汪景坤，樊麗偉，李 洵，付曉霞，趙彥煥，張東姣，趙玉紅，張 磊

結腸癌是世界上最高發(fā)的惡性腫瘤之一，盡管外科手術治療取得一定進展，但其死亡率一直居高不下，對于晚期及轉移性結腸癌，多學科的綜合治療是其重要手段，其中靶向治療越來越受到關注[1-3]。研究[4]表明circRNA參與調(diào)控結腸癌的進展，可作為潛在的生物標志物，為結腸癌提供潛在的治療靶點。circ_0000515位于chr14:20811305-20811534，又名circRPPH1，circ_0000515低表達與宮頸癌病人預后良好相關；circ_0000515充當miR-326海綿通過上調(diào)ELK1促進宮頸癌的進展[5]。circRPPH1在體內(nèi)促進乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成以及腫瘤生長[6]。然而circ_0000515對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響及機制尚不清楚。研究[7-8]報道上調(diào)的miR-1258可抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移。miR-1258上調(diào)顯著抑制骨肉瘤細胞增殖，并促進細胞周期停滯在G0/G1[9]。circ_0101432通過靶向miR-1258和miR-622并上調(diào)MAPK1表達來抑制肝癌細胞凋亡，促進細胞增殖，侵襲能力和腫瘤生長[10]。然而circ_0000515是否通過調(diào)控miR-1258影響結腸癌細胞增殖和凋亡尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 組織材料 選取我院病理科存檔且已確診的結腸癌病人癌組織及癌旁組織標本41例，其中男24例，女17例，年齡33～75歲，平均(39.9±1.1)歲；所有病人均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑 結腸癌細胞株SW620購自美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑和熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海滬震實業(yè)有限公司。

1.3 細胞處理與分組 結腸癌細胞株SW620用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，將circ_0000515干擾表達載體及其陰性對照、miR-1258模擬物及其陰性對照轉染至SW620細胞中，記為si-circ_0000515組、si-NC組、miR-1258組、miR-NC組；將circ_0000515干擾表達載體分別與miR-1258抑制劑及其陰性對照轉染至SW620細胞中，記為si-circ_0000515+anti-miR-1258組、si-circ_0000515+anti-miR-NC組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circ_0000515和miR-1258的表達水平 提取結腸癌組織及細胞總RNA，按試劑盒使用說明進行RT-qPCR，PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.5 MTT檢測細胞增殖活性 細胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，用酶標儀于450 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集培養(yǎng)48 h細胞，按試劑盒說明書操作，上流式細胞儀檢測。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測蛋白表達 收集細胞，提取總蛋白，取50 μL樣品進行SDS-PAGE，電轉至PVDF，封閉后加入一抗，4 ℃過夜，加入二抗室溫1 h，顯影、定影，成像后檢測蛋白條帶灰度水平，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 構建circ_0000515的野生型和突變型熒光素酶載體WT-circ_0000515和MUT-circ_0000515，將其分別與miR-NC和miR-1258共轉染至SW620細胞中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

將circ_0000515干擾表達載體、過表達載體及其陰性對照轉染至SW620細胞中，按1.4中方法檢測miR-1258表達水平。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用兩獨立樣本t(或t′)檢驗、配對t檢驗、單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 結腸癌組織中circ_0000515和miR-1258的表達 與癌旁組織比較，結腸癌組織中circ_0000515表達水平升高，miR-1258表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 circ_0000515和miR-1258在結腸癌組織中的表達

2.2 抑制circ_0000515表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-circ_0000515組circ_0000515表達水平降低，SW620細胞活性降低，SW620細胞的凋亡率升高，SW620細胞中Ki-67、Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖1、表2)。

表2 抑制circ_0000515表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響

2.3 circ_0000515靶向調(diào)控miR-1258的表達(Circular RNA Interactome)Circular RNA Interactome預測顯示circ_0000515的序列中含有與miR-1258互補的核苷酸序列(見圖2)；miR-1258與WT-circ_0000515共轉染的SW620細胞熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而與MUT-circ_0000515共轉染的SW620細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。過表達circ_0000515后miR-1258表達水平降低，抑制circ_0000515表達后miR-1258表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 circ_0000515調(diào)控miR-1258的表達

2.4 miR-1258過表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-1258組miR-1258表達水平升高，SW620細胞活性降低，SW620細胞的凋亡率升高，SW620細胞中Ki-67、Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖3、表5)。

表5 過表達miR-1258對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響

2.5 干擾miR-1258表達逆轉了抑制circ_0000515表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用 與si-circ_0000515+anti-miR-NC組比較，si-circ_0000515+anti-miR-1258組miR-1258表達水平降低，SW620細胞活性升高，SW620細胞的凋亡率降低，SW620細胞中Ki-67、Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖4、表6)。

表6 干擾miR-1258表達逆轉了抑制circ_0000515表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用

3 討論

分子靶向治療作為新型癌癥治療方法，其在結腸癌的治療中也具有重要意義，而尋找可靠的分子靶點是實現(xiàn)靶向藥物治療的關鍵[11-12]。研究[13]報道circ_0000515在肝癌組織和細胞系中上調(diào)，可用于預測肝癌的腫瘤分期，淋巴轉移和預后；敲除circ_0000515可減弱肝癌Hep3B和MHCC88H細胞的增殖和遷移能力。circ_0000515通過調(diào)控miR-296-5p/CXCL10軸促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲[14]。circ_0000515在腫瘤中可能起促癌作用。本實驗結果顯示，結腸癌組織中circ_0000515表達水平升高；抑制circ_0000515表達后，SW620細胞活性降低，SW620細胞的凋亡率升高，SW620細胞中Ki-67、Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高；說明抑制circ_0000515表達可抑制結腸癌細胞增殖、促進細胞凋亡。

研究[15]報道m(xù)iR-1258通過GRB2/Ras/Erk途徑抑制非小細胞肺癌細胞增殖并誘導衰老和凋亡。miR-1258的過表達抑制了甲狀腺乳頭狀癌KTC-1細胞的活力以及遷移和侵襲的能力[16]。本實驗結果顯示，結腸癌組織中miR-1258表達水平降低；過表達miR-1258抑制SW620細胞增殖，促進細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)circ_0046599可以通過使miR-1258海綿化而增加RPN2表達來促進肝細胞癌的發(fā)展[17]。circ_002178通過調(diào)節(jié)miR-1258/KDM7A軸來促進乳腺癌細胞的生長和遷移[18]。說明circRNA可通過調(diào)控miR-1258影響腫瘤進展。本實驗結果顯示，circ_0000515靶向調(diào)控miR-1258；干擾miR-1258表達逆轉了抑制circ_0000515表達對結腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用。

綜上所述，抑制circ_0000515表達通過靶向上調(diào)miR-1258抑制結腸癌細胞增殖，促進凋亡。