王 霞，姜潤學(xué)，王會志

肺癌為高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類健康，在我國每年新檢出病人人數(shù)約占世界總檢出病人數(shù)的1/2[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占據(jù)所有肺癌病理類型的主導(dǎo)地位，近年來隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，NSCLC的分子靶向治療領(lǐng)域得到極大的推進(jìn)，新型靶向藥物不斷涌現(xiàn)，但當(dāng)前對NSCLC發(fā)生發(fā)展分子機制仍不完全清楚，有待我們進(jìn)一步的研究，尋找新的基因治療靶點、判斷及影響預(yù)后的分子標(biāo)志物有著重要意義。B細(xì)胞易位基因1(B-cell translocation gene 1,BTG1)是BTG/TOB基因家族之一，參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，是新型腫瘤抑制基因[2-3]。在本實驗中，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測NSCLC中BTG1的表達(dá)，旨在探討NSCLC預(yù)后與BTG1表達(dá)之間的關(guān)系?，F(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6-12月，在我院行手術(shù)切除的73例NSCLC病人資料進(jìn)行本項研究。納入病例均由病理學(xué)確診為NSCLC，隨訪和臨床資料完整，在手術(shù)前未施行化療、放療，其中，男40例，女33例；年齡38～74歲，中位年齡59歲。待術(shù)后即從標(biāo)本腫瘤組織取材，用4%甲醛固定后再應(yīng)用石蠟包埋，擬行免疫組織化學(xué)檢測。依據(jù)2017年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布第八版肺癌分期，Ⅰ+Ⅱ期31例，Ⅲ期42例；肺癌組織學(xué)分級Ⅰ級26例，Ⅱ+Ⅲ級47例。術(shù)后以電話、門診復(fù)診和再次住院治療相結(jié)合方式隨訪病人≥5年或至病人死亡。

1.2 主要抗體和試劑 DAB 顯色試劑盒與SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒均購買來自北京中杉金橋生物公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判讀 制作4 μm標(biāo)本石蠟切片，將其脫蠟至水，內(nèi)源性過氧化物酶由3%過氧化氫阻斷10 min，20 min修復(fù)胰酶，山羊血清10%室溫20 min封閉，4 ℃冰箱濕盒加入BTG1抗體(1∶100)過夜。滴入二抗、三抗，濕盒內(nèi)室溫下20 min孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，然后脫水，封片。2名高年資病理科醫(yī)生在雙盲情況下進(jìn)行判定染色結(jié)果。高倍顯微鏡(×400)下計數(shù)細(xì)胞，每標(biāo)本取3張切片每切片隨機計數(shù)5個視野。BTG1蛋白的表達(dá)以陽性細(xì)胞百分率與染色強度得分之和進(jìn)行綜合判讀：陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)百分比<5%，細(xì)胞未染色或染色極弱；陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)百分比≥5%，細(xì)胞被染成淡黃色、黃色乃至棕黃色。用PBS取代一抗為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用χ2檢驗、log-rank檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 BTG1表達(dá)與NSCLC病人臨床病理參數(shù)之間關(guān)系 在73例NSCLC中BTG1蛋白陽性表達(dá)病人28例，陽性率為38.4%，BTG1表達(dá)陽性組與陰性組病人腫瘤直徑、病理類型、性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BTG1蛋白表達(dá)陽性組與陰性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、病理分期、組織學(xué)分級差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 BTG1表達(dá)與NSCLC病人臨床病理參數(shù)之間關(guān)系[n;百分率(%)]

2.2 BTG1表達(dá)與NSCLC病人5年生存之間關(guān)系 病人5年生存20例，生存率27.4%，BTG1表達(dá)陽性組5年生存率高于表達(dá)陰性組(P<0.05)(見表2)。

表2 BTG1表達(dá)與NSCLC病人5年生存之間關(guān)系[n;百分率(%)]

2.3 不同BTG1表達(dá)情況病人生存分析 Kaplan-Meier法分析顯示BTG1表達(dá)陰性病人的生存曲線較BTG1陽性病人下降更為陡峭，log-rank檢驗顯示BTG1陽性與陰性病人生存曲線的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.50，P<0.05)(見圖1)。

3 討論

NSCLC發(fā)病率約占所有肺癌的80%[4]，并且NSCLC發(fā)病程逐年上升趨勢，具體的發(fā)病因素并不完全清楚，一般情況認(rèn)為肺癌的發(fā)生發(fā)展有著眾多因素參與及調(diào)控，其中包括癌癥抑制基因失活、癌基因突變、修復(fù)DNA基因及調(diào)節(jié)凋亡基因改變等，是一個長時期的惡變過程。當(dāng)抑癌基因出現(xiàn)突變或缺失等異常改變時，其會發(fā)生非正常的表達(dá)，從而對某些細(xì)胞增殖的調(diào)控作用常常會減弱或消失，這一作用機制的異常往往是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。NSCLC惡性程度高、侵襲力強，并且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，對病人的預(yù)后產(chǎn)生嚴(yán)重影響。外科學(xué)、放射治療學(xué)技術(shù)不斷更新，化療、生物治療、分子靶向治療等多種治療方法及藥物不斷出現(xiàn)，NSCLC病人生存質(zhì)量得到了一定提高，預(yù)后有所改善，但其治療效果并不十分理想[5]，局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響病人預(yù)后的決定性因素，本研究中發(fā)現(xiàn)73例NSCLC病人中5年內(nèi)死亡53例，死亡率為72.6%，所以尋求能夠預(yù)示NSCLC預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)相當(dāng)重要。

BTG1基因的發(fā)現(xiàn)最初源于慢性B淋巴細(xì)胞白血病病人的易位基因之中，BTG1是髓系白血病治療緩解的重要標(biāo)志物[6]。眾多研究[7-11]結(jié)果顯示，BTG1表達(dá)量在喉癌、乳腺癌和卵巢癌組織中要顯著低于正常對照組織，并且病人的腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級越差，BTG1蛋白的表達(dá)程度越低，BTG1在抗細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期演進(jìn)的調(diào)節(jié)中扮演了重要的角色，在研究其分子機制體外實驗中，通過調(diào)高BTG1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平從而能夠降低CyclinD1、CyclinB1、CyclinE1等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，使抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、PI3K、survivin、AKT的表達(dá)減少、凋亡促進(jìn)蛋白Bax、caspase-3表達(dá)增加，下調(diào)MMP-2、MMP-9、VEGF等的表達(dá)。BTG1高表達(dá)可以阻止或延緩腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，其異常表達(dá)與惡性腫瘤發(fā)生和演進(jìn)關(guān)系密切。精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶 1(PRMT1)能夠通過結(jié)合BTG1而導(dǎo)致自身的激活[12]，激活后的PRMT1能夠調(diào)控基因的甲基化，使相關(guān)基因的表達(dá)受到顯著影響，與腫瘤的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[13]。BTG1還參與脂多糖和γ-干擾素作用，通過JAK/STAT1 通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。

本實驗分析顯示，病人BTG1蛋白表達(dá)水平與NSCLC的腫瘤直徑、病理類型及該病人的性別、年齡無關(guān)，而與腫瘤病理分期、組織學(xué)分級、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)，提示BTG1可能在降低NSCLC細(xì)胞的惡性侵襲能力發(fā)揮著重要作用，從而延緩NSCLC的發(fā)生和發(fā)展。有體外實驗研究[15]顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染而明顯提高了BTG1表達(dá)量的肺癌H1299細(xì)胞株抗凋亡蛋白Bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9表達(dá)顯著減少，從而使得轉(zhuǎn)基因的H1299細(xì)胞增殖受到抑制，生長增殖顯著受抑制，凋亡明顯增多，侵襲及轉(zhuǎn)移能力減弱。綜合以上的研究顯示BTG1是NSCLC的抑制基因。本研究顯示NSCLC病人5年生存率與BTG1表達(dá)狀態(tài)明顯相關(guān)，在BTG1陽性表達(dá)的病人中其5年生存率達(dá)到42.9%，明顯優(yōu)于BTG1陰性表達(dá)病人，其差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，遂可以將其用作指示病人預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，本研究顯示BTG1表達(dá)高低差異與病人預(yù)后緊密相關(guān)，BTG1低表達(dá)或不表達(dá)可以作病人預(yù)后的不良指標(biāo)，可考慮對高危病人密切隨訪，從而及時給予干預(yù)，有助于延長病人總生存期。