梁凱，閆巧珍，王曉聞，朱俊玲

(山西農業(yè)大學，山西 晉中 030801)

小米富含人體所需的各類營養(yǎng)物質，有清熱、滋陰、健脾等入藥功效[1]。最值得一提的是，小米中含有豐富的多酚類物質，多酚類物質具有多種生理功能，對人體健康起著積極的作用[2]。當人體內有大量的自由基時，會使細胞膜受損，從而引發(fā)體內各種疾病[3]。國內外研究表明，小米中富含的多酚類化合物具有消除有害自由基、抗氧化、抑菌、食品保鮮等功效，可廣泛用于食品工業(yè)[4]。

在調味品等食品行業(yè)中，食品添加劑的應用十分廣泛，但是市售調味品中所使用的添加劑大多數(shù)為人工合成，存在著一定的危險性，如：抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ等。所以，天然提取物作為添加劑應用在調味品等食品行業(yè)成為近些年來研究的熱點。丁培峰等[5]將納他霉素和茶多酚添加到醬油中，其防腐、抗氧化效果十分明顯且安全性大大提髙。張兆英等[6]研究了金絲小棗多酚的抗氧化性和抑菌活性，金絲小棗多酚對枯草芽孢桿菌、大腸杄菌、曲霉、根霉4種菌有不同程度的抑制作用，可作為天然食品添加劑應用于食品保鮮。杜瑜欣等[7]綜述了甘蔗多酚在食品、調味品中的應用。

目前，針對葡萄多酚、芒果多酚、茶多酚等的研究較多，關于小米多酚體外生物活性的研究鮮有報道。本試驗對小米多酚的抗氧化性和降血糖活性進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米多酚粗提物凍干粉(純度為31.80%)、小米多酚純化物凍干粉(純度72.80%)：均為實驗室自制；纖維素酶(100000 U/g)、果膠酶(50000 U/g)、沒食子酸、福林酚、AB-8大孔樹脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鄰二氮菲、三氯化鐵、三氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、菲洛嗪(Ferrozine)、三氯甲烷、冰乙酸、異辛烷、p-茴香胺、三氟化硼、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside， PNPG)、葡萄糖：均為分析純；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶：生物試劑；阿卡波糖：純度>98%。

1.2 儀器與設備

T-AOC試劑盒；葡萄糖測定試劑盒；UV-1100可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；SC-3610低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；DHP-9032恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；FA25高速組織分散均質機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小米多酚類物質的提取及分離純化

將小米粉碎，過80目塞，脫脂干燥處理后精確稱取5 g，加酶(纖維素酶∶果膠酶為7∶3)搖勻，按實驗設計的方案調節(jié)溶液pH，在設定的溫度下水浴一定時間后，冷卻，離心取上清液得到待測液Ⅰ。取濾渣，加入70%乙醇，在40 ℃下水浴1 h，離心取上清液，得到待測液Ⅱ，合并提取液Ⅰ和Ⅱ，并通過旋轉蒸發(fā)濃縮至一定體積。然后參考王若蘭等[8]采用大孔樹脂分離純化小米多酚的方法和條件將小米多酚進行分離純化。

1.3.2 小米多酚對DPPH自由基清除率的測定

配制小米多酚粗提物、小米多酚純化物、Vc，濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL。實驗采用Brandwilliams W等[9]和Cengiz S等的方法，略做改動。將不同樣品的各濃度溶液2 mL加入到比色管中，加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL于暗處反應30 min后，于517 nm處測吸光值，同時用無水乙醇調零，以Vc作為陽性對照。根據(jù)公式(1)計算出其清除率和IC50值。

(1)

式中：Ai為不同濃度樣品溶液+DPPH溶液測得的吸光值；Aj為不同濃度樣品溶液+無水乙醇測得的吸光值；Ac為無水乙醇+DPPH溶液測得的吸光值。

1.3.3 小米多酚對羥基自由基清除率的測定(鄰二氮菲-Fe2+法)

配制小米多酚粗提物、小米多酚純化物、Vc，濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL。采用閆巧珍等[10]的方法，略做改動。將1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、2 mL PBS溶液(0.1 mol/L， pH 7.4)、1 mL不同濃度樣品溶液混合均勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液繼續(xù)混勻后再加入1 mL 0.01% H2O2，置于37 ℃的水浴鍋中1 h，取出于536 nm處測定吸光值。同時設置空白，Vc作為陽性對照，根據(jù)公式(2)計算出清除率和IC50值。

(2)

式中：AS為加入樣品測得的吸光值；AB為未加樣品，蒸餾水代替H2O2測得的吸光值；AP為未加樣品，加入H2O2測得的吸光值。

表1 羥基自由基清除率測定的加樣方法

1.3.4 小米多酚還原力的測定

精確稱取小米多酚粗提物、小米多酚純化物、Vc，分別配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的溶液。采用Tsantili E等[11]的還原力的測定方法，稍做改動。分別在比色管中依次加入1 mL不同濃度的樣液、2.5 mL PBS溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)、2 mL 1%的鐵氰化鉀混勻，置于50 ℃的水浴鍋中20 min，取出冷卻后再加入1 mL 10%的三氯乙酸混勻，在混合溶液中吸取2.5 mL液體，分別加蒸餾水2.5 mL、0.1%的三氯化鐵0.5 mL，于700 nm處測其吸光度。同時，以Vc作為陽性對照。

1.3.5 小米多酚對鐵離子絡合作用的測定

采用趙文婷[12]測定藜麥麩皮總皂苷對金屬離子螯合能力的方法，測定小米多酚對金屬離子的螯合率。EDTA作為陽性對照，根據(jù)公式(3)計算出其螯合率。

(3)

式中：A0為樣液+蒸餾水(對照組)所測得的吸光值；A為樣液+Ferrozine試劑(樣品組)所測得的吸光值。

1.3.6 總抗氧化能力(T-AOC)的測定(ABTS法)

配制ABTS工作液：2660 μL檢測緩沖液+175 μL ABTS溶液+140 μL過氧化物溶液(用雙蒸水稀釋40倍)于溫室避光保存，30 min內使用完,配制過氧化物酶應用液(40 μL過氧化物酶+360 μL檢測緩沖液)。繪制Trolox標準曲線。向空白孔中加入10 μL雙蒸水、20 μL過氧化物酶應用液、170 μL ABTS工作液(A0)；測定孔中加入10 μL不同濃度的樣品溶液、20 μL過氧化物酶應用液、170 μL ABTS工作液(A1)，室溫下反應6 min，于405 nm處測定各孔的OD值。計算ABTS自由基清除率。

(4)

1.3.7 小米多酚抑制α-淀粉酶活性的實驗

本實驗采用葉瓊仙等[13]的方法，并稍做改動。稱取一定量的小米多酚粗提物、純化物和陽性對照阿卡波糖，分別溶于0.1 mol/L的PBS溶液(pH 6.8)，配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的各樣品溶液，取500 μL與500 μL用0.1 mol/L，pH 6.8的PBS溶液配制成的α-淀粉酶溶液(12.5 U/mL)混合均勻，于37 ℃下反應5 min。再向其中加入500 μL 1%可溶性淀粉，于37 ℃下反應5 min。反應完成后加入500 μL DNS顯色劑終止反應，將其置于100 ℃水浴5 min，取出冷卻。將反應體系用0.1 mol/L PBS溶液定容至10 mL,于540 nm處測定其吸光度值。根據(jù)公式(5)計算出小米多酚對α-淀粉酶的抑制率。

(5)

式中：A背景為用緩沖液代替α-淀粉酶溶液的吸光值；A樣品為加入樣品的吸光值；A陰性為用緩沖液代替樣品溶液的吸光值。

1.3.8 小米多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的實驗

本實驗采用Liu Y T等[14]的方法，并稍做改動。稱取一定量的小米多酚粗提物、純化物和陽性對照阿卡波糖分別溶于0.1 mol/L的PBS溶液(pH 6.8)，配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的各樣品溶液。取0.1 mol/L的PBS溶液(pH 6.8)1.2 mL和2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液(按酶活力計算，用0.1 mol/L PBS，pH 6.8溶液配制)0.25 mL混勻，取0.3 mL各濃度樣品溶液，在37 ℃恒溫水浴15 min，取出添加2.5 mmol/L PNPG溶液0.25 mL，搖勻后在37 ℃恒溫水浴25 min，取出加入1 mL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液。在540 nm下測定其吸光度值，根據(jù)公式(6)計算出小米多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(6)

式中：A背景為用緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光值；A樣品為加入樣品的吸光值；A空白為用緩沖液代替樣品溶液的吸光值。

1.3.9 小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定

小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定參照Sharma等[15]的方法，并稍做改動。將葡萄糖配制成濃度為50，100，200 mmol/L的溶液。精確稱取0.3 g小米多酚粗提物與純化物，分別將其用濃度為50，100，200 mmol/L的葡萄糖溶液定容到100 mL，則5，10，20 mmol為初始葡萄糖含量，用磁力攪拌器攪拌均勻后放置于37 ℃保存，吸附6 h后取出，離心(3000 r/min，10 min)，取上清液1 mL，適當稀釋后，用葡萄糖測定試劑盒測定各組小米多酚葡萄糖溶液的葡萄糖含量。小米多酚對葡萄糖的吸收能力根據(jù)公式(7)計算。

(7)

式中：C2為葡萄糖初始含量，mmol；C1為吸收后葡萄糖含量，mmol；M為樣品重量，g。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析與處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel錄入，采用Origin 9.1繪圖和SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析，所有實驗獨立重復3次。

2 結果與分析

2.1 小米多酚體外抗氧化性研究

2.1.1 小米多酚對DPPH自由基清除率的測定

由圖1可知，3種樣品對DPPH自由基的清除能力有所差別，對比Vc，純化物與粗提物相對較弱，其大小排序為Vc>純化物>粗提物。Vc是目前公認的強抗氧化劑，在0.05 mg/mL的濃度下，清除率已經(jīng)為(51.32±1.68)%。在濃度為0.05～0.25 mg/mL的范圍內，所有實驗組的清除率都隨著濃度的增大而增大。粗提物的濃度為0.2 mg/mL時其抗氧化能力與0.05 mg/mL的純化物相當，純化后小米多酚中雜質減少，抗氧化成分含量升高，這說明純化起到了很好的效果。計算得到各樣品的IC50值分別為：Vc(21.91±3.26) μg/mL，粗提物(266.32±4.92) μg/mL，純化物(125.94±5.22) μg/mL。

圖1 DPPH自由基清除率的測定Fig.1 The determination of DPPH free radical scavenging rate

2.1.2 小米多酚對羥基自由基清除率的測定(鄰二氮菲-Fe2+法)

由圖2可知，Vc、小米多酚粗提物、小米多酚純化物對羥基自由基都有一定的清除能力，但在同等濃度下3種樣品對羥基自由基表現(xiàn)出不同的清除能力，均為陽性對照Vc>純化物>粗提物。當樣品濃度大于1.0 mg/mL時，各樣品的清除率增長趨于平緩，并無明顯增大。小米多酚對羥基自由基的清除效果可能與小米多酚的結構相關，有關研究表明多酚苯環(huán)上的酚羥基數(shù)量越多則對羥基自由基的清除能力越大，故純化后小米多酚的清除率有所增強。計算得到各樣品的IC50值分別為：Vc(0.12±0.32) mg/mL，粗提物(9.04±0.26) mg/mL，純化物(2.52±0.16) mg/mL。

圖2 羥基自由基清除率的測定Fig.2 The determination of hydroxyl radical scavenging rate

2.1.3 小米多酚還原力的測定

由圖3可知，在濃度范圍為0.5～2.5 mg/mL內，粗提物與純化物的還原力遠低于Vc，表明小米多酚對Fe3+的還原能力較差。此外，純化物的還原力始終高于等濃度下的粗提物，尤其是當濃度達到1 mg/mL后，純化物的還原力都達到粗提物的3倍以上。

圖3 還原力的測定

2.1.4 小米多酚對鐵離子絡合作用的測定

由圖4可知，在濃度為0.2～1.0 mg/mL內，3種樣品的金屬離子螯合率逐漸增大。粗提物對金屬離子的螯合能力遠低于純化物和EDTA，其絡合作用依次為EDTA>純化物>粗提物。當粗提物濃度為0.2 mg/mL時，粗提物基本無螯合作用。濃度為1.0 mg/mL時，純化物的螯合率是粗提物的2倍。

圖4 對金屬離子的螯合作用

2.1.5 總抗氧化能力(T-AOC)的測定(ABTS法)

2.1.5.1 ABTS自由基清除率的計算

由圖5可知，Vc與小米多酚純化物對ABTS自由基具有明顯的清除效果。在濃度為0.05～0.25 mg/mL的范圍內，各種樣品濃度與清除率呈現(xiàn)出正相關。當濃度達到0.25 mg/mL時，純化物與粗提物的清除率明顯增大，此時對ABTS自由基的清除率分別為Vc的63.23%、20.82%。通過計算可得出各樣品的IC50值分別是Vc(0.03±0.02) mg/mL，純化物(0.24±0.03) mg/mL，粗提物(0.92±0.05) mg/mL。

圖5 ABTS自由基清除率的測定

2.1.5.2 Trolox標準曲線的繪制

圖6 Trolox標準曲線

得到的回歸方程為y =-0.9814x+1.1201，R2=0.9972，表現(xiàn)出良好的相關性。

2.1.5.3 總抗氧化能力(T-AOC)的表示

通過計算得到各樣品的總抗氧化能力，其結果分別表示為：Vc(5.69±0.87) mmol/g，純化物(1.92±0.24) mmol/g，粗提物(0.58±0.32) mmol/g。其中，3個樣品中，Vc與純化物的總抗氧化能力明顯強于粗提物，粗提物中含有的非抗氧化性雜質較多，純化后多酚物質所占含量升高，故表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性。

2.2 小米多酚降血糖活性的研究

2.2.1 小米多酚抑制α-淀粉酶活性的實驗結果

由圖7可知，在0.5～2.5 mg/mL內，3種樣品的濃度與其對α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)出正相關，粗提物和純化物的抑制率均低于等濃度下的陽性對照阿卡波糖。粗提物濃度增大到2.5 mg/mL時，抑制率仍低于20%，抑制效果不明顯，而純化物在濃度為1.0 mg/mL時就達到了(24.72±0.5)%，這說明小米多酚純化物具有較強的抑制α-淀粉酶活性的能力。通過計算得出各樣品的IC50值分別為：阿卡波糖(0.81±1.08) mg/mL，純化物(2.49±0.98) mg/mL，粗提物(7.55±1.22) mg/mL。

圖7 小米多酚對α-淀粉酶活性的抑制率

2.2.2 小米多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的實驗結果

由圖8可知，隨著濃度不斷增大，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率迅速升高，而粗提物和純化物均升高較慢。在0.5～2.5 mg/mL的濃度內，純化物對α-葡萄糖苷酶的抑制率僅僅稍高于等濃度下的粗提物，兩者均表現(xiàn)出較差的抑制效果。當濃度升高到2.5 mg/mL時，粗提物和純化物的抑制率分別為(16.24±0.70)%、(21.20±0.70)%，遠遠低于陽性對照阿卡波糖，僅為等濃度下阿卡波糖的30.07%、39.26%，這說明小米多酚對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，但是效果不是很好。通過計算得出各樣品的IC50值分別為：阿卡波糖(2.34±1.26) mg/mL，純化物(7.01±1.08) mg/mL，粗提物(9.18±0.96) mg/mL。

圖8 小米多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.8 The inhibition rate of millet polyphenols on α-glucosidase activity

2.2.3 小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定結果

由表2可知，小米多酚對葡萄糖有一定的吸收能力，同時隨著初始含量的增加，兩者對葡萄糖的吸收能力都有所上升，說明小米多酚對葡萄糖的吸收并沒有達到飽和，且純化物的吸收能力大于粗提物，這可能與小米多酚的結構特殊性相關，降低了葡萄糖溶液的流動性，從而提高了對葡萄糖的吸收能力，這也是多酚類物質能降低血糖水平的原理之一。

表2 小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定

3 結論

本試驗研究了小米多酚的體外抗氧化活性和降血糖活性。通過抗氧化性試驗可以看出，小米中的多酚類物質具有優(yōu)異的抗氧化性，通過純化后其抗氧化性進一步提高，也說明小米提取物中除多酚類物質外的一些雜質其抗氧化性非常弱甚至無抗氧化性。降血糖試驗表明純化后的小米多酚對α-淀粉酶的抑制率較高，而對α-葡萄糖苷酶的抑制率稍高于等濃度下的粗提物，兩者均表現(xiàn)出較差的抑制效果。即使對小米多酚進行分離純化后抑制率也沒有明顯提高，所以推斷，對α-葡萄糖苷酶的抑制效果可能與小米中多酚類物質的種類相關，某種多酚類特定的結構會對α-葡萄糖苷酶的抑制起到明顯作用，而小米中多酚類物質種類含量單一，起決定性作用的物質含量甚微，所以對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較差，可進一步從小米多酚的結構方面對α-葡萄糖苷酶的抑制活性進行分析。實驗說明小米多酚作為一種天然的抗氧化劑，能夠在食品添加劑和調味品行業(yè)進行深入開發(fā)及應用。小米多酚可作為天然的防腐劑添加到動物性食品中，延長食品的保鮮期，亦可作為調味品添加到果汁、糕點等食品中，保持食品的色澤穩(wěn)定，提高食品的營養(yǎng)價值。本硏究結果為小米多酚的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化加工提供了一定理論依據(jù)和技術參照。