和促凋亡分子Bax的表達(dá)水平。Zhao等[21]發(fā)現(xiàn)甘遂提取物能夠引起斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，提高斑馬魚凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及其基因的轉(zhuǎn)錄水平，斑馬魚整體代謝組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘遂的肝毒性與機(jī)體的氨基酸代謝和能量代謝紊亂相關(guān)。

在神經(jīng)毒性評價方面，李夢婷等[22]利用斑馬魚模型，以附子脂溶性總生物堿為評價樣本，通過斑馬魚幼魚Noldus行為學(xué)系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡檢測和乙酰膽堿酯酶活力測定來分析不同給藥時間樣本對斑馬魚的神經(jīng)毒性。發(fā)現(xiàn)附子脂溶性總生物堿會先促進(jìn)，然后抑制斑馬魚幼魚的行為活動，且其神經(jīng)毒性可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡和影響乙酰膽堿酯酶活力有關(guān)。在心臟毒性方面，Liu等[23]利用斑馬魚模型探究烏頭堿和新烏頭堿誘導(dǎo)的心臟毒性及其機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏頭堿和新烏頭堿均能引起斑馬魚早期心臟功能障礙，并能夠通過影響T-box轉(zhuǎn)錄因子-5、GATA結(jié)合蛋白4和其中NK2同源異型框5的表達(dá)誘導(dǎo)斑馬魚胚胎心臟毒性。

此外，斑馬魚主要臟器的形成時間不同，研究者可以利用不同魚齡的斑馬魚考察藥物作用的主要敏感靶器官。如馮婭茹等[24]選定不同發(fā)育階段［受精后48、72、96 h（hours post fertilization，hpf）］的斑馬魚于香加皮水提物中急性暴露24 h，發(fā)現(xiàn)香加皮對48、96 hpf斑馬魚的毒性大小相似，說明48 hpf斑馬魚已經(jīng)適合作為心臟毒性研究，但是72 hpf斑馬魚對香加皮較為敏感，這可能是由于香加皮影響了斑馬魚的某一臟器的發(fā)育或其功能，如肝臟。代一航等[25]發(fā)現(xiàn)在亞致死濃度條件下，香加皮水提取物能夠引起幼魚肝臟形態(tài)異常、肝臟面積呈劑量相關(guān)性增加和肝細(xì)胞凋亡；能夠降低斑馬魚超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，升高ALT、AST活力，進(jìn)一步表明香加皮水提取物能夠同時引起斑馬魚心臟和肝臟損傷，而且可能是通過破壞其體內(nèi)氧化應(yīng)激平衡，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的。

2.3 闡明不同產(chǎn)地對中藥毒性的影響

“土地之所宜者，則藥力具”。眾所周知，中藥材的品質(zhì)（質(zhì)量、藥效和毒性）與生長環(huán)境因素密切相關(guān)[26]。傳統(tǒng)研究往往是通過化學(xué)成分種類與含量的角度來評價不同產(chǎn)地之間中藥的質(zhì)量，忽略了生物活性評價與藥材產(chǎn)地之間關(guān)系。因此，加強(qiáng)活性評價、成分分析和區(qū)域性之間的關(guān)系對于闡釋、補(bǔ)充和完善藥材道地性內(nèi)涵是至關(guān)重要的。附子的毒性成分為雙酯型生物堿，有效成分為單酯型生物堿[27-28]，劉雨詩等[29]經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)單酯型生物堿的含量以江油產(chǎn)者較高，云南產(chǎn)者較低；雙酯型生物堿含量以云南產(chǎn)者較高，江油產(chǎn)者較低。王曉雅等[30]以斑馬魚心率變化、畸形率和致死濃度為評價指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)江油產(chǎn)黑順片醇提物畸形率最小，存活率最高；云南組樣本對斑馬魚的毒性最大；布拖組各項指標(biāo)位于兩產(chǎn)地之間。因此，通過斑馬魚整體動物模型和化學(xué)成分分析相互結(jié)合，確認(rèn)江油產(chǎn)黑順片具有低毒的特點，這對臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。

另外，張勇等[31]以斑馬魚肝臟組織病理學(xué)變化為評價指標(biāo)，比較不同產(chǎn)地山豆根的肝毒性，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地和批次的山豆根及其水煎液不同有效部位的肝臟毒性大小存在差異[32]。廣西產(chǎn)山豆根浸膏粉能引起斑馬魚肝臟組織壞死，其肝臟呈網(wǎng)狀、蜂窩狀，細(xì)胞核松散、腫大；而四川產(chǎn)山豆根肝毒性較輕，僅能引起肝臟細(xì)胞核松散、腫大。這些研究結(jié)果能夠為山豆根在臨床應(yīng)用上的安全性、有效性等綜合評價以及其道地產(chǎn)區(qū)的辨別提供參考。

2.4 闡釋中藥炮制減毒內(nèi)涵

中藥炮制是數(shù)千年臨床實踐中形成的以中醫(yī)理論為理論基礎(chǔ)、以臨床辨證論治為要求、以研發(fā)過程中藥物質(zhì)量穩(wěn)定可控為約束而發(fā)展的實踐和技術(shù)，其核心為改善中藥性味，增強(qiáng)中藥功效，降低不良反應(yīng)[33]，但中藥炮制的科學(xué)內(nèi)涵并不清晰和完善。伴隨著各種分析儀器和方法的研發(fā)，從化學(xué)成分變化的角度出發(fā)，中藥炮制復(fù)雜系統(tǒng)分析有了更強(qiáng)大、更精確的技術(shù)支撐手段[34]。然而，由于中藥成分的復(fù)雜性，從藥理作用變化的角度來闡述中藥炮制的機(jī)制研究報道較少[35]，本文通過總結(jié)近年來斑馬魚在中藥炮制方法和機(jī)制研究中的進(jìn)展，為闡明中藥炮制方法的機(jī)制提供理論支持和科學(xué)依據(jù)。

研究表明，檳榔中生物堿含量在炮制前后會發(fā)生顯著變化[36]。炮制過程中，檳榔生物堿的總量隨著炒制溫度的升高而降低。將檳榔及其炮制品應(yīng)用于斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)，生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物的LC50值依次增加，且在LC50條件下，生檳榔、炒檳榔、焦檳榔中總生物堿的質(zhì)量濃度分別為0.964、0.831、0.829 μg/mL，提示檳榔毒性與生物堿含量呈正相關(guān)[37]。

為探究醋制甘遂減毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，Zhang等[38]建立了一種超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法法同時測定醋炙前后甘遂醋酸乙酯提取物中12種化合物的種類與含量，并研究它們對于斑馬魚的毒性作用，研究通過比較甘遂醋酸乙酯提取物（KS-1）和醋炙甘遂醋酸乙酯提取物（KS-2）中萜類化合物的含量，揭示醋炙甘遂減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果表明，醋炙甘遂毒性降低可能是由于KS-2中5--苯甲?；?20-脫氧辛醇含量增加，剩余萜類化合物含量降低所致。

張楷承等[39]采用模式生物斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)京大戟醋制后各提取物對斑馬魚胚胎的急性毒性顯著降低，Qin等[40]探討了京大戟中4種化合物對斑馬魚胚胎的毒性機(jī)制以及醋炙后的減毒機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，醋炙京大戟中4種化合物含量明顯下降，斑馬魚暴露于化合物后心率、肝臟面積和胃腸蠕動減少，并觀察到心包水腫、卵黃囊水腫等明顯的病理信號。此外，這些化合物還能通過抑制SOD的活性來增加丙二醛和GSH-Px的含量，通過上調(diào)p53、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平和激活Caspase-3、Caspase-9的活性來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時，曹雨誕等[41]發(fā)現(xiàn)京大戟醋炙前后不同極性部位對斑馬魚胚胎均具有心臟、肝臟和腸道毒性，其中石油醚和二氯甲烷提取部位毒性最強(qiáng)，主要的毒性表現(xiàn)為心包水腫、心率降低、心臟細(xì)胞凋亡、肝面積變小、肝臟變性發(fā)黑、卵黃囊吸收延遲、出血、胃腸道蠕動減緩、胃腸道杯狀細(xì)胞分泌功能異常等[42]。但是，與生品相比，相近劑量的京大戟醋炙品同一極性部位的心臟、肝臟和腸道毒性都有所下降。

方成鑫[43]采用心臟標(biāo)記熒光斑馬魚對附子不同炮制品的心臟毒性進(jìn)行研究，以心率變化、心包出血、靜脈竇-動脈球間距為評價指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)附子不同炮制品水煎液的心臟毒性大小依次為：白附片＞熟附片＞生附片＞生附片（去皮）＞蒸附片＞黑順片＞炒附片，且附子不同炮制品水煎液中總生物堿毒性與含量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。綜上，斑馬魚模型的研究結(jié)果與中藥炮制減毒的基本理論一致，斑馬魚模型的應(yīng)用有利于從藥理角度闡釋中藥炮制減毒機(jī)制與內(nèi)涵。

2.5 闡釋配伍減毒內(nèi)涵

中藥臨床使用的另一個特色優(yōu)勢在于中藥配伍，它是保證中藥，尤其是毒性中藥安全有效的重要方式之一，是中醫(yī)基礎(chǔ)理論、國家中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展戰(zhàn)略的重要研究內(nèi)容[44]。中藥尤其是中藥復(fù)方中存在的復(fù)雜成分以其成分含量差異變化在一定程度上與中藥不良反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，因此，如何建立合理的評價體系科學(xué)闡釋配伍減毒原理進(jìn)而指導(dǎo)臨床使用是目前關(guān)注的問題。

四逆湯是由附子、干姜和甘草組成的回陽救逆的經(jīng)典方劑，方中包含的附子-干姜、附子-甘草均是配伍的典范。附子中所含的主要活性成分烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿均為附子毒性成分[45]。研究表明烏頭堿能夠引起斑馬魚心臟中氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而引起斑馬魚出現(xiàn)明顯心臟毒性。而干姜中的6-姜酚、甘草中的甘草酸對烏頭堿誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有明顯的抑制作用，進(jìn)而減弱烏頭堿導(dǎo)致的斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡[46]。此外，補(bǔ)骨脂及其中藥制劑在臨床上能夠誘發(fā)明顯的肝毒性損傷。吳茱萸與毒性較小的杜仲、桑寄生、女貞子提取液配伍后可緩解吳茱萸的肝毒性，降低吳茱萸誘導(dǎo)的斑馬魚死亡率，改善吳茱萸對斑馬魚臟器的影響，其中以杜仲-吳茱萸配伍的結(jié)果最優(yōu)[47]。綜上，斑馬魚模型可應(yīng)用于方劑配伍規(guī)律研究，篩選方劑活性成分，分析方劑組方配伍特點，探討方劑最佳藥物組成配比等。

2.6 闡釋毒性-代謝關(guān)系

藥物毒性往往與其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)，中藥中所含無毒原型成分經(jīng)過體內(nèi)代謝過程可能會轉(zhuǎn)化成強(qiáng)毒性成分。如前所述，傳統(tǒng)的藥物代謝體內(nèi)實驗設(shè)計需要大量的評價樣本，而天然產(chǎn)物往往難以滿足體內(nèi)動物實驗所需用量，而且無法實現(xiàn)整體動態(tài)觀察；體外細(xì)胞實驗難以完整體現(xiàn)整體動物對藥物的整體代謝情況，無法進(jìn)行微量成分在體評價。而斑馬魚具有與哺乳動物類似的完整器官、系統(tǒng)及代謝酶系，能夠?qū)λ幬镞M(jìn)行完整的代謝反應(yīng)，并且可實現(xiàn)微量成分的在體、高效篩選及代謝研究[48-50]。

劉欣欣等[51]將1 dpf健康斑馬魚胚胎置于不同濃度補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的供試液中，分析各成分的動態(tài)代謝變化以及他們對斑馬魚的毒性效果。結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的原型成分均可誘導(dǎo)3 dpf斑馬魚出現(xiàn)明顯毒性；補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的原型成分對3 dpf斑馬魚主要臟器沒有明顯影響，但經(jīng)4～6 dpf斑馬魚代謝之后動態(tài)轉(zhuǎn)化成補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素后會導(dǎo)致明顯毒性。表明補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素既是藥材中的原型成分，也是在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝成分，是補(bǔ)骨脂致毒的相關(guān)成分。

葛靜等[52]和凌潔等[53]基于斑馬魚代謝-效/毒聯(lián)合評價箭葉淫羊藿不同組分（水煎液和黃酮組分）、主要代表性成分（朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷C與寶藿苷I）代謝變化過程及其相關(guān)毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)箭葉淫羊藿的質(zhì)量濃度和暴露時間與斑馬魚臟器損傷或死亡相關(guān)；而且朝藿定C的主要代謝產(chǎn)物箭藿苷C的動態(tài)增加與淫羊藿水煎液、淫羊藿黃酮組分及朝藿定C的毒性產(chǎn)生密切相關(guān)；而其他化合物及其代謝產(chǎn)物與淫羊藿的毒性作用沒有表現(xiàn)出明顯的直接關(guān)系。巴戟天與淫羊藿配伍能夠減緩朝藿定C代謝速度，進(jìn)而緩解其毒性作用。

以上研究說明基于斑馬魚模型能夠融合傳統(tǒng)體內(nèi)和體外評價模型的優(yōu)勢，突破體內(nèi)、外模型在藥物代謝研究領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸，實現(xiàn)藥物毒性和代謝動態(tài)同步進(jìn)程分析，而且展現(xiàn)出樣品需求量小、高效省時省力、滿足在體化要求等優(yōu)點，為高效辨識中藥毒性物質(zhì)，實現(xiàn)微量成分體內(nèi)動態(tài)轉(zhuǎn)化的毒性評價，甚至能為微量成分在體毒性與代謝評價提供優(yōu)勢平臺。

2.7 潛在中藥的毒性篩選和評價

中藥在重大疾病治療的優(yōu)勢逐漸被世界接受，其臨床使用量顯著增加。因此，在臨床前研究階段對常用中藥及復(fù)方的安全性進(jìn)行篩選和評價，確認(rèn)潛在的毒性作用、毒性藥物以及毒性靶器官，對于保證臨床用藥安全至關(guān)重要。陳穎等[54]用斑馬魚對壯骨關(guān)節(jié)丸及該方中12味藥水煎液及醇提物的安全性進(jìn)行評價，驗證了壯骨關(guān)節(jié)丸及其所含一些已報道毒性成分（如補(bǔ)骨脂、乳香等）的不良反應(yīng)，同時也發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)認(rèn)為相對安全的藥味（如續(xù)斷）也能誘導(dǎo)斑馬魚出現(xiàn)明顯毒性，而續(xù)斷的毒性研究在傳統(tǒng)動物評價模型中尚未見報道。此外，陳穎等[55]利用斑馬魚毒性模型對26種常見傷科中藥材的安全性進(jìn)行快速評價，發(fā)現(xiàn)13種藥味（續(xù)斷、知母、乳香、沒藥、補(bǔ)骨脂、獨(dú)活、牛膝、制何首烏、蛇床子、木香、土鱉蟲、淫羊藿和五加皮）對斑馬魚的急性毒性較大，且水煎液對斑馬幼魚不同臟器表型具有顯著影響。綜上，斑馬魚模型在潛在毒性中藥快速篩選和評價中具有簡單、高效、實時動態(tài)的優(yōu)勢，尤其適用于中藥復(fù)方安全性評價研究中通過拆方來進(jìn)行毒性物質(zhì)篩選和評價。

2.8 其他

中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性以及與不同機(jī)體狀態(tài)之間的相互作用導(dǎo)致難以對中藥是否有毒以及毒性強(qiáng)弱進(jìn)行準(zhǔn)確評價。大多數(shù)情況下，中藥中的活性成分與毒性成分不能區(qū)分，很難有效指導(dǎo)臨床的安全使用，究其原因主要在于中藥毒性物質(zhì)的構(gòu)-量-毒-效關(guān)系不明確，如柴胡及其所含的柴胡皂苷既有保肝作用又有肝毒性。夏青等[56]以柴胡皂苷a為例，從健康生理和病理模型的角度分別考察柴胡皂苷對斑馬魚的毒性差異，實驗結(jié)果表明，柴胡皂苷1.77 μmol/L對病理性酒精性脂肪肝具有保護(hù)作用，且無毒性作用；隨著質(zhì)量濃度的升高，柴胡皂苷對健康狀態(tài)的肝損傷作用開始出現(xiàn)，從柴胡皂苷a“量-毒-效”關(guān)系研究的角度證實了中醫(yī)藥臨床“有故無殞”理論，為柴胡及柴胡皂苷a的臨床用藥安全提供參考。

目前，資源匱乏已經(jīng)成為限制中藥快速發(fā)展的主要障礙，尋找可替代資源已經(jīng)是解決行業(yè)困境的主要措施和手段，但是確保替代資源的安全性是首要問題。段亞輝等[57]采用斑馬魚模型比較款冬葉、花的肝臟、腎臟毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)款冬花及款冬花配伍紫菀在高劑量（1.5 mg/mL）時對肝臟產(chǎn)生一定的毒性，而款冬葉及款冬葉配伍紫菀未表現(xiàn)出明顯的肝腎毒性，表明款冬葉優(yōu)先于款冬花入藥，為款冬葉的資源利用奠定了基礎(chǔ)。利用斑馬魚模型能夠快速篩選安全、有效的可替代中藥資源，有助于實現(xiàn)中藥資源利用最大化。

3 結(jié)語

近年來，中藥在重大疾病防治中展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，在世界范圍內(nèi)逐漸被認(rèn)可和接受。隨著中藥的廣泛使用，中藥不良反應(yīng)事件的報道也引起眾多學(xué)者的關(guān)注。目前現(xiàn)代研究主要關(guān)注于中藥的活性及其作用機(jī)制，而毒性中藥缺乏對機(jī)體不良反應(yīng)的系統(tǒng)研究，在一定程度上已經(jīng)成為限制其臨床廣泛應(yīng)用和藥品研發(fā)的阻礙。因此，深入而系統(tǒng)研究中藥，尤其是毒性中藥不良反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和毒性機(jī)制尤為重要。在此過程中，現(xiàn)代化分析技術(shù)的發(fā)展能夠為中藥毒性物質(zhì)的定性和定量提供有力支持，尋找和建立一種合適的動物模型也必不可少，尤其是確立一種適合于復(fù)雜化學(xué)成分體系安全性評價的動物模型顯得更為重要。

中藥安全性評價常用模型包括體外細(xì)胞和體內(nèi)動物模型，體外細(xì)胞具有高通量優(yōu)勢，能夠?qū)χ兴帍?fù)雜化學(xué)成分體系進(jìn)行快速篩選，但是體外細(xì)胞模型沒有整體動物完整的代謝和調(diào)節(jié)系統(tǒng)，作用環(huán)節(jié)單一，不能完整反映在體實驗的綜合效果以及機(jī)體對藥物的響應(yīng)過程。體內(nèi)動物模型如嚙齒類動物模型是藥物安全評價的黃金標(biāo)準(zhǔn)，其評價結(jié)果也具有較高的靈敏性和準(zhǔn)確性，能夠較真實的反映藥物對機(jī)體的不良反應(yīng)，但該方法具有耗時長、工作強(qiáng)度大、樣品用量大等缺點，難以進(jìn)行規(guī)?；Y選。此外，中藥復(fù)方是中藥臨床使用的常見方式，多種藥味在炮制、配伍等過程中相互影響和變化，造成其所含化學(xué)成分更加復(fù)雜和多變。因此，基于體內(nèi)嚙齒類動物模型進(jìn)行復(fù)方中潛在毒性物質(zhì)的篩選和確認(rèn)更加困難。特別是中藥的一些微量成分根本不能滿足體內(nèi)動物實驗的需要。尋找一種兼具體外細(xì)胞和體內(nèi)動物模型雙重優(yōu)勢的動物模型，能夠在體高效快速鎖定毒性目標(biāo)成分群尤為重要。

斑馬魚作為一種整體動物模型，由于其具有的一些獨(dú)特優(yōu)勢，最早被用于遺傳發(fā)育和環(huán)境毒理學(xué)研究，近年來才被藥學(xué)研究工作者所接受和認(rèn)可[58]，并用于評價中成藥的療效與安全性[59]。首先，斑馬魚的高產(chǎn)卵率能夠為中藥安全性評價和毒性物質(zhì)篩選提供足量的樣本，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)體內(nèi)動物模型個體差異對實驗結(jié)果的影響，同時能夠在同一實驗設(shè)計中對多個影響因素同時進(jìn)行考察和評價；其次，斑馬魚幼魚具有顯著的光學(xué)透明性，通過顯微鏡就可以對不同臟器的形成過程、藥物對多個主要臟器結(jié)構(gòu)和功能的影響實現(xiàn)動態(tài)、實時的觀察，更容易確定中藥毒性實驗暴露終點，獲得多角度實驗資料[60]，尤其是現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展更容易構(gòu)建特定熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚，通過特定臟器中熒光表達(dá)位置以及水平的考察，能夠輕易實現(xiàn)藥物潛在器官毒性的確定。

然而斑馬魚模型也存在以下不足：（1）許多斑馬魚實驗技術(shù)與方法尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，如不同實驗?zāi)康闹恤~齡的選擇、藥物的給藥方式和時間、評價指標(biāo)及其變化水平的不統(tǒng)一造成不同團(tuán)隊實驗結(jié)果的不一致性、差異性和不可傳遞性。如在肝毒性評價中，全正揚(yáng)等[61]同樣以斑馬魚死亡率、肝臟形態(tài)、肝臟及卵黃囊的尺寸比為評價指標(biāo)發(fā)現(xiàn)何首烏中大黃素的毒性最大，蘆薈大黃素卻沒有明顯的毒性效果，這與全云云[13]的實驗結(jié)果存在一定差異。此外，在以肝臟面積為評價指標(biāo)時，其變化水平與肝損傷沒有建立明確的聯(lián)系，即臟器表型變化是否能夠代表臟器損傷及損傷程度并不明確。（2）傳統(tǒng)體內(nèi)ig給藥與斑馬魚暴露給藥途徑不同，對藥物體內(nèi)代謝過程以及藥物的安全性評價結(jié)果的影響也不確定。

綜上所述，斑馬魚模型以其高通量優(yōu)勢及體內(nèi)動物模型的生物復(fù)雜性，成為傳統(tǒng)體內(nèi)外模型之間的溝通橋梁，可用于藥物研發(fā)早期階段準(zhǔn)確篩選和評價藥物的潛在毒性成分以及主要靶器官，降低藥物研發(fā)風(fēng)險[62]。同時，通過斑馬魚高效評價毒性與成分含量進(jìn)行相關(guān)分析，以高效辨識毒性成分群，在一定程度上能夠克服單體成分-單味藥-復(fù)方安全性評價中毒性追蹤低效、高成本的缺陷。不可忽視的是，斑馬魚安全性評價體系的準(zhǔn)確性、評價方法的規(guī)范性、評價指標(biāo)的靈敏性仍有待進(jìn)一步利用大量樣本進(jìn)行驗證，規(guī)范并確立以斑馬魚模型為基礎(chǔ)的評價標(biāo)準(zhǔn)、探究斑馬魚體內(nèi)藥物代謝過程也是日后中藥安全性評價體系的發(fā)展方向，同時也為中藥安全性研究提供了新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on safety evaluation of traditional Chinese medicine based on zebrafish model

FAN Qi-qi, LI Zhi-qi, CHEN Mei-lin, ZHAO Chong-jun, LIN Rui-chao

Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Chinese Materia Medica, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

The clinical use of toxic traditional Chinese medicine (TCM) is characteristic of TCM, and toxic TCM is used to treat various diseases with a wide application, especially for chronic diseases and serious diseases. However, the study data of toxic TCM are still insufficient, which can’t provide sufficient reference basis for systematic elaboration of toxic theoretical basis and clinical safe use of TCM. Compatibility and processing of TCM are effective means of reducing toxicity and enhancing efficacy in clinical practice. It is vital to accurately and systematically explain the influence of processing compatibility on the safety and effectiveness of TCM. In recent years, zebrafish has gradually become a model organism for studying the toxicity of drugs (including TCM) due to its specific physiological advantages. Therefore, zebrafish has been used in the toxicity screening and evaluation of various toxic substances. Toxic screening and assessment, processing and compatibility, and related mechanism of TCM based on zebrafish model are reviewed in this paper, in order to provide reference for wide application of zebrafish in the toxicity study of TCM and establishment of related toxicity standards.

traditional Chinese medicine; zebrafish model; toxicity; safety evaluation; processing; compatibility; attenuation

R285.51；R285.53

A

0253 - 2670(2022)01 - 0278 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.032

2021-07-14

國家科技重大專項（2018ZX09735005）；北京中醫(yī)藥大學(xué)新教師啟動基金資助項目（2020-JYB-XJSJJ-009）；北京中醫(yī)藥大學(xué)重點攻關(guān)項目（2020-JYB-ZDGG-035）

范琦琦（1998—），女，碩士，主要研究方向為中藥安全性評價及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。Tel: 19801139715 E-mail: ki_ki1998@163.com

趙崇軍（1988—），男，助理研究員，主要研究方向為中藥安全性評價及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。Tel: 15301127325 E-mail:1014256537@qq.com

林瑞超（1954—），教授，主要研究方向為中藥品質(zhì)評價。E-mail: linrch307@sina.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]