許賢美，蔡鋒隆，吳鳳明，李留安，張建斌，通信作者

透析法制備普魯蘭多糖納米粒子的研究

許賢美1，蔡鋒隆2，吳鳳明2，李留安1，張建斌1，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2. 天津市廣源畜禽養(yǎng)殖有限公司，天津 301824）

研究普魯蘭多糖羥基與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)，使普魯蘭多糖分子基團(tuán)收縮，應(yīng)用透析法使普魯蘭多糖納米化。試驗(yàn)結(jié)果表明：通過(guò)1H-NMR技術(shù)可判斷糖基的構(gòu)型、氫所在的化學(xué)位置，即普魯蘭多糖羥基與鄰苯二甲酸酐已結(jié)合；結(jié)合后電鏡掃描圖可知其顆粒形態(tài)為圓形；1∶3、1∶6、1∶9、1∶12的納米粒子大小的平均值分別為119.2、146.5、176.4和114.3 nm。

普魯蘭多糖；納米粒子；透析法；掃描電子顯微鏡；核磁共振

天然多糖具有親水、安全、穩(wěn)定、無(wú)毒、生物可降解、自然界存在廣泛、易制備和價(jià)格優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，多糖分子鏈有較多不同種類(lèi)的基團(tuán)，經(jīng)化學(xué)和生化方法修飾，可獲得相應(yīng)的功能化多糖衍生物[1-2]。因此，應(yīng)用多糖及其衍生物作為藥物載體的研究報(bào)告日益增多[3]。

普魯蘭糖（Pullulan）是由出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖，又稱(chēng)普魯蘭多糖、短梗霉多糖、茁霉多糖等。BERNIER最先將普魯蘭糖分離并解析其結(jié)構(gòu)[4]，后將其命名為“普魯蘭糖”[5]。普魯蘭多糖具有水溶性、無(wú)毒無(wú)害、黏度低、可塑性強(qiáng)、多羥基易化學(xué)修飾和缺少免疫原性等優(yōu) 點(diǎn)[6-7]，由于這些獨(dú)特的性質(zhì)，逐漸被應(yīng)用于納米藥物載體研究[8-9]，是一種具有極大應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值和前景的多功能型生物制品[10]。

納米粒子作為理想載體可運(yùn)載抗體、藥物，通過(guò)抗原—抗體免疫定向作用到靶向組織或器官。納米粒子的小尺寸效應(yīng)、可修飾性及結(jié)構(gòu)組成的多樣性，使其有可能在重大疾病的早期檢測(cè)與診斷、腫瘤細(xì)胞特異性殺傷、病原體清除及修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[9]。工程化的納米粒子甚至有可能進(jìn)入人體的器官，甚至是單個(gè)細(xì)胞[11]?，F(xiàn)如今多糖納米粒子在心血管疾病治療及抗癌藥物制備中已取得相應(yīng)的研究進(jìn)展，應(yīng)用前景廣闊。而在畜牧業(yè)中可以趨向作用于特定的益生菌，如在不改變?nèi)樗釛U菌性質(zhì)的前提下，疏水改性普魯蘭多糖能促使乳酸桿菌催化產(chǎn)生細(xì)菌素，增強(qiáng)抗菌性能[12]。

本試驗(yàn)鄰苯二甲酸酐在催化劑作用下，與普魯蘭多糖分子中的羥基結(jié)合，使普魯蘭多糖分子基團(tuán)收縮，形成納米粒子。在不同劑量的鄰苯二甲酸酐作用下形成大小不一的納米粒子。將利用該方法制得的普魯蘭多糖納米粒子添加到飼料中更為健康、安全。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑

普魯蘭多糖（Pullulan，購(gòu)自山東福瑞達(dá)生物科技公司）、鄰苯二甲酸酐（Phthalic anhydride，PA，購(gòu)自Sigma公司）、N-N二甲基甲酰胺（DMF，購(gòu)自Sigma公司）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，購(gòu)自Sigma公司）、氮?dú)猓ㄙ?gòu)自天津市興威氣體有限公司）、無(wú)水乙醇（購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.2 儀器及設(shè)備

智能磁力攪拌電熱套（河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司）、濾膜（美國(guó)Spectra/Por透析膜）、凍干機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）、核磁共振儀、納米粒度分析儀、電子顯微鏡。

1.3 操作步驟

1.3.1 普魯蘭多糖納米粒子制備

本試驗(yàn)在普魯蘭多糖中分別添加4個(gè)不同比例鄰苯二甲酸酐（1∶3、1∶6、1∶9、1∶12），篩選最適的添加比例。本試驗(yàn)參考HONG等的方法[12]。

試驗(yàn)步驟如下：

（1）用分析天平稱(chēng)取一定量的普魯蘭多糖加入用三口燒瓶裝有的DMF溶液中溶解（每克多糖用10 mL DMF溶解），用加熱套加熱至54 ℃使普魯蘭多糖溶解。

（2）稱(chēng)取一定量DMAP溶于DMF溶液中（每mol普魯蘭多糖加0.1 mol DMAP做催化劑）。

（3）將（1）中的普魯蘭多糖溶解后，充入氮?dú)?0 min，將三口燒瓶?jī)?nèi)的空氣排凈，排凈后，將（2）中的催化劑加入三口燒瓶中。

（4）在54 ℃充分反應(yīng)48 h后，冷卻，將冷卻后的溶液倒入Spectra/Por透析膜中，并把裝好液體的濾膜放至4 ℃蒸餾水中透析。

（5）透析24 h之后，用250 mL無(wú)水乙醇洗滌，去除未反應(yīng)的疏水性基團(tuán)，洗滌過(guò)夜。

（6）洗滌后，將濾包中的溶液轉(zhuǎn)移至離心管，冷卻干燥。

（7）干燥后，稱(chēng)量?jī)龈晌镔|(zhì)的重量并溶解（按照每10 mg凍干物質(zhì)用1 mL DMF溶解）。

（8）溶解完全后，移入濾膜中，再次放入預(yù)冷后的4 ℃蒸餾水中進(jìn)行透析，24 h之后取出。

（9）水透析結(jié)束，將濾膜中的溶液凍干，即制得成品，呈泡沫狀。

1.3.2 樣品分析

本次試驗(yàn)樣品檢測(cè)采取方法為固體核磁共 振-H譜、電鏡掃描形貌及納米粒度測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振（1H-NMR）結(jié)果

對(duì)樣品進(jìn)行1H-NMR分析可知，普魯蘭納米粒子糖基的構(gòu)型、氫所在的化學(xué)位置以及這些氫的相對(duì)數(shù)量關(guān)系，根據(jù)鄰苯二甲酸酐和普魯蘭多糖反應(yīng)結(jié)合后制得的納米粒子中不同基團(tuán)的結(jié)合率，可知所得到的樣品即是納米粒子。

1∶3、1∶6、1∶9、1∶12核磁共振結(jié)果中均出現(xiàn)明顯峰值如圖1、圖2所示，由此可以看出4個(gè)添加濃度均可使普魯蘭多糖納米化。

2.2 電鏡（SEM）結(jié)果

將1∶9制得的樣品放大至50 000倍（圖3）時(shí)，可看出其納米粒子表征呈圓形且其中有大小不一的孔徑；將1∶12制成樣品放大至50 000倍（圖4）可見(jiàn)納米粒子表征為圓形，有孔徑并且其直徑明顯小于1∶9。

由1∶3及1∶6濃度樣品電鏡檢測(cè)結(jié)果圖像也可看出，其直徑明顯較1∶9及1∶12濃度制得納米粒子大。研究結(jié)果表明，隨鄰苯二甲酸酐添加量增多，制成的納米粒子的疏水性增強(qiáng)。

2.3 納米粒子粒度測(cè)定結(jié)果

通過(guò)圖5可知，1∶3制得普魯蘭多糖納米粒子大小為229.8 nm，所占比例為81.9%，平均大小為119.2 nm；1∶6制得普魯蘭多糖納米粒子大小為190.1 nm，所占比例為94.3%，平均大小為146.5 nm；1∶9制得普魯蘭多糖納米粒子大小為143.7 nm，所占比例的97.3%，平均大小為176.4 nm；1∶12制得普魯蘭多糖納米粒子大小為124.8 nm，所占比例為98.5%，平均大小為114.3 nm。由此可知，1∶3和1∶6時(shí)雜質(zhì)對(duì)其影響較大，使其均值與實(shí)際情況偏差較大，而1∶9及1∶12時(shí)制得的普魯蘭多糖納米粒子大小均勻度比較高，1∶12時(shí)所制成的納米粒子粒度大小最小，與其電鏡檢測(cè)結(jié)果相一致。試驗(yàn)研究表明，隨著支鏈淀粉中共軛鄰苯二甲酸基團(tuán)數(shù)量增加，納米粒子顆粒大小減小，且均勻度比較大。可知1∶12是較1∶3、1∶6及1∶9更適合該方法制備普魯蘭多糖納米粒子的鄰苯二甲酸酐的最佳比例。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用鄰苯二甲酸酐與普魯蘭多糖反應(yīng)使普魯蘭多糖分子基團(tuán)收縮的方法形成普魯蘭納米粒子。制成的樣品經(jīng)1H-NMR分析可知，鄰苯二甲酸酐與普魯蘭多糖結(jié)合，且成功合成所需普魯蘭多糖納米粒子；經(jīng)SEM掃描可知粒子的表征為圓形，分布較均勻；DLS測(cè)定結(jié)果精確比較出各濃度之間的差異，所添加的4個(gè)鄰苯二甲酸酐濃度梯度均可制出成功的普魯蘭多糖納米粒子，最適濃度比例為1∶12。

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Study on the preparation of pullulan polysaccharide nanoparticles by dialysis

Xu Xianmei1, Cai Fenglong2, Wu Fengming2, Li Liuan1, Zhang Jianbin1,Corresponding Author

（1. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Guangyuan Livestock and Poultry Breeding Co., Ltd., Tianjin 301824, China）

The purpose of this experiment was to study the reaction of pullulan polysaccharide hydroxyl with phthalic anhydride, and to shrink the molecular group of pullulan polysaccharide by dialysis. The results showed that the configuration of the sugar group and the chemical position of the hydrogen could be determined by1H-NMR; That is, the pullulan polysaccharide hydroxyl group had been combined with phthalic anhydride. According to the SEM, the particle shape was round. The mean particle sizes of 1∶3, 1∶6, 1∶9, 1∶12 were 119.2 nm, 146.5 nm, 176.4 nm and 114.3 nm, respectively.

pullulan polysaccharide; nanoparticles; water dialysis; sweep electron microscope（SEM）; nuclear magnetic resonance（NMR）

1008-5394（2021）04-0023-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.006

S828

A

2020-04-07

天津市級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目資助（201810061104）；天津市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTPRS2021006）；天津市“131”創(chuàng)新型人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（20180318）；天津市科技重大專(zhuān)項(xiàng)與工程項(xiàng)目（18ZXBFNC00310）

許賢美（1998—），男，本科在讀，研究方向：動(dòng)物科學(xué)。E-mail：1710472604@qq.com。

張建斌（1976—），男，副教授，博士，研究方向：畜禽健康養(yǎng)殖。E-mail：zjbzwz@126.com。

責(zé)任編輯：張愛(ài)婷