李旭揚，陳舒苗，于津鵬，羅素蘭，長孫東亭

（1.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點實驗室/海口市海洋藥物重點實驗室/生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228;2.廣西大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，南寧 530004）

煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)屬于配體門控離子通道，由5 個獨立的亞基組裝而成。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有16 種不同的亞基用于nAChRs 的構(gòu)成，分別為α1—α7、α9、α10、β1—β4、δ、ε、γ；鳥類及家禽類動物還含有α8 亞基[1]。nAChRs 能夠傳遞ACh 刺激產(chǎn)生的信號，由于分布廣泛，它可介導(dǎo)腦部及其外周的多種生理作用[2-3]，并且這些受體結(jié)構(gòu)在許多物種中高度保守，可通過異源表達進行相關(guān)研究[4]。雖然nAChRs是研究前景很好的治療靶點，但由于一些亞型表達困難，相應(yīng)藥物和基礎(chǔ)科學(xué)的研究進展緩慢，尤其是含有α6 亞基的受體，它們在任何重組表達系統(tǒng)中都很難正常表達、形成功能通道[5-6]。這也間接導(dǎo)致α6β4* nAChRs（α6β4 或包含其他亞基形成的亞型）在分子水平上與配體相互作用的研究尚不多見。過去有學(xué)者認(rèn)為含α6 亞基的nAChRs 主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兒茶酚胺能神經(jīng)元中，隨著研究深入，研究者們發(fā)現(xiàn)α6β4* nAChRs 具有可調(diào)節(jié)人和猴腎上腺嗜鉻細胞的胞吐[7-8]、控制小鼠海馬去甲腎上腺素的釋放等作用[9-10]。目前，α6β4* nAChR 被認(rèn)為是一種治療神經(jīng)病理性疼痛的新靶點，且可用于抑制成癮。已經(jīng)確定α6β4*亞型的受體在大鼠、小鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）中有表達。WIESKOPF 等在小鼠上使用表達基因組學(xué)鑒定出機械性異常性疼痛與DRG中α6*受體的表達水平有關(guān)。通過基因編輯，構(gòu)建α6*受體功能獲得和缺失的突變體，發(fā)現(xiàn)基因敲除的小鼠機械性異常性疼痛水平增加，同時與神經(jīng)性、炎性損傷相關(guān)的表現(xiàn)與野生型的受體完全不同，推測是由于在DRG 傷害感受器中α6* nAChRs與P2X2/3 受體的共表達產(chǎn)生相互作用，抑制疼痛信號的傳導(dǎo)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[11-14]。DONVITO 等[15]的研究證實，α6β4* nAChRs 具有調(diào)節(jié)THC（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-四氫大麻酚）成癮后戒斷的效果，可作為靶點用于THC 戒斷藥物的開發(fā)。以上研究結(jié)果為α6β4*nAChRs 的藥理學(xué)研究提供了重要思路，且有助于研究神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機理。

β4 亞基在α6β4* nAChRs 的功能研究中顯示出重要的作用，能夠直接影響與配體藥物、激動劑的結(jié)合活性。通過對比人類和大鼠β4 亞基胞外配體結(jié)合區(qū)序列差異，筆者恰好在形成配體結(jié)合口袋的Loop D（54-59）、Loop E（102-118）、Loop F（160-167）附近分別發(fā)現(xiàn)52-53，115-116，160-161 這3 個雙差異位點（圖1），對于活性影響有較大的可能[16-17]，因此，利用PCR 介導(dǎo)的受體定點突變技術(shù)，實現(xiàn)一次性將相鄰2 個位點同時突變，構(gòu)建了3 種雙點突變體。將野生型和突變型亞基的DNA 通過體外轉(zhuǎn)錄的方式得到cRNA，注射入非洲爪蟾卵母細胞內(nèi)，誘導(dǎo)表達后用雙電極電壓鉗系統(tǒng)檢測野生型和突變型nAChRs 的表達情況。通過比較野生型和突變型受體對激動劑乙酰膽堿（acetylcholine,ACh）的反應(yīng)電流值，發(fā)現(xiàn)α6/α3β4[S52N，I53V] nAChR 在相同濃度ACh 刺激下的電流值更大，受體通道的開放程度更高。本研究旨在通過受體結(jié)構(gòu)與功能的研究，找到影響受體敏感度的氨基酸位點，并構(gòu)建突變體模型，為后續(xù)配體與該受體相互作用分子機制的研究打下基礎(chǔ)。

圖1 大鼠、人類β4 亞基胞外配體結(jié)合域序列對比紅色方框表示突變位點。Fig.1 Sequence comparison of ligand binding domain of rat and human β4 subunitsThe mutation sites are marked in red boxes.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）購自美國Nasco 公司，在實驗室飼養(yǎng)1 個月以上。飼養(yǎng)用水經(jīng)過濾、沉淀處理，飼養(yǎng)溫度17 ℃。載有大鼠α6/α3、β4 nAChRs 亞基基因的質(zhì)粒來自美國猶他大學(xué)。由于α6 亞基表達困難，故使用α6/α3 嵌合體亞基替代（α6 亞基的胞外配體結(jié)合域替換α3 亞基的對應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生的嵌合體，其胞外結(jié)合域的結(jié)構(gòu)和功能與α6 亞基相同，且對配體的結(jié)合活性研究無影響）[18-19]，利用該嵌合體構(gòu)建的α6/α3β4 nAChR 能正常表達。

質(zhì)粒提取試劑盒（FastPure Plasmid Mini Kit）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 純化試劑盒(MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0)、DL 15000 Marker、限制性內(nèi)切酶NheI、DpnI、Q5 超保真聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（mMESSAGE-mMACHINE?T7 Transcription Kit)、RNA 純化試劑盒（MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；DNA marker Ⅳ購自天根生化科技（北京）有限公司；HEPES 購自生工生物工程（上海）有限公司；乙酰膽堿（acetylcholine，ACh)、阿托品（Atropine)、膠原蛋白酶 (Collagenase) 均購自美國 Sigma-Aldrich 公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。OR2 溶液(NaCl、KCl、MgCl2和 HEPES 分別為82.5、2.0、l.0、5 mmol·L-1，pH7.5)；ND-96 溶液（NaCl、KC1、MgCl2、CaCl2和 HEPES 分別為96、2.0、1.0、1.8、5 mmol·L-1，pH7.5)。引物的合成和基因序列的測定由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 儀器超微量分光光度計（Nanodrop 2000，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；PCR 儀（Mastercycler X50s，德國Eppendorf)；小型水平電泳儀（美國 Bio-Rad)；Alpha-2200 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國 Protein-Simple)；Drummond 微量注射器（Drummond Scientific，Broomall，PA）；KCL-2000A 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（日本EYELA)；雙電極電壓鉗放大器AxoClamp 900A，數(shù)模轉(zhuǎn)換器Axon Digidata1550B(美國 Molecular Devices)。

1.3 突變體引物設(shè)計對比大鼠與人類β4 亞基的胞外配體結(jié)合域序列，確定3 處雙突變位點（圖1 中紅色方框圈出的位置）。利用PCR 介導(dǎo)的受體定點誘變方法，分別將這3 處位點的氨基酸編碼序列由大鼠β4 亞基替換為人類β4 亞基。

使用Primer Premier 5.0 軟件完成突變位點引物的設(shè)計，使正反向引物都攜帶有突變位點且位于中部，引物長度在25～45 bp 之間，保證GC 含量大于40%，Tm 值大于70 ℃（表1）。

表1 大鼠β4 亞基突變引物序列Tab.1 Primer sequence of β4 subunit mutation

1.4 PCR 介導(dǎo)的定點突變將載有大鼠β4 亞基DNA 序列的質(zhì)粒作為模板，與誘導(dǎo)突變引物和Q5 超保真聚合酶體系按比例混合，采用PCR 方法進行定點誘變（圖2）。PCR 條件如下：50 μL 體系，95 ℃預(yù)變性120 s；隨后95 ℃變性20 s，60 ℃退火10 s，68 ℃延伸階段3 min，共循環(huán)18 次；最后68 ℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)完成后，在水浴條件下，在PCR 產(chǎn)物中加入1 μLDpnI，37 ℃反應(yīng)1 h，水解質(zhì)粒模板。取少量PCR 擴增產(chǎn)物在1.0 %瓊脂糖凝膠中90 V 電壓下電泳20 min，觀察電泳結(jié)果，驗證PCR 反應(yīng)成功。取PCR 產(chǎn)物3 μL 轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞，將菌液涂布于含有氨芐青霉素的固體平板培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)14～18 h。每個平板分別挑取5 個菌落，轉(zhuǎn)入含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)12～14 h，提質(zhì)粒后用Nanodrop 測定其濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳（條件同上）判斷其純度，測序驗證插入序列突變情況。

圖2 定點突變原理圖Fig.2 Strategy for site-directed mutagenesis

1.5 突變體質(zhì)粒酶切及回收選取測序正確的突變體質(zhì)粒進行酶切線性化反應(yīng)。200 μL 酶切反應(yīng)體系如下：突變體質(zhì)粒20 μg（40～60 μL），限制性內(nèi)切酶NheⅠ 10 μL，10×M Buffer 20 μL，剩余體積用ddH2O補齊，37 ℃反應(yīng)4 h。酶切后使用DNA 純化試劑盒回收線性化產(chǎn)物?；厥盏木€性質(zhì)粒使用Nanodrop 測定其濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷其純度。

1.6 突變體RNA 的制備將線性突變體質(zhì)粒作為模版，使用試劑盒法進行體外轉(zhuǎn)錄。20 μL 反應(yīng)體系如下：線性模版2 μg（5～6 μL）；2×NTP/CAP 10 μL；10×Rxn Buffer 2 μL；Enzyme Mix 2 μL；剩余體積用無RNA 酶的ddH2O 補齊，37 ℃反應(yīng) 4～6 h。隨后在反應(yīng)液中加入1 μL Dnase，反應(yīng)30 min，酶解DNA 模版。使用RNA 純化試劑盒回收cRNA 產(chǎn)物，Nanodrop 測定其濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.7 受體在非洲爪蟾卵母細胞上表達選取狀態(tài)良好的成熟雌性非洲爪蟾，冰凍麻醉1 h，用手術(shù)刀在腹側(cè)剖開小口，取出卵母細胞團塊。剪碎團塊，使用OR2 溶液清洗至澄清。將卵母細胞轉(zhuǎn)移至含有0.5 g·L-1膠原蛋白酶的OR2 溶液中酶解，室溫下反應(yīng)40～50 min，使其完全分離成為互不粘連的單個細胞，再用OR2 溶液清洗至少10 次后，挑選形態(tài)正常飽滿的卵母細胞轉(zhuǎn)入含抗ND-96 溶液中，在17 ℃、濕度35%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

卵母細胞在獲取24 h 后用于顯微注射，實驗方法參考熊洋等[20]對α6/α3β4 表達研究的優(yōu)化結(jié)果，將野生型或突變型α6/α3 與β4 nAChRs 亞基的cRNA 以1∶1 的比例混合，每個亞基的終濃度≥500 ng·μL-1。將混合后的RNA 以每個59.8 nL 的體積顯微注射入非洲爪蟾卵母細胞，在17 ℃、濕度35%條件下繼續(xù)培養(yǎng)（圖3）。

圖3 雌性非洲爪蟾及其卵母細胞A：雌性非洲爪蟾；B：手術(shù)取出新鮮卵母細胞團塊；C：酶解后的卵母細胞。Fig.3 Female Xenopus laevis and oocytesA:Female Xenopus laevis;B:Fresh oocyte masses;C:Oocytes after enzymolysis.

1.8 受體功能檢測顯微注射后2～5 d 使用雙電極電壓鉗檢測卵母細胞上受體的表達情況。設(shè)置鉗制電壓為-70 mV，灌流速度2～4 mL·min-1，記錄ACh 刺激細胞產(chǎn)生內(nèi)向電流的情況。詳細過程如下：每個循環(huán)總時長60 s，首先給予2 s Ach 脈沖刺激，隨后使用含有0.1 g·L-1BSA 的ND-96 緩沖液灌流沖洗，每個記錄程序含3 次循環(huán)。數(shù)據(jù)記錄軟件為pClamp 11.0.3，采樣模式為Episodic stimulation，采樣頻率為Slow 200 Hz。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用不同濃度的ACh 作為激動劑（1、10、50、100、250、500 μmol·L-1和1 mmol·L-1）刺激受體通道開放，檢測并記錄產(chǎn)生的內(nèi)向電流值。以1 mmol·L-1ACh 刺激產(chǎn)生的內(nèi)向電流作為基準(zhǔn)，計算其他濃度的ACh（1～500 μmol·L-1）刺激通道開放的反應(yīng)率。每組實驗數(shù)據(jù)至少在不同卵母細胞上重復(fù)3～6 次。所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 6.0 軟件使用非線性擬合方程：Response%=100/{1+(EC50/[agonist])nH}。式中Response 代表反應(yīng)率，agonist 代表激動劑的內(nèi)向電流值，nH 代表Hill 系數(shù)，分析擬合并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 誘導(dǎo)的定點突變瓊脂糖電泳結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，經(jīng)PCR 后，3 種突變體基因均有條帶產(chǎn)生（圖4-A 膠孔3、4、5），與線性質(zhì)粒模板（圖4-A 膠孔2）的位置一致，可以將PCR 產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化實驗。

圖4 定點突變PCR 產(chǎn)物、突變體亞基質(zhì)粒酶切及轉(zhuǎn)錄后cRNA 檢測的瓊脂糖電泳A.1：野生型rat β4 質(zhì)粒；2：線性rat β4 質(zhì)粒；3～5：突變體β4 [S52N,I53V]、β4 [I115V,Q116L]、β4 [K160M,S161T];B.1、3、5、7：突變體β4[S52N,I53V]、[I115V,Q116L]、[K160M,S161T]、野生型β4 亞基質(zhì)粒；2、4、6:突變體β4 [S52N,I53V]、[I115V,Q116L]、[K160M,S161T]線性質(zhì)粒；C:1～3：突變體β4 [S52N,I53V]、β4 [I115V,Q116L、β4 [K160M,S161T] cRNA；M1:DL15 000 DNA marker；M:DNA marker IV。Fig.4 Agarose electrophoresis of PCR site-directed mutation products,linear mutant plasmid after digestion and cRNAA.1:Wild-type rat β4 plasmid;2:Linear rat β4 plasmid;3-5:β4 subunit mutant after PCR site-directed mutation [S52N,I53V ],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];B.1,3,5,7:Plasmids of β4 subunit mutants [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T] and wild-type subunit;2,4,6 :Linear plasmids of β4 subunit mutant [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];C:1-3:cRNA of β4 subunit mutant [S52N,I53V],[I115V,Q116L],[K160M,S161T];M1:DL15 000 DNA marker;M:DNA marker IV.

2.2 質(zhì)粒提取與酶切結(jié)果使用質(zhì)粒提取試劑盒提取突變質(zhì)粒，所得結(jié)果經(jīng)超微量分光光度計測得濃度（表2）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果驗證質(zhì)粒純度良好。插入基因測序結(jié)果使用NCBI 網(wǎng)站中的BLAST 在線序列比對驗證，證實3 個突變體質(zhì)粒均構(gòu)建成功。將測序正確的β4 突變體質(zhì)粒與本體質(zhì)粒分別進行酶切反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳驗證。環(huán)狀質(zhì)粒（圖4-B 膠孔1、3、5、7）因呈超螺旋結(jié)構(gòu)，在瓊脂糖凝膠中空間位阻小，所以移動更快。而線性化的質(zhì)粒（圖4-B 膠孔2、4、6）移動較慢。電泳結(jié)果中線性化質(zhì)粒對應(yīng)泳道在環(huán)狀質(zhì)粒對應(yīng)位置已無條帶，證明酶切完全。經(jīng)超微量分光光度計測得濃度與A260/280值（表2），均在正常范圍內(nèi)，可進行后續(xù)實驗。

表2 突變體質(zhì)粒、線性質(zhì)粒濃度與A260/280 值Tab.2 Mutant plasmid and linear plasmid concentration and A260/280

2.3 cRNA 的制備測定體外轉(zhuǎn)錄獲得的cRNA 濃度（表3），均達到500 mg·μL-1。瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示，圖4-C 中膠孔1、2、3 相同高度均有對應(yīng)的較為清晰明亮的條帶，證明體外轉(zhuǎn)錄成功，可用于下一步卵母細胞顯微注射。

表3 突變體cRNA 濃度與A260/280 值Tab.3 Mutant cRNA concentration and A260/280

2.4 野生型及突變型α6β4* nAChR 的功能檢測使用雙電極電壓鉗對野生型和3 種突變型受體的功能進行檢測。α6/α3β4[S52N,I53V]突變型的受體與其他幾種相比，表達時間略有提前，在注射后的第3 天即達到正常水平。另外2 種突變型與野生型的受體表達時間無明顯的差異，均在第4 天達到正常水平。結(jié)果表明，ACh 濃度為1 μmol·L-1時均無電流產(chǎn)生，未達到產(chǎn)生內(nèi)向電流的最小刺激強度。隨著ACh 濃度的增大，受體接受ACh 刺激產(chǎn)生的電流值也隨之增大，呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢。對比圖5 中A、B、C、D 的電流軌跡圖，突變受體與野生型對ACh 的敏感程度相當(dāng)，可以初步判斷，突變并未影響受體的基本結(jié)構(gòu)及功能。當(dāng)給予相同濃度ACh刺激時，突變型α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 相比于野生型和其他的突變型，電流值明顯更大，推測是α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 離子通道的開放水平更高。

圖5 野生型和突變型α6/α3β4 nAChR 對不同濃度ACh 的電流圖Fig.5 Current traces of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR evoked by different concentrations of ACh

使用Graphpad Prism 6.0 軟件對測定結(jié)果進行分析，繪制濃度-反應(yīng)率曲線圖，并計算受體對ACh 刺激的EC50。對比圖6 中A、B、C 圖中的曲線，結(jié)果表明，野生型與突變型受體的變化趨勢相似。野生型α6/α3β4 nAChR 的EC50是突變型α6/α3β4[S52N,I53V] nAChR 的2 倍（表4），證明52、53 位雙點突變，對ACh 的激動活性有一定的提升，使α6/α3β4 nAChR 與ACh 結(jié)合后離子通道的開放程度增加。

表4 野生型及突變型α6/α3β4 nAChRs 對ACh 門控的半數(shù)有效濃度Tab.4 Median effective concentration (EC50) of wild type and mutant α6/α3β4 nAChRs for ACh stimulation

圖6 野生型及突變型α6/α3β4 nAChR 對激動劑ACh 的濃度-反應(yīng)曲線Mean±SEM，n=3～6。Fig.6 Concentration response curve of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR to the agonist ACh Mean ± SEM,n=3～6.

3 討論

α6β4*作為一類特殊的nAChRs 受到廣泛關(guān)注，但含α6 亞基nAChRs 的異源表達卻十分困難。煙堿型乙酰膽堿受體與配體結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)位于細胞膜外的N-端結(jié)合域，通過基因改造，構(gòu)建α6/α3 的嵌合體可以輔助受體正常表達，不影響受體的功能活性。

本研究比較了人類和大鼠的α6 和β4 兩種亞基的胞外N-端結(jié)合域的序列，發(fā)現(xiàn)人類和大鼠α6 亞基的同源性較高，而β4 亞基的種屬差異性更大。芋螺毒素是一類作用于nAChRs 的小分子多肽，可以作為分子探針，研究配體與受體結(jié)合的關(guān)鍵位點。HONE 等進行了人類（Human）和大鼠（Rat）α6/α3 和β4 亞基的混合表達實驗，構(gòu)建了Hα6/α3Hβ4、Rα6/α3Rβ4、Hα6/α3Rβ4 和Rα6/α3Hβ4 這4 種受體，并選取3 種作用于α6/α3β4 nAChR 的芋螺毒素PeIA、PnIA 和TxIB 作為拮抗劑，分別比較配體對突變受體的阻斷作用。結(jié)果顯示，這3 種芋螺毒素對受體的阻斷作用具有一致性，由強到弱依次為Hα6/α3Hβ4>Rα6/α3Hβ4>Hα6/α3Rβ4>Rα6/α3Rβ4。該實驗從一定程度上說明β4 亞基對α6/α3β4 nAChR 的配體識別和選擇具有重要作用[21]。

本實驗利用受體定點突變技術(shù)對大鼠β4 亞基非保守殘基進行受體突變，將其替換人類β4 亞基相同位置處的殘基，對比序列發(fā)現(xiàn)有3 處位點均為相鄰2 個殘基的差異。將2 個差異位點均設(shè)計在突變引物內(nèi)，經(jīng)一次突變即得到具有相鄰2 個殘基差異的突變受體，大大縮短了突變體構(gòu)建的時間，并且為后續(xù)大鼠和人類α6/α3β4 nAChR 對芋螺毒素活性差異關(guān)鍵位點的篩選，構(gòu)建了3 個雙點突變體模型。

在對突變體進行電生理活性檢測中，電流值的大小和變化趨勢與野生型受體均相似，表明受體基本的結(jié)構(gòu)和功能保持不變。而觀察ACh 濃度-反應(yīng)率曲線圖，其中1 種突變體α6/α3β4[S52N,I53V]相比于野生型，對ACh 敏感性更高，EC50值僅為本體的一半。并且在標(biāo)準(zhǔn)濃度(100 μmol·L-1)ACh 下，突變體α6/α3β4[S52N,I53V]產(chǎn)生的激發(fā)電流值更大。推測可能是由于52 位由絲氨酸變?yōu)樘於０泛蟾仔纬蓺滏I，而53 位由異亮氨酸到纈氨酸的改變，導(dǎo)致其空間位阻減小，使得在與ACh 結(jié)合時，通道的敏感性增加，且開放程度增大。由于在β4 亞基上人類和大鼠還存在其他差異位點，因此，α6/α3β4 nAChR對于激動劑ACh 和拮抗劑芋螺毒素活性的關(guān)鍵氨基酸位點還有待研究。