李旭揚，陳舒苗，于津鵬，羅素蘭，長孫東亭

（1.海南大學 熱帶生物資源教育部重點實驗室/海口市海洋藥物重點實驗室/生命科學與藥學院，?？?570228;2.廣西大學 醫(yī)學院，南寧 530004）

煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)屬于配體門控離子通道，由5 個獨立的亞基組裝而成。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有16 種不同的亞基用于nAChRs 的構成，分別為α1—α7、α9、α10、β1—β4、δ、ε、γ；鳥類及家禽類動物還含有α8 亞基[1]。nAChRs 能夠傳遞ACh 刺激產生的信號，由于分布廣泛，它可介導腦部及其外周的多種生理作用[2-3]，并且這些受體結構在許多物種中高度保守，可通過異源表達進行相關研究[4]。雖然nAChRs是研究前景很好的治療靶點，但由于一些亞型表達困難，相應藥物和基礎科學的研究進展緩慢，尤其是含有α6 亞基的受體，它們在任何重組表達系統(tǒng)中都很難正常表達、形成功能通道[5-6]。這也間接導致α6β4* nAChRs（α6β4 或包含其他亞基形成的亞型）在分子水平上與配體相互作用的研究尚不多見。過去有學者認為含α6 亞基的nAChRs 主要存在于中樞神經系統(tǒng)的兒茶酚胺能神經元中，隨著研究深入，研究者們發(fā)現(xiàn)α6β4* nAChRs 具有可調節(jié)人和猴腎上腺嗜鉻細胞的胞吐[7-8]、控制小鼠海馬去甲腎上腺素的釋放等作用[9-10]。目前，α6β4* nAChR 被認為是一種治療神經病理性疼痛的新靶點，且可用于抑制成癮。已經確定α6β4*亞型的受體在大鼠、小鼠背根神經節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）中有表達。WIESKOPF 等在小鼠上使用表達基因組學鑒定出機械性異常性疼痛與DRG中α6*受體的表達水平有關。通過基因編輯，構建α6*受體功能獲得和缺失的突變體，發(fā)現(xiàn)基因敲除的小鼠機械性異常性疼痛水平增加，同時與神經性、炎性損傷相關的表現(xiàn)與野生型的受體完全不同，推測是由于在DRG 傷害感受器中α6* nAChRs與P2X2/3 受體的共表達產生相互作用，抑制疼痛信號的傳導，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[11-14]。DONVITO 等[15]的研究證實，α6β4* nAChRs 具有調節(jié)THC（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-四氫大麻酚）成癮后戒斷的效果，可作為靶點用于THC 戒斷藥物的開發(fā)。以上研究結果為α6β4*nAChRs 的藥理學研究提供了重要思路，且有助于研究神經病理性疼痛的發(fā)病機理。

β4 亞基在α6β4* nAChRs 的功能研究中顯示出重要的作用，能夠直接影響與配體藥物、激動劑的結合活性。通過對比人類和大鼠β4 亞基胞外配體結合區(qū)序列差異，筆者恰好在形成配體結合口袋的Loop D（54-59）、Loop E（102-118）、Loop F（160-167）附近分別發(fā)現(xiàn)52-53，115-116，160-161 這3 個雙差異位點（圖1），對于活性影響有較大的可能[16-17]，因此，利用PCR 介導的受體定點突變技術，實現(xiàn)一次性將相鄰2 個位點同時突變，構建了3 種雙點突變體。將野生型和突變型亞基的DNA 通過體外轉錄的方式得到cRNA，注射入非洲爪蟾卵母細胞內，誘導表達后用雙電極電壓鉗系統(tǒng)檢測野生型和突變型nAChRs 的表達情況。通過比較野生型和突變型受體對激動劑乙酰膽堿（acetylcholine,ACh）的反應電流值，發(fā)現(xiàn)α6/α3β4[S52N，I53V] nAChR 在相同濃度ACh 刺激下的電流值更大，受體通道的開放程度更高。本研究旨在通過受體結構與功能的研究，找到影響受體敏感度的氨基酸位點，并構建突變體模型，為后續(xù)配體與該受體相互作用分子機制的研究打下基礎。

圖1 大鼠、人類β4 亞基胞外配體結合域序列對比紅色方框表示突變位點。Fig.1 Sequence comparison of ligand binding domain of rat and human β4 subunitsThe mutation sites are marked in red boxes.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）購自美國Nasco 公司，在實驗室飼養(yǎng)1 個月以上。飼養(yǎng)用水經過濾、沉淀處理，飼養(yǎng)溫度17 ℃。載有大鼠α6/α3、β4 nAChRs 亞基基因的質粒來自美國猶他大學。由于α6 亞基表達困難，故使用α6/α3 嵌合體亞基替代（α6 亞基的胞外配體結合域替換α3 亞基的對應區(qū)域產生的嵌合體，其胞外結合域的結構和功能與α6 亞基相同，且對配體的結合活性研究無影響）[18-19]，利用該嵌合體構建的α6/α3β4 nAChR 能正常表達。

質粒提取試劑盒（FastPure Plasmid Mini Kit）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 純化試劑盒(MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0)、DL 15000 Marker、限制性內切酶NheI、DpnI、Q5 超保真聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 體外轉錄試劑盒（mMESSAGE-mMACHINE?T7 Transcription Kit)、RNA 純化試劑盒（MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；DNA marker Ⅳ購自天根生化科技（北京）有限公司；HEPES 購自生工生物工程（上海）有限公司；乙酰膽堿（acetylcholine，ACh)、阿托品（Atropine)、膠原蛋白酶 (Collagenase) 均購自美國 Sigma-Aldrich 公司；其他生化試劑均為國產分析純。OR2 溶液(NaCl、KCl、MgCl2和 HEPES 分別為82.5、2.0、l.0、5 mmol·L-1，pH7.5)；ND-96 溶液（NaCl、KC1、MgCl2、CaCl2和 HEPES 分別為96、2.0、1.0、1.8、5 mmol·L-1，pH7.5)。引物的合成和基因序列的測定由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 儀器超微量分光光度計（Nanodrop 2000，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；PCR 儀（Mastercycler X50s，德國Eppendorf)；小型水平電泳儀（美國 Bio-Rad)；Alpha-2200 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國 Protein-Simple)；Drummond 微量注射器（Drummond Scientific，Broomall，PA）；KCL-2000A 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（日本EYELA)；雙電極電壓鉗放大器AxoClamp 900A，數模轉換器Axon Digidata1550B(美國 Molecular Devices)。

1.3 突變體引物設計對比大鼠與人類β4 亞基的胞外配體結合域序列，確定3 處雙突變位點（圖1 中紅色方框圈出的位置）。利用PCR 介導的受體定點誘變方法，分別將這3 處位點的氨基酸編碼序列由大鼠β4 亞基替換為人類β4 亞基。

使用Primer Premier 5.0 軟件完成突變位點引物的設計，使正反向引物都攜帶有突變位點且位于中部，引物長度在25～45 bp 之間，保證GC 含量大于40%，Tm 值大于70 ℃（表1）。

表1 大鼠β4 亞基突變引物序列Tab.1 Primer sequence of β4 subunit mutation

1.4 PCR 介導的定點突變將載有大鼠β4 亞基DNA 序列的質粒作為模板，與誘導突變引物和Q5 超保真聚合酶體系按比例混合，采用PCR 方法進行定點誘變（圖2）。PCR 條件如下：50 μL 體系，95 ℃預變性120 s；隨后95 ℃變性20 s，60 ℃退火10 s，68 ℃延伸階段3 min，共循環(huán)18 次；最后68 ℃延伸5 min。PCR 反應完成后，在水浴條件下，在PCR 產物中加入1 μLDpnI，37 ℃反應1 h，水解質粒模板。取少量PCR 擴增產物在1.0 %瓊脂糖凝膠中90 V 電壓下電泳20 min，觀察電泳結果，驗證PCR 反應成功。取PCR 產物3 μL 轉化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞，將菌液涂布于含有氨芐青霉素的固體平板培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)14～18 h。每個平板分別挑取5 個菌落，轉入含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)12～14 h，提質粒后用Nanodrop 測定其濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳（條件同上）判斷其純度，測序驗證插入序列突變情況。

圖2 定點突變原理圖Fig.2 Strategy for site-directed mutagenesis

1.5 突變體質粒酶切及回收選取測序正確的突變體質粒進行酶切線性化反應。200 μL 酶切反應體系如下：突變體質粒20 μg（40～60 μL），限制性內切酶NheⅠ 10 μL，10×M Buffer 20 μL，剩余體積用ddH2O補齊，37 ℃反應4 h。酶切后使用DNA 純化試劑盒回收線性化產物?；厥盏木€性質粒使用Nanodrop 測定其濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷其純度。

1.6 突變體RNA 的制備將線性突變體質粒作為模版，使用試劑盒法進行體外轉錄。20 μL 反應體系如下：線性模版2 μg（5～6 μL）；2×NTP/CAP 10 μL；10×Rxn Buffer 2 μL；Enzyme Mix 2 μL；剩余體積用無RNA 酶的ddH2O 補齊，37 ℃反應 4～6 h。隨后在反應液中加入1 μL Dnase，反應30 min，酶解DNA 模版。使用RNA 純化試劑盒回收cRNA 產物，Nanodrop 測定其濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.7 受體在非洲爪蟾卵母細胞上表達選取狀態(tài)良好的成熟雌性非洲爪蟾，冰凍麻醉1 h，用手術刀在腹側剖開小口，取出卵母細胞團塊。剪碎團塊，使用OR2 溶液清洗至澄清。將卵母細胞轉移至含有0.5 g·L-1膠原蛋白酶的OR2 溶液中酶解，室溫下反應40～50 min，使其完全分離成為互不粘連的單個細胞，再用OR2 溶液清洗至少10 次后，挑選形態(tài)正常飽滿的卵母細胞轉入含抗ND-96 溶液中，在17 ℃、濕度35%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

卵母細胞在獲取24 h 后用于顯微注射，實驗方法參考熊洋等[20]對α6/α3β4 表達研究的優(yōu)化結果，將野生型或突變型α6/α3 與β4 nAChRs 亞基的cRNA 以1∶1 的比例混合，每個亞基的終濃度≥500 ng·μL-1。將混合后的RNA 以每個59.8 nL 的體積顯微注射入非洲爪蟾卵母細胞，在17 ℃、濕度35%條件下繼續(xù)培養(yǎng)（圖3）。

圖3 雌性非洲爪蟾及其卵母細胞A：雌性非洲爪蟾；B：手術取出新鮮卵母細胞團塊；C：酶解后的卵母細胞。Fig.3 Female Xenopus laevis and oocytesA:Female Xenopus laevis;B:Fresh oocyte masses;C:Oocytes after enzymolysis.

1.8 受體功能檢測顯微注射后2～5 d 使用雙電極電壓鉗檢測卵母細胞上受體的表達情況。設置鉗制電壓為-70 mV，灌流速度2～4 mL·min-1，記錄ACh 刺激細胞產生內向電流的情況。詳細過程如下：每個循環(huán)總時長60 s，首先給予2 s Ach 脈沖刺激，隨后使用含有0.1 g·L-1BSA 的ND-96 緩沖液灌流沖洗，每個記錄程序含3 次循環(huán)。數據記錄軟件為pClamp 11.0.3，采樣模式為Episodic stimulation，采樣頻率為Slow 200 Hz。

1.9 數據統(tǒng)計分析使用不同濃度的ACh 作為激動劑（1、10、50、100、250、500 μmol·L-1和1 mmol·L-1）刺激受體通道開放，檢測并記錄產生的內向電流值。以1 mmol·L-1ACh 刺激產生的內向電流作為基準，計算其他濃度的ACh（1～500 μmol·L-1）刺激通道開放的反應率。每組實驗數據至少在不同卵母細胞上重復3～6 次。所得數據導入GraphPad Prism 6.0 軟件使用非線性擬合方程：Response%=100/{1+(EC50/[agonist])nH}。式中Response 代表反應率，agonist 代表激動劑的內向電流值，nH 代表Hill 系數，分析擬合并作圖。

2 結果與分析

2.1 PCR 誘導的定點突變瓊脂糖電泳結果瓊脂糖凝膠電泳結果表明，經PCR 后，3 種突變體基因均有條帶產生（圖4-A 膠孔3、4、5），與線性質粒模板（圖4-A 膠孔2）的位置一致，可以將PCR 產物用于轉化實驗。

圖4 定點突變PCR 產物、突變體亞基質粒酶切及轉錄后cRNA 檢測的瓊脂糖電泳A.1：野生型rat β4 質粒；2：線性rat β4 質粒；3～5：突變體β4 [S52N,I53V]、β4 [I115V,Q116L]、β4 [K160M,S161T];B.1、3、5、7：突變體β4[S52N,I53V]、[I115V,Q116L]、[K160M,S161T]、野生型β4 亞基質粒；2、4、6:突變體β4 [S52N,I53V]、[I115V,Q116L]、[K160M,S161T]線性質粒；C:1～3：突變體β4 [S52N,I53V]、β4 [I115V,Q116L、β4 [K160M,S161T] cRNA；M1:DL15 000 DNA marker；M:DNA marker IV。Fig.4 Agarose electrophoresis of PCR site-directed mutation products,linear mutant plasmid after digestion and cRNAA.1:Wild-type rat β4 plasmid;2:Linear rat β4 plasmid;3-5:β4 subunit mutant after PCR site-directed mutation [S52N,I53V ],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];B.1,3,5,7:Plasmids of β4 subunit mutants [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T] and wild-type subunit;2,4,6 :Linear plasmids of β4 subunit mutant [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];C:1-3:cRNA of β4 subunit mutant [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];M1:DL15 000 DNA marker;M:DNA marker IV.

2.2 質粒提取與酶切結果使用質粒提取試劑盒提取突變質粒，所得結果經超微量分光光度計測得濃度（表2）。瓊脂糖凝膠電泳結果驗證質粒純度良好。插入基因測序結果使用NCBI 網站中的BLAST 在線序列比對驗證，證實3 個突變體質粒均構建成功。將測序正確的β4 突變體質粒與本體質粒分別進行酶切反應，瓊脂糖凝膠電泳驗證。環(huán)狀質粒（圖4-B 膠孔1、3、5、7）因呈超螺旋結構，在瓊脂糖凝膠中空間位阻小，所以移動更快。而線性化的質粒（圖4-B 膠孔2、4、6）移動較慢。電泳結果中線性化質粒對應泳道在環(huán)狀質粒對應位置已無條帶，證明酶切完全。經超微量分光光度計測得濃度與A260/280值（表2），均在正常范圍內，可進行后續(xù)實驗。

表2 突變體質粒、線性質粒濃度與A260/280 值Tab.2 Mutant plasmid and linear plasmid concentration and A260/280

2.3 cRNA 的制備測定體外轉錄獲得的cRNA 濃度（表3），均達到500 mg·μL-1。瓊脂糖凝膠結果顯示，圖4-C 中膠孔1、2、3 相同高度均有對應的較為清晰明亮的條帶，證明體外轉錄成功，可用于下一步卵母細胞顯微注射。

表3 突變體cRNA 濃度與A260/280 值Tab.3 Mutant cRNA concentration and A260/280

2.4 野生型及突變型α6β4* nAChR 的功能檢測使用雙電極電壓鉗對野生型和3 種突變型受體的功能進行檢測。α6/α3β4[S52N,I53V]突變型的受體與其他幾種相比，表達時間略有提前，在注射后的第3 天即達到正常水平。另外2 種突變型與野生型的受體表達時間無明顯的差異，均在第4 天達到正常水平。結果表明，ACh 濃度為1 μmol·L-1時均無電流產生，未達到產生內向電流的最小刺激強度。隨著ACh 濃度的增大，受體接受ACh 刺激產生的電流值也隨之增大，呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢。對比圖5 中A、B、C、D 的電流軌跡圖，突變受體與野生型對ACh 的敏感程度相當，可以初步判斷，突變并未影響受體的基本結構及功能。當給予相同濃度ACh刺激時，突變型α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 相比于野生型和其他的突變型，電流值明顯更大，推測是α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 離子通道的開放水平更高。

圖5 野生型和突變型α6/α3β4 nAChR 對不同濃度ACh 的電流圖Fig.5 Current traces of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR evoked by different concentrations of ACh

使用Graphpad Prism 6.0 軟件對測定結果進行分析，繪制濃度-反應率曲線圖，并計算受體對ACh 刺激的EC50。對比圖6 中A、B、C 圖中的曲線，結果表明，野生型與突變型受體的變化趨勢相似。野生型α6/α3β4 nAChR 的EC50是突變型α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 的2 倍（表4），證明52、53 位雙點突變，對ACh 的激動活性有一定的提升，使α6/α3β4 nAChR 與ACh 結合后離子通道的開放程度增加。

表4 野生型及突變型α6/α3β4 nAChRs 對ACh 門控的半數有效濃度Tab.4 Median effective concentration (EC50) of wild type and mutant α6/α3β4 nAChRs for ACh stimulation

圖6 野生型及突變型α6/α3β4 nAChR 對激動劑ACh 的濃度-反應曲線Mean±SEM，n=3～6。Fig.6 Concentration response curve of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR to the agonist ACh Mean ± SEM,n=3～6.

3 討論

α6β4*作為一類特殊的nAChRs 受到廣泛關注，但含α6 亞基nAChRs 的異源表達卻十分困難。煙堿型乙酰膽堿受體與配體結合的主要結構位于細胞膜外的N-端結合域，通過基因改造，構建α6/α3 的嵌合體可以輔助受體正常表達，不影響受體的功能活性。

本研究比較了人類和大鼠的α6 和β4 兩種亞基的胞外N-端結合域的序列，發(fā)現(xiàn)人類和大鼠α6 亞基的同源性較高，而β4 亞基的種屬差異性更大。芋螺毒素是一類作用于nAChRs 的小分子多肽，可以作為分子探針，研究配體與受體結合的關鍵位點。HONE 等進行了人類（Human）和大鼠（Rat）α6/α3 和β4 亞基的混合表達實驗，構建了Hα6/α3Hβ4、Rα6/α3Rβ4、Hα6/α3Rβ4 和Rα6/α3Hβ4 這4 種受體，并選取3 種作用于α6/α3β4 nAChR 的芋螺毒素PeIA、PnIA 和TxIB 作為拮抗劑，分別比較配體對突變受體的阻斷作用。結果顯示，這3 種芋螺毒素對受體的阻斷作用具有一致性，由強到弱依次為Hα6/α3Hβ4>Rα6/α3Hβ4>Hα6/α3Rβ4>Rα6/α3Rβ4。該實驗從一定程度上說明β4 亞基對α6/α3β4 nAChR 的配體識別和選擇具有重要作用[21]。

本實驗利用受體定點突變技術對大鼠β4 亞基非保守殘基進行受體突變，將其替換人類β4 亞基相同位置處的殘基，對比序列發(fā)現(xiàn)有3 處位點均為相鄰2 個殘基的差異。將2 個差異位點均設計在突變引物內，經一次突變即得到具有相鄰2 個殘基差異的突變受體，大大縮短了突變體構建的時間，并且為后續(xù)大鼠和人類α6/α3β4 nAChR 對芋螺毒素活性差異關鍵位點的篩選，構建了3 個雙點突變體模型。

在對突變體進行電生理活性檢測中，電流值的大小和變化趨勢與野生型受體均相似，表明受體基本的結構和功能保持不變。而觀察ACh 濃度-反應率曲線圖，其中1 種突變體α6/α3β4[S52N,I53V]相比于野生型，對ACh 敏感性更高，EC50值僅為本體的一半。并且在標準濃度(100 μmol·L-1)ACh 下，突變體α6/α3β4[S52N,I53V]產生的激發(fā)電流值更大。推測可能是由于52 位由絲氨酸變?yōu)樘於０泛蟾仔纬蓺滏I，而53 位由異亮氨酸到纈氨酸的改變，導致其空間位阻減小，使得在與ACh 結合時，通道的敏感性增加，且開放程度增大。由于在β4 亞基上人類和大鼠還存在其他差異位點，因此，α6/α3β4 nAChR對于激動劑ACh 和拮抗劑芋螺毒素活性的關鍵氨基酸位點還有待研究。