萬 靜，陳曉蘭，董娜娜，鄧鉍莉

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 畢節(jié) 551700)

急性乳腺炎好發(fā)于哺乳期婦女，多由于產(chǎn)后乳汁瘀積、哺乳不當(dāng)?shù)仍蛟斐蒣1]。在臨床上，西醫(yī)主要通過抗生素等藥物治療，或使用穿刺及引流等手術(shù)治療該疾病，預(yù)后較好。但對(duì)于病程比較長的患者，過量使用了抗生素，哺乳會(huì)造成孩子出現(xiàn)一些菌群失調(diào)、腹瀉等癥狀；采用手術(shù)會(huì)給患者身體造成一定機(jī)械傷害。如果乳腺未形成膿腫，中醫(yī)治療不建議使用抗生素，主要通過藥食同源的藥物外敷內(nèi)服來改善病癥[2]。目前，民間常用乳腺寧搽劑治療急性乳腺炎，效果顯著，其組方藥物為木芙蓉葉和穿心蓮。木芙蓉葉為錦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的干燥葉，氣微，味微辛，具有清肺涼血、散熱解毒、消腫排膿等功效，歸肺、肝經(jīng)[3]，穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata( Burm.f.)Ness 的干燥地上部分，味苦，性寒，具清熱解毒、涼血等功效，歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，木芙蓉葉及穿心蓮均具有顯著的抗炎作用[5-6]。

由于抗生素的安全性受到人們關(guān)注，從中醫(yī)傳統(tǒng)處方中發(fā)掘抗炎作用效果明確、毒副作用小的藥物處方具有巨大的開發(fā)和利用價(jià)值?；诖?，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)性分析乳腺寧搽劑治療急性乳腺炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，以期為乳腺寧搽劑外用新劑型的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 方法

1.1 活性成分的篩選

在中國知網(wǎng)(http：//www.cnki.net/)查閱與木芙蓉化學(xué)成分相關(guān)的文獻(xiàn)，查找木芙蓉主要化學(xué)成分。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)，確認(rèn)以上主要化學(xué)成分的SDF結(jié)構(gòu)，并將SDF結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss ADME(http：//www.swissadme.ch/)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，以胃腸道吸收“high”，藥物相似性中兩個(gè)“yes”為篩選條件，篩選木芙蓉的活性成分。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索穿心蓮的活性成分，設(shè)置口服利用度OB≥30%，類藥性DL≥0.18，篩選出穿心蓮活性成分。

1.2 活性成分作用靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

將獲取的活性成分SDF結(jié)構(gòu)式提交到Swiss Target Prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平臺(tái)，預(yù)測活性成分的潛在靶點(diǎn)。以“急性乳腺炎”的英文“Acute mastitis”為檢索詞，在疾病數(shù)據(jù)庫Gene cards (https：/ / www.Gene cards.org/)和OMIM(https：// omim.org/)中檢索，合并檢索數(shù)據(jù)并去重后，得到急性乳腺炎相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化處理

將活性成分靶點(diǎn)及炎癥靶點(diǎn)制作韋恩圖，得到活性成分-疾病共同作用靶點(diǎn)基因。將交集靶點(diǎn)映射出相對(duì)應(yīng)的活性成分，建立乳腺寧膏活性成分治療急性乳腺炎靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。運(yùn)用 Cytoscape3.7.2 軟件(http：// www.Cytoscape.org/ )繪制網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)分析功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)degree值，得到關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將以上基因輸入String數(shù)據(jù)平臺(tái)(http：//string-db.org)，選擇分析的生物體為人類“Homo Sapiens”，將蛋白評(píng)分關(guān)系設(shè)為中等評(píng)分0.4，并隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，將獲取的高置信度蛋白-蛋白互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)degree值篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 GO和 KEGG富集分析

通過David網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO(gene ontology)注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選

查閱文獻(xiàn)，共獲得木芙蓉化學(xué)成分73個(gè)[7-8]，將獲得的化學(xué)成分進(jìn)行ADME篩選，共獲取活性成分11個(gè)；在TCMSP中共獲得穿心蓮化學(xué)成分24個(gè)，去重處理后，乳腺寧活性成分共35個(gè)。根據(jù)活性成分來源進(jìn)行重命名，如阿魏酸 Ferulic Acid來源于木芙蓉，重命名為MFR1；大黃素emodin同樣來源于木芙蓉，重命名為MFR2，以此類推，見表1。

表1 乳腺寧活性成分

2.2 活性成分作用靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

將上述35個(gè)活性成分輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，共預(yù)測了640個(gè)潛在靶點(diǎn)。通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫檢索到疾病靶點(diǎn)132個(gè)，OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到疾病靶點(diǎn)166個(gè)，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果，刪除重復(fù)值后，共得到296個(gè)與急性乳腺炎相關(guān)的靶基因，

2.3 “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化處理

繪制乳腺寧活性成分作用靶點(diǎn)與急性乳腺炎相關(guān)靶點(diǎn)交集基因韋恩圖，得到32個(gè)共同靶點(diǎn)，見圖1。構(gòu)建“活性成分-疾病靶點(diǎn)”的可視化處理網(wǎng)絡(luò)，見圖2。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示：degree排名前10的活性成分見表2。其中，穿心蓮活性成分為8個(gè)，木芙蓉為2個(gè)。degree越高，表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大，由此可知，乳腺寧治療急性乳腺炎的關(guān)鍵藥物主要是穿心蓮，關(guān)鍵成分是Andrographin(5-羥基-7，8，2'-三甲氧基黃酮)。

圖1 藥物活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 The Venn diagram of intersection targets betweenRuxianning and acute mastitis

圖2 乳腺寧的“活性成分-疾病靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Visualization network of active ingredients anddisease targets

成 分degreeAndrographin(CXL18)113-[2-[(1R,4aS,5R,8aS)-5,8a-dimethyl-2-methylene-5-methylol-decalin-1-yl]ethyl]-5H-furan-2-one(CXL14)10Moslosooflavone(CXL6)10Mono-O-methylwightin(CXL5)10Caffeate(MFR4)9Andrographin F(CXL19)914-deoxyandrographolide(CXL17)914-deoxy-12-methoxyandrographolide(CXL9)9oroxylin a(CXL2)9salicylic acid(MFR10)8

在網(wǎng)絡(luò)中，六邊形為藥物名和疾病名，菱形為乳腺寧膏活性成分，三角形為靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的邊為成分與靶點(diǎn)、疾病與靶點(diǎn)的作用關(guān)系。

2.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將32個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，將靶點(diǎn)相互作用評(píng)分設(shè)置為0.4，隱藏1個(gè)游離的靶點(diǎn)，數(shù)據(jù)庫共給出了31個(gè)蛋白的相互作用，保存TSV文本數(shù)據(jù)，導(dǎo)入 cytoscape3.7.2軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。得到31個(gè)靶點(diǎn)，190條蛋白互作的連線，平均度值為11.9，連線粗細(xì)與靶點(diǎn)之間關(guān)系的緊密度呈正相關(guān)。大于平均度值的核心基因有17個(gè)，見圖4。

圖3 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI protein interaction network

圖4 核心靶點(diǎn)Fig.4 The core targets

2.5 基因功能和通路富集分析

2.5.1 GO功能富集分析

本研究得到175個(gè)GO注釋，設(shè)置P值<0.05，篩選出140個(gè)GO注釋，其中，有97個(gè)與生物過程(biological process，BP)，26個(gè)與分子功能(molecular function，MF)，17個(gè)與細(xì)胞組分(cellular component，CC)相關(guān)。涉及到血管收縮調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、脂氧合酶途徑、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等生物過程。分別列舉排名前10的生物學(xué)過程條目，見圖5。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO enrichment analysis

2.5.2 KEGG通路分析

在30條KEGG通路中，設(shè)置P值<0.05，篩選出26條通路，主要涉及癌癥信號(hào)通路、急性髓系白血病、NF-κB信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，見圖6。

圖6 KEGG代謝通路富集分析Fig.6 KEGG metabolic pathway enrichment analysis

3 討論

本研究結(jié)果顯示，乳腺寧搽劑組方藥物的活性成分有35個(gè)，共對(duì)應(yīng)640個(gè)作用靶點(diǎn)，其中與急性乳腺炎相關(guān)的共同靶點(diǎn)32個(gè)。其治療急性乳腺炎的關(guān)鍵活性成分為5-羥基-7，8，2'-三甲氧基黃酮(Andrographin)和新穿心蓮內(nèi)酯(3-[2-[(1R，4aS，5R，8aS)-5，8a-dimethyl-2-methylene-5-methylol-decalin-1-yl]ethyl]-5H-furan-2-one)。5-羥基-7，8，2'-三甲氧基黃酮為穿心蓮中的黃酮類成分[6]。研究表明，穿心蓮黃酮通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。新穿心蓮內(nèi)酯，又名穿心蓮丙素，被譽(yù)為治療肺部疾病、肝炎和炎癥性皮膚病的下一代天然抗炎藥[10]?，F(xiàn)代研究表明，新穿心蓮內(nèi)酯能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞增殖及NO釋放[11]，具有抗炎活性及免疫刺激活性[12]。通過PPI發(fā)現(xiàn)，乳腺寧治療急性乳腺炎各靶點(diǎn)間密切作用主要與白蛋白ALB、表皮生長因子受體EGFR、蛋白激酶AKT1、白細(xì)胞介素1β、髓過氧化物酶MPO等蛋白相關(guān)。其中，ALB的滲出是炎癥反應(yīng)最重要的特征，ALB能結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)各種生理物質(zhì)與毒性物質(zhì)，從而發(fā)揮抗炎作用；AKT1、EGFR能參與細(xì)胞增殖，分化和凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)；炎癥發(fā)生時(shí)，MPO的活性增強(qiáng)，攝中性粒細(xì)胞的數(shù)量越多；IL1B是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)攝中性粒細(xì)胞的滲出，造成乳腺組織的損傷，IL1B激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。

富集分析顯示，乳腺寧有效成分靶點(diǎn)主要通過炎癥反應(yīng)正調(diào)節(jié)(positive regulation of inflammatory response)、一氧化氮生物合成過程正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、肽基酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)等生物學(xué)功能；癌癥信號(hào)通路(Pathways in cancer Acute)、急性髓系白血病(myeloid leukemia)、NF-κB信號(hào)通路( NF-kappa B signaling pathway)等信號(hào)通路，發(fā)揮治療急性乳腺炎的作用。

綜上所述，乳腺寧中的穿心蓮黃酮等主要活性成分可能通過癌癥、急性髓系白血病、NF-κB信號(hào)通路等信號(hào)通路作用于ALB、EGFR、MPO、IL1B、AKT1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)揮酶活性、生物受體活性等生物學(xué)作用，從而達(dá)到治療急性乳腺炎作用。本研究分析了乳腺寧搽劑治療急性乳腺炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為乳腺寧外用新劑型的研發(fā)提供了有價(jià)值的參考。