李旭揚(yáng),陳舒苗,于津鵬,羅素蘭,長孫東亭
(1.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/??谑泻Q笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)與藥學(xué)院,海口 570228;2.廣西大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,南寧 530004)
煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)屬于配體門控離子通道,由5 個(gè)獨(dú)立的亞基組裝而成。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有16 種不同的亞基用于nAChRs 的構(gòu)成,分別為α1—α7、α9、α10、β1—β4、δ、ε、γ;鳥類及家禽類動(dòng)物還含有α8 亞基[1]。nAChRs 能夠傳遞ACh 刺激產(chǎn)生的信號,由于分布廣泛,它可介導(dǎo)腦部及其外周的多種生理作用[2-3],并且這些受體結(jié)構(gòu)在許多物種中高度保守,可通過異源表達(dá)進(jìn)行相關(guān)研究[4]。雖然nAChRs是研究前景很好的治療靶點(diǎn),但由于一些亞型表達(dá)困難,相應(yīng)藥物和基礎(chǔ)科學(xué)的研究進(jìn)展緩慢,尤其是含有α6 亞基的受體,它們在任何重組表達(dá)系統(tǒng)中都很難正常表達(dá)、形成功能通道[5-6]。這也間接導(dǎo)致α6β4* nAChRs(α6β4 或包含其他亞基形成的亞型)在分子水平上與配體相互作用的研究尚不多見。過去有學(xué)者認(rèn)為含α6 亞基的nAChRs 主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兒茶酚胺能神經(jīng)元中,隨著研究深入,研究者們發(fā)現(xiàn)α6β4* nAChRs 具有可調(diào)節(jié)人和猴腎上腺嗜鉻細(xì)胞的胞吐[7-8]、控制小鼠海馬去甲腎上腺素的釋放等作用[9-10]。目前,α6β4* nAChR 被認(rèn)為是一種治療神經(jīng)病理性疼痛的新靶點(diǎn),且可用于抑制成癮。已經(jīng)確定α6β4*亞型的受體在大鼠、小鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)中有表達(dá)。WIESKOPF 等在小鼠上使用表達(dá)基因組學(xué)鑒定出機(jī)械性異常性疼痛與DRG中α6*受體的表達(dá)水平有關(guān)。通過基因編輯,構(gòu)建α6*受體功能獲得和缺失的突變體,發(fā)現(xiàn)基因敲除的小鼠機(jī)械性異常性疼痛水平增加,同時(shí)與神經(jīng)性、炎性損傷相關(guān)的表現(xiàn)與野生型的受體完全不同,推測是由于在DRG 傷害感受器中α6* nAChRs與P2X2/3 受體的共表達(dá)產(chǎn)生相互作用,抑制疼痛信號的傳導(dǎo),發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[11-14]。DONVITO 等[15]的研究證實(shí),α6β4* nAChRs 具有調(diào)節(jié)THC(Δ9-tetrahydrocannabinol,Δ9-四氫大麻酚)成癮后戒斷的效果,可作為靶點(diǎn)用于THC 戒斷藥物的開發(fā)。以上研究結(jié)果為α6β4*nAChRs 的藥理學(xué)研究提供了重要思路,且有助于研究神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)理。
β4 亞基在α6β4* nAChRs 的功能研究中顯示出重要的作用,能夠直接影響與配體藥物、激動(dòng)劑的結(jié)合活性。通過對比人類和大鼠β4 亞基胞外配體結(jié)合區(qū)序列差異,筆者恰好在形成配體結(jié)合口袋的Loop D(54-59)、Loop E(102-118)、Loop F(160-167)附近分別發(fā)現(xiàn)52-53,115-116,160-161 這3 個(gè)雙差異位點(diǎn)(圖1),對于活性影響有較大的可能[16-17],因此,利用PCR 介導(dǎo)的受體定點(diǎn)突變技術(shù),實(shí)現(xiàn)一次性將相鄰2 個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變,構(gòu)建了3 種雙點(diǎn)突變體。將野生型和突變型亞基的DNA 通過體外轉(zhuǎn)錄的方式得到cRNA,注射入非洲爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi),誘導(dǎo)表達(dá)后用雙電極電壓鉗系統(tǒng)檢測野生型和突變型nAChRs 的表達(dá)情況。通過比較野生型和突變型受體對激動(dòng)劑乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)的反應(yīng)電流值,發(fā)現(xiàn)α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 在相同濃度ACh 刺激下的電流值更大,受體通道的開放程度更高。本研究旨在通過受體結(jié)構(gòu)與功能的研究,找到影響受體敏感度的氨基酸位點(diǎn),并構(gòu)建突變體模型,為后續(xù)配體與該受體相互作用分子機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。
圖1 大鼠、人類β4 亞基胞外配體結(jié)合域序列對比紅色方框表示突變位點(diǎn)。Fig.1 Sequence comparison of ligand binding domain of rat and human β4 subunitsThe mutation sites are marked in red boxes.
1.1 材料與試劑雌性非洲爪蟾(Xenopus laevis)購自美國Nasco 公司,在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1 個(gè)月以上。飼養(yǎng)用水經(jīng)過濾、沉淀處理,飼養(yǎng)溫度17 ℃。載有大鼠α6/α3、β4 nAChRs 亞基基因的質(zhì)粒來自美國猶他大學(xué)。由于α6 亞基表達(dá)困難,故使用α6/α3 嵌合體亞基替代(α6 亞基的胞外配體結(jié)合域替換α3 亞基的對應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生的嵌合體,其胞外結(jié)合域的結(jié)構(gòu)和功能與α6 亞基相同,且對配體的結(jié)合活性研究無影響)[18-19],利用該嵌合體構(gòu)建的α6/α3β4 nAChR 能正常表達(dá)。
質(zhì)粒提取試劑盒(FastPure Plasmid Mini Kit)購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA 純化試劑盒(MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0)、DL 15000 Marker、限制性內(nèi)切酶NheI、DpnI、Q5 超保真聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(mMESSAGE-mMACHINE?T7 Transcription Kit)、RNA 純化試劑盒(MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit)購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;DNA marker Ⅳ購自天根生化科技(北京)有限公司;HEPES 購自生工生物工程(上海)有限公司;乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)、阿托品(Atropine)、膠原蛋白酶 (Collagenase) 均購自美國 Sigma-Aldrich 公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。OR2 溶液(NaCl、KCl、MgCl2和 HEPES 分別為82.5、2.0、l.0、5 mmol·L-1,pH7.5);ND-96 溶液(NaCl、KC1、MgCl2、CaCl2和 HEPES 分別為96、2.0、1.0、1.8、5 mmol·L-1,pH7.5)。引物的合成和基因序列的測定由生工生物工程(上海)有限公司完成。
1.2 儀器超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000,美國Thermo Fisher Scientific 公司);PCR 儀(Mastercycler X50s,德國Eppendorf);小型水平電泳儀(美國 Bio-Rad);Alpha-2200 凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 Protein-Simple);Drummond 微量注射器(Drummond Scientific,Broomall,PA);KCL-2000A 恒溫恒濕培養(yǎng)箱(日本EYELA);雙電極電壓鉗放大器AxoClamp 900A,數(shù)模轉(zhuǎn)換器Axon Digidata1550B(美國 Molecular Devices)。
1.3 突變體引物設(shè)計(jì)對比大鼠與人類β4 亞基的胞外配體結(jié)合域序列,確定3 處雙突變位點(diǎn)(圖1 中紅色方框圈出的位置)。利用PCR 介導(dǎo)的受體定點(diǎn)誘變方法,分別將這3 處位點(diǎn)的氨基酸編碼序列由大鼠β4 亞基替換為人類β4 亞基。
使用Primer Premier 5.0 軟件完成突變位點(diǎn)引物的設(shè)計(jì),使正反向引物都攜帶有突變位點(diǎn)且位于中部,引物長度在25~45 bp 之間,保證GC 含量大于40%,Tm 值大于70 ℃(表1)。
表1 大鼠β4 亞基突變引物序列Tab.1 Primer sequence of β4 subunit mutation
1.4 PCR 介導(dǎo)的定點(diǎn)突變將載有大鼠β4 亞基DNA 序列的質(zhì)粒作為模板,與誘導(dǎo)突變引物和Q5 超保真聚合酶體系按比例混合,采用PCR 方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變(圖2)。PCR 條件如下:50 μL 體系,95 ℃預(yù)變性120 s;隨后95 ℃變性20 s,60 ℃退火10 s,68 ℃延伸階段3 min,共循環(huán)18 次;最后68 ℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)完成后,在水浴條件下,在PCR 產(chǎn)物中加入1 μLDpnI,37 ℃反應(yīng)1 h,水解質(zhì)粒模板。取少量PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0 %瓊脂糖凝膠中90 V 電壓下電泳20 min,觀察電泳結(jié)果,驗(yàn)證PCR 反應(yīng)成功。取PCR 產(chǎn)物3 μL 轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,將菌液涂布于含有氨芐青霉素的固體平板培養(yǎng)基上,37 ℃下培養(yǎng)14~18 h。每個(gè)平板分別挑取5 個(gè)菌落,轉(zhuǎn)入含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)12~14 h,提質(zhì)粒后用Nanodrop 測定其濃度,并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳(條件同上)判斷其純度,測序驗(yàn)證插入序列突變情況。
圖2 定點(diǎn)突變原理圖Fig.2 Strategy for site-directed mutagenesis
1.5 突變體質(zhì)粒酶切及回收選取測序正確的突變體質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化反應(yīng)。200 μL 酶切反應(yīng)體系如下:突變體質(zhì)粒20 μg(40~60 μL),限制性內(nèi)切酶NheⅠ 10 μL,10×M Buffer 20 μL,剩余體積用ddH2O補(bǔ)齊,37 ℃反應(yīng)4 h。酶切后使用DNA 純化試劑盒回收線性化產(chǎn)物?;厥盏木€性質(zhì)粒使用Nanodrop 測定其濃度,并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷其純度。
1.6 突變體RNA 的制備將線性突變體質(zhì)粒作為模版,使用試劑盒法進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。20 μL 反應(yīng)體系如下:線性模版2 μg(5~6 μL);2×NTP/CAP 10 μL;10×Rxn Buffer 2 μL;Enzyme Mix 2 μL;剩余體積用無RNA 酶的ddH2O 補(bǔ)齊,37 ℃反應(yīng) 4~6 h。隨后在反應(yīng)液中加入1 μL Dnase,反應(yīng)30 min,酶解DNA 模版。使用RNA 純化試劑盒回收cRNA 產(chǎn)物,Nanodrop 測定其濃度,并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
1.7 受體在非洲爪蟾卵母細(xì)胞上表達(dá)選取狀態(tài)良好的成熟雌性非洲爪蟾,冰凍麻醉1 h,用手術(shù)刀在腹側(cè)剖開小口,取出卵母細(xì)胞團(tuán)塊。剪碎團(tuán)塊,使用OR2 溶液清洗至澄清。將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有0.5 g·L-1膠原蛋白酶的OR2 溶液中酶解,室溫下反應(yīng)40~50 min,使其完全分離成為互不粘連的單個(gè)細(xì)胞,再用OR2 溶液清洗至少10 次后,挑選形態(tài)正常飽滿的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入含抗ND-96 溶液中,在17 ℃、濕度35%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
卵母細(xì)胞在獲取24 h 后用于顯微注射,實(shí)驗(yàn)方法參考熊洋等[20]對α6/α3β4 表達(dá)研究的優(yōu)化結(jié)果,將野生型或突變型α6/α3 與β4 nAChRs 亞基的cRNA 以1∶1 的比例混合,每個(gè)亞基的終濃度≥500 ng·μL-1。將混合后的RNA 以每個(gè)59.8 nL 的體積顯微注射入非洲爪蟾卵母細(xì)胞,在17 ℃、濕度35%條件下繼續(xù)培養(yǎng)(圖3)。
圖3 雌性非洲爪蟾及其卵母細(xì)胞A:雌性非洲爪蟾;B:手術(shù)取出新鮮卵母細(xì)胞團(tuán)塊;C:酶解后的卵母細(xì)胞。Fig.3 Female Xenopus laevis and oocytesA:Female Xenopus laevis;B:Fresh oocyte masses;C:Oocytes after enzymolysis.
1.8 受體功能檢測顯微注射后2~5 d 使用雙電極電壓鉗檢測卵母細(xì)胞上受體的表達(dá)情況。設(shè)置鉗制電壓為-70 mV,灌流速度2~4 mL·min-1,記錄ACh 刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)向電流的情況。詳細(xì)過程如下:每個(gè)循環(huán)總時(shí)長60 s,首先給予2 s Ach 脈沖刺激,隨后使用含有0.1 g·L-1BSA 的ND-96 緩沖液灌流沖洗,每個(gè)記錄程序含3 次循環(huán)。數(shù)據(jù)記錄軟件為pClamp 11.0.3,采樣模式為Episodic stimulation,采樣頻率為Slow 200 Hz。
1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用不同濃度的ACh 作為激動(dòng)劑(1、10、50、100、250、500 μmol·L-1和1 mmol·L-1)刺激受體通道開放,檢測并記錄產(chǎn)生的內(nèi)向電流值。以1 mmol·L-1ACh 刺激產(chǎn)生的內(nèi)向電流作為基準(zhǔn),計(jì)算其他濃度的ACh(1~500 μmol·L-1)刺激通道開放的反應(yīng)率。每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少在不同卵母細(xì)胞上重復(fù)3~6 次。所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 6.0 軟件使用非線性擬合方程:Response%=100/{1+(EC50/[agonist])nH}。式中Response 代表反應(yīng)率,agonist 代表激動(dòng)劑的內(nèi)向電流值,nH 代表Hill 系數(shù),分析擬合并作圖。
2.1 PCR 誘導(dǎo)的定點(diǎn)突變瓊脂糖電泳結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,經(jīng)PCR 后,3 種突變體基因均有條帶產(chǎn)生(圖4-A 膠孔3、4、5),與線性質(zhì)粒模板(圖4-A 膠孔2)的位置一致,可以將PCR 產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
圖4 定點(diǎn)突變PCR 產(chǎn)物、突變體亞基質(zhì)粒酶切及轉(zhuǎn)錄后cRNA 檢測的瓊脂糖電泳A.1:野生型rat β4 質(zhì)粒;2:線性rat β4 質(zhì)粒;3~5:突變體β4 [S52N,I53V]、β4 [I115V,Q116L]、β4 [K160M,S161T];B.1、3、5、7:突變體β4[S52N,I53V]、[I115V,Q116L]、[K160M,S161T]、野生型β4 亞基質(zhì)粒;2、4、6:突變體β4 [S52N,I53V]、[I115V,Q116L]、[K160M,S161T]線性質(zhì)粒;C:1~3:突變體β4 [S52N,I53V]、β4 [I115V,Q116L、β4 [K160M,S161T] cRNA;M1:DL15 000 DNA marker;M:DNA marker IV。Fig.4 Agarose electrophoresis of PCR site-directed mutation products,linear mutant plasmid after digestion and cRNAA.1:Wild-type rat β4 plasmid;2:Linear rat β4 plasmid;3-5:β4 subunit mutant after PCR site-directed mutation [S52N,I53V ],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];B.1,3,5,7:Plasmids of β4 subunit mutants [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T] and wild-type subunit;2,4,6 :Linear plasmids of β4 subunit mutant [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];C:1-3:cRNA of β4 subunit mutant [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];M1:DL15 000 DNA marker;M:DNA marker IV.
2.2 質(zhì)粒提取與酶切結(jié)果使用質(zhì)粒提取試劑盒提取突變質(zhì)粒,所得結(jié)果經(jīng)超微量分光光度計(jì)測得濃度(表2)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果驗(yàn)證質(zhì)粒純度良好。插入基因測序結(jié)果使用NCBI 網(wǎng)站中的BLAST 在線序列比對驗(yàn)證,證實(shí)3 個(gè)突變體質(zhì)粒均構(gòu)建成功。將測序正確的β4 突變體質(zhì)粒與本體質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切反應(yīng),瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。環(huán)狀質(zhì)粒(圖4-B 膠孔1、3、5、7)因呈超螺旋結(jié)構(gòu),在瓊脂糖凝膠中空間位阻小,所以移動(dòng)更快。而線性化的質(zhì)粒(圖4-B 膠孔2、4、6)移動(dòng)較慢。電泳結(jié)果中線性化質(zhì)粒對應(yīng)泳道在環(huán)狀質(zhì)粒對應(yīng)位置已無條帶,證明酶切完全。經(jīng)超微量分光光度計(jì)測得濃度與A260/280值(表2),均在正常范圍內(nèi),可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
表2 突變體質(zhì)粒、線性質(zhì)粒濃度與A260/280 值Tab.2 Mutant plasmid and linear plasmid concentration and A260/280
2.3 cRNA 的制備測定體外轉(zhuǎn)錄獲得的cRNA 濃度(表3),均達(dá)到500 mg·μL-1。瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示,圖4-C 中膠孔1、2、3 相同高度均有對應(yīng)的較為清晰明亮的條帶,證明體外轉(zhuǎn)錄成功,可用于下一步卵母細(xì)胞顯微注射。
表3 突變體cRNA 濃度與A260/280 值Tab.3 Mutant cRNA concentration and A260/280
2.4 野生型及突變型α6β4* nAChR 的功能檢測使用雙電極電壓鉗對野生型和3 種突變型受體的功能進(jìn)行檢測。α6/α3β4[S52N,I53V]突變型的受體與其他幾種相比,表達(dá)時(shí)間略有提前,在注射后的第3 天即達(dá)到正常水平。另外2 種突變型與野生型的受體表達(dá)時(shí)間無明顯的差異,均在第4 天達(dá)到正常水平。結(jié)果表明,ACh 濃度為1 μmol·L-1時(shí)均無電流產(chǎn)生,未達(dá)到產(chǎn)生內(nèi)向電流的最小刺激強(qiáng)度。隨著ACh 濃度的增大,受體接受ACh 刺激產(chǎn)生的電流值也隨之增大,呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢。對比圖5 中A、B、C、D 的電流軌跡圖,突變受體與野生型對ACh 的敏感程度相當(dāng),可以初步判斷,突變并未影響受體的基本結(jié)構(gòu)及功能。當(dāng)給予相同濃度ACh刺激時(shí),突變型α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 相比于野生型和其他的突變型,電流值明顯更大,推測是α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 離子通道的開放水平更高。
圖5 野生型和突變型α6/α3β4 nAChR 對不同濃度ACh 的電流圖Fig.5 Current traces of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR evoked by different concentrations of ACh
使用Graphpad Prism 6.0 軟件對測定結(jié)果進(jìn)行分析,繪制濃度-反應(yīng)率曲線圖,并計(jì)算受體對ACh 刺激的EC50。對比圖6 中A、B、C 圖中的曲線,結(jié)果表明,野生型與突變型受體的變化趨勢相似。野生型α6/α3β4 nAChR 的EC50是突變型α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 的2 倍(表4),證明52、53 位雙點(diǎn)突變,對ACh 的激動(dòng)活性有一定的提升,使α6/α3β4 nAChR 與ACh 結(jié)合后離子通道的開放程度增加。
表4 野生型及突變型α6/α3β4 nAChRs 對ACh 門控的半數(shù)有效濃度Tab.4 Median effective concentration (EC50) of wild type and mutant α6/α3β4 nAChRs for ACh stimulation
圖6 野生型及突變型α6/α3β4 nAChR 對激動(dòng)劑ACh 的濃度-反應(yīng)曲線Mean±SEM,n=3~6。Fig.6 Concentration response curve of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR to the agonist ACh Mean ± SEM,n=3~6.
α6β4*作為一類特殊的nAChRs 受到廣泛關(guān)注,但含α6 亞基nAChRs 的異源表達(dá)卻十分困難。煙堿型乙酰膽堿受體與配體結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)位于細(xì)胞膜外的N-端結(jié)合域,通過基因改造,構(gòu)建α6/α3 的嵌合體可以輔助受體正常表達(dá),不影響受體的功能活性。
本研究比較了人類和大鼠的α6 和β4 兩種亞基的胞外N-端結(jié)合域的序列,發(fā)現(xiàn)人類和大鼠α6 亞基的同源性較高,而β4 亞基的種屬差異性更大。芋螺毒素是一類作用于nAChRs 的小分子多肽,可以作為分子探針,研究配體與受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。HONE 等進(jìn)行了人類(Human)和大鼠(Rat)α6/α3 和β4 亞基的混合表達(dá)實(shí)驗(yàn),構(gòu)建了Hα6/α3Hβ4、Rα6/α3Rβ4、Hα6/α3Rβ4 和Rα6/α3Hβ4 這4 種受體,并選取3 種作用于α6/α3β4 nAChR 的芋螺毒素PeIA、PnIA 和TxIB 作為拮抗劑,分別比較配體對突變受體的阻斷作用。結(jié)果顯示,這3 種芋螺毒素對受體的阻斷作用具有一致性,由強(qiáng)到弱依次為Hα6/α3Hβ4>Rα6/α3Hβ4>Hα6/α3Rβ4>Rα6/α3Rβ4。該實(shí)驗(yàn)從一定程度上說明β4 亞基對α6/α3β4 nAChR 的配體識別和選擇具有重要作用[21]。
本實(shí)驗(yàn)利用受體定點(diǎn)突變技術(shù)對大鼠β4 亞基非保守殘基進(jìn)行受體突變,將其替換人類β4 亞基相同位置處的殘基,對比序列發(fā)現(xiàn)有3 處位點(diǎn)均為相鄰2 個(gè)殘基的差異。將2 個(gè)差異位點(diǎn)均設(shè)計(jì)在突變引物內(nèi),經(jīng)一次突變即得到具有相鄰2 個(gè)殘基差異的突變受體,大大縮短了突變體構(gòu)建的時(shí)間,并且為后續(xù)大鼠和人類α6/α3β4 nAChR 對芋螺毒素活性差異關(guān)鍵位點(diǎn)的篩選,構(gòu)建了3 個(gè)雙點(diǎn)突變體模型。
在對突變體進(jìn)行電生理活性檢測中,電流值的大小和變化趨勢與野生型受體均相似,表明受體基本的結(jié)構(gòu)和功能保持不變。而觀察ACh 濃度-反應(yīng)率曲線圖,其中1 種突變體α6/α3β4[S52N,I53V]相比于野生型,對ACh 敏感性更高,EC50值僅為本體的一半。并且在標(biāo)準(zhǔn)濃度(100 μmol·L-1)ACh 下,突變體α6/α3β4[S52N,I53V]產(chǎn)生的激發(fā)電流值更大。推測可能是由于52 位由絲氨酸變?yōu)樘於0泛蟾仔纬蓺滏I,而53 位由異亮氨酸到纈氨酸的改變,導(dǎo)致其空間位阻減小,使得在與ACh 結(jié)合時(shí),通道的敏感性增加,且開放程度增大。由于在β4 亞基上人類和大鼠還存在其他差異位點(diǎn),因此,α6/α3β4 nAChR對于激動(dòng)劑ACh 和拮抗劑芋螺毒素活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)還有待研究。