劉華長，楊彥立，薛增明，任 珊

血管內(nèi)皮細胞覆蓋于血管內(nèi)膜的表面，是血管壁與血液之間的天然屏障，對維持人體生命活動的運行具有重要作用。研究[1-3]顯示，血管內(nèi)皮細胞的激活、增殖、遷移、黏附和凋亡與冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓、膿毒癥等諸多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。微小RNA(miRNA)是一類保守的內(nèi)源性非編碼RNA分子，近年研究表明，miRNA表達異常可調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖、遷移、黏附等功能，參與血管發(fā)育、新血管形成、血管炎癥等的調(diào)節(jié)，與多種心血管疾病病理生理進程有關(guān)[4]。有研究[5]指出，在模擬微重力條件下，miR-503-5p可以通過抑制B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)表達，在一定程度上誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡，提示miR-503-5p可能參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能。血管內(nèi)皮細胞在受到血液中各種危險因子刺激后產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡。因此，本研究以促炎因子白細胞介素1β(IL-1β)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞，探討miR-503-5p對IL-1β刺激下血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、凋亡和黏附的影響和作用機制，以期為臨床基于血管內(nèi)皮細胞預(yù)防心血管疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自美國模式菌種保藏中心；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗購于美國Hyclone公司；IL-1β購于美國Sigma公司；miR-503-5p抑制物及其對照由上海吉瑪制藥公司提供；Opti-MEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于哈爾濱新?；驒z測有限公司；SYBR Premix Ex Taq購于大連TAKARA生物科技公司；噻唑藍(MTT)試劑購于北京索萊寶生物科技公司；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物；Transwell小室購于美國BD公司；兔源細胞間黏附分子1(ICAM-1)抗體、鼠源血管細胞黏附分子1(VCAM-1)抗體、鼠源β-actin抗體購于美國Proteintech公司；兔源半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體和兔源裂解的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購于上海艾博抗生物技術(shù)公司。

1.2 細胞培養(yǎng) HUVECs采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的F12K培養(yǎng)基在含5% CO2、濕潤的、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實驗分組及處理 將HUVECs分為4組：正常對照(NC)組為正常培養(yǎng)的HUVECs；IL-1β組參照CHEN等[6]實驗方法用10 ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)HUVECs 24 h；IL-1β+anti-miR-con組為轉(zhuǎn)染anti-miR-con后進行IL-1β誘導(dǎo)；IL-1β+anti-miR-503-5p組為轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p后進行IL-1β誘導(dǎo)。細胞轉(zhuǎn)染步驟：將常溫溶解好的anti-miR-503-5p加入到500 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，同時將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000加入到500 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置孵育5 min。將二者混合后，室溫靜置孵育20 min。將混合好的脂質(zhì)體加入到細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6 h后，吸取舊的培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測轉(zhuǎn)染效果后繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

1.4 RT-qPCR檢測miR-503-5p表達 Trizol試劑提取各組細胞的miRNA，利用一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為擴增模板，按照SYBR Premix Ex Taq使用說明進行qPCR反應(yīng)。引物序列如下：miR-503-5p上游5′-CCT ATT TCC CAT GAT TCC TTC ATA-3′，下游5′-GTA ATA CGG TTA TCC ACG CG-3′；內(nèi)參U6上游5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，下游5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。2-ΔΔCt法量化miR-503-5p的相對表達水平。

1.5 MTT法檢測細胞活力 收集各組細胞，按照5×103個/孔的密度種植到96孔板，培養(yǎng)24、48、72 h時各取出一板細胞，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔490 nm處吸光度值(OD)。

1.6 黏附實驗檢測細胞黏附能力 細胞按照上述分組處理后，進行黏附實驗。用無血清細胞培養(yǎng)基洗滌單核細胞THP-1 2次，調(diào)整為1×106個/毫升的單細胞懸液。向1 mL THP-1細胞懸液中加入5 μL的Calcein AM染料，培養(yǎng)箱孵育30 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次已標記的THP-1細胞，用細胞培養(yǎng)液重懸，取200 μL THP-1細胞加入含有內(nèi)皮細胞的24孔板中，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min，PBS洗滌2次。熒光顯微鏡下拍照，計算黏附細胞數(shù)。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS液輕柔吹打洗滌細胞2次，向細胞沉淀中加入適量的1×結(jié)合緩沖液，重懸細胞使細胞密度達到1×106個/毫升。吸取100 μL細胞懸液至一新管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。補加400 μL的1×結(jié)合緩沖液混勻后，上機檢測細胞凋亡情況。

1.8 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 將各組細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，取5×104個細胞接種于Transwell上室，24孔板下室用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化劑。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，取出小室，用無菌棉簽擦去未過膜細胞，用4%多聚甲醛、結(jié)晶紫分別進行固定和染色。顯微鏡下觀察細胞過膜情況，拍照，進行細胞計數(shù)。

1.9 Western blotting檢測ICAM-1、VCAM-1、caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表達情況 RIPA裂解緩液提取各組細胞的總蛋白。取等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，并利用常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜裝置將分離的細胞蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜后，加入一抗溶液(ICAM-1、VCAM-1、β-actin為1∶500稀釋，caspase-3和Cleaved caspase-3為1∶1 000稀釋)4 ℃條件下孵育膜過夜。用洗膜緩沖液清洗膜3次后，加入二抗溶液室溫孵育膜1 h。用化學(xué)發(fā)光試劑室溫下孵育膜15 min，X線曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs在24～72 h細胞活力顯著降低，細胞中miR-503-5p表達顯著升高；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs在24～72 h細胞活力顯著升高，細胞中miR-503-5p表達顯著降低(P<0.01)。在同一處理組，培養(yǎng)24 、48、72 h細胞活力逐漸升高(P<0.01)(見表1)。

表1 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖的影響

2.2 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞黏附的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs在24～72 h時細胞黏附數(shù)顯著增加(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs在24～72 h時細胞黏附數(shù)顯著減少(P<0.01)。同一處理組，培養(yǎng)24 、48、72 h內(nèi)皮細胞黏附數(shù)量逐漸增加(P<0.01)(見表2)。

表2 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞黏附的影響

2.3 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達增加(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.01)(見圖1～2、表3)。

表3 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡、caspase-3和Cleavedcaspase-3蛋白表達的影響

2.4 anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs遷移細胞數(shù)顯著降低(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs遷移細胞數(shù)顯著升高(P<0.01)(見表4)。

表4 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移的影響

2.5 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞ICAM-1、VCAM-1蛋白表達的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達顯著降低(P<0.01)(見圖3、表5)。

表5 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞ICAM-1、VCAM-1的影響

3 討論

多項研究[7-8]表明，miRNA在內(nèi)皮細胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究[9-11]顯示，一氧化氮(NO)是血管舒張和血流調(diào)控的重要因子，miR-182、miR-155通過調(diào)節(jié)NO的釋放，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的黏附，通過改變miRNA表達可改善內(nèi)皮細胞功能，預(yù)防高血壓病人的血管炎癥和血管舒張功能受損。低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮微顆粒通過攜帶miR-19b進入內(nèi)皮細胞抑制其靶基因轉(zhuǎn)化生長因子2(TGFβ2)表達，抑制內(nèi)皮細胞遷移以及血管形成，對早期動脈粥樣硬化進展具有抑制作用[12]。miR-381可促進氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖，減少細胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，保護內(nèi)皮細胞免受炎癥損傷[13]。miR-503-5p是近年發(fā)現(xiàn)的miRNA，目前對miR-503-5p的研究主要集中在腫瘤方面。研究顯示，卵巢癌[14]、肝癌[15]等惡性腫瘤中miR-503-5p表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制其增殖、遷移能力，促進細胞凋亡，遏制腫瘤進展。本研究探討miR-503-5p在IL-1β誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、凋亡和黏附的作用發(fā)現(xiàn)，IL-1β誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細胞miR-503-5p的表達顯著增加，轉(zhuǎn)染miR-503-5p抑制物下調(diào)miR-503-5p表達可提高血管內(nèi)皮細胞增殖活力和遷移能力。以上結(jié)果說明，抑制miR-503-5p表達對血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移具有促進作用。

caspases是一個高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡執(zhí)行階段起著重要作用。在細胞凋亡信號刺激下caspase-9、Caspases-8等凋亡啟動因子活化，通過一系列途徑促進效應(yīng)因子caspase-3活化，剪切細胞凋亡過程中許多關(guān)鍵酶，促進細胞凋亡[16]。因此，caspase-3的激活是細胞凋亡的一個重要指標。本研究顯示，IL-1β誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細胞caspase-3的激活產(chǎn)物cleaved caspase-3表達量、細胞凋亡率顯著升高，抑制miR-503-5p表達可降低cleaved caspase-3表達水平，減輕IL-1β誘導(dǎo)的細胞凋亡。靜息狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞不表達或僅表達低水平的黏附分子，對白細胞募集具有抵抗作用。在各種刺激作用下，內(nèi)皮細胞活化并表達多種黏附分子如VCAM-1、ICAM-1，這些黏附分子可募集白細胞，調(diào)節(jié)白細胞在血管內(nèi)皮細胞上的黏附，進而導(dǎo)致早期心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[17-18]。本研究顯示，IL-1β誘導(dǎo)后細胞黏附分子VCAM-1和ICAM-1表達、增加，而抑制miR-503-5p表達可降低VCAM-1和ICAM-1水平，減輕IL-1β誘導(dǎo)的細胞黏附。以上研究說明，抑制miR-503-5p表達可保護IL-1β誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞炎性損傷和凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-503-5p表達可促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，保護其免受IL-1β誘導(dǎo)的炎性損傷和凋亡。這些發(fā)現(xiàn)有助于進一步了解血管內(nèi)皮細胞損傷機制，并為臨床開發(fā)基于血管內(nèi)皮細胞的心血管疾病防治策略提供新的視角。