曾星翔,汪銘書,程安春

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)a.動物醫(yī)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)研究所;b.動物醫(yī)學(xué)院 禽病防治研究中心;c.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室,中國四川 成都 611130)

細(xì)小病毒是目前動物病毒中最小最簡單的一類單鏈線狀DNA病毒,無囊膜,直徑18～26 nm,病毒粒子(virus particle,VP)具有二十面體對稱性。細(xì)小病毒科(Parvoviridae)多數(shù)成員只引起輕微感染或不引起嚴(yán)重的疾病,所以并沒有引起人們足夠的重視。

細(xì)小病毒在細(xì)胞核內(nèi)繁殖,依靠宿主細(xì)胞進行復(fù)制。細(xì)小病毒在自然界的宿主范圍非常廣,主要有貓、狗、牛、羊、鵝、豬、水貂等[1],多數(shù)病毒感染宿主后呈長期潛伏感染狀態(tài),是影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)和小動物健康的一類重要病毒。對該類病毒感染的防治目前仍以接種減毒疫苗和滅活疫苗為主,但這些疫苗存在一些缺陷。例如:有一種應(yīng)用于預(yù)防豬細(xì)小病毒的滅活疫苗,它雖然能預(yù)防豬細(xì)小病毒的感染、發(fā)病,但接種疫苗的母豬并不能避免異源病毒的感染以及排毒,即使面對同源病毒的攻擊也不能阻止排毒,這意味著免疫疫苗后的豬仍能攜帶、傳播病毒,這對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)來說仍是一個隱患[2]。同時,滅活疫苗還有制備成本較高、誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體慢、不能引起細(xì)胞免疫且需要反復(fù)接種來避免效果不穩(wěn)定的可能性等缺陷。減毒疫苗則存在毒力返強的可能性,并且需要低溫儲存運輸?shù)?。因?尋找和發(fā)展更加安全有效的疫苗是對細(xì)小病毒病免疫預(yù)防的重要研究主題。本文對近年來開發(fā)的各種細(xì)小病毒新型疫苗及新型疫苗的發(fā)展進行總結(jié),以期為細(xì)小病毒新型疫苗的深入研究及應(yīng)用于實際生產(chǎn)提供參考。

1 新型疫苗發(fā)展概述

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,研究者們可構(gòu)建僅含抗原表位部分的表達(dá)載體或能表達(dá)異源病毒抗原表位的重組病毒,以此為基礎(chǔ)開發(fā)的新型疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗具有安全性更好、研制周期更短的優(yōu)點,可以更快進入臨床試驗階段。目前,新型疫苗主要有DNA疫苗、亞單位疫苗和重組活病毒載體疫苗。

1.1 DNA疫苗

核酸疫苗又稱基因疫苗,由Wolff等[3～4]在1990年偶然發(fā)現(xiàn)。研究者們通常將抗原表位基因和調(diào)控基因克隆到真核表達(dá)載體,并將重組質(zhì)粒直接免疫動物。疫苗進入機體后,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與MHCⅠ或Ⅱ類分子結(jié)合形成抗原肽MHC分子復(fù)合物,經(jīng)CD8+或CD4+細(xì)胞識別,誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[5～6]。由于質(zhì)粒的構(gòu)建是基因工程的成熟技術(shù),所以常規(guī)DNA疫苗的生產(chǎn)工藝簡單且成本低;并且,核酸疫苗僅含抗原表位基因,因此不存在毒力返強的可能性。但是,常規(guī)DNA疫苗進入細(xì)胞的效率往往較低,使得機體免疫應(yīng)答程度不如傳統(tǒng)的減毒疫苗和滅活疫苗,因此研究者們?yōu)榱颂岣咂涿庖咝Ч岢隽艘恍┙鉀Q方案,如進行密碼子優(yōu)化[7]、利用脂質(zhì)體為載體進行免疫[8]、實施電穿孔免疫、添加分子佐劑[9]、采用prime-boost免疫策略[10～13]等。隨著研究的深入,在常規(guī)DNA疫苗和RNA復(fù)制子疫苗的基礎(chǔ)上研究者們發(fā)展出了復(fù)制型DNA疫苗,DNA復(fù)制子疫苗以具有“自主復(fù)制”功能的RNA病毒——主要是甲病毒如辛德比斯病毒(Sindbis virus,SBV)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus,SFV)等為基礎(chǔ)構(gòu)建而成,包含病毒基因組5'和3'末端的順式作用序列,以及復(fù)制酶編碼基因的全部非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,NSP)基因編碼區(qū)。復(fù)制型DNA疫苗在復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)能刺激干擾素的產(chǎn)生,增強宿主體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[14],同時能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并最終被機體清除[15]。所以,以此為基礎(chǔ)的復(fù)制型DNA疫苗又被稱作“自殺性DNA疫苗”。豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、傳染性法氏囊病病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒、口蹄疫病毒等[10,14,16～20]常見動物疫病病毒的復(fù)制子疫苗的廣泛應(yīng)用顯示了其在獸醫(yī)領(lǐng)域的巨大潛力。

1.2 基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗是將病毒、致病菌或寄生蟲的抗原表位基因與合適的載體結(jié)合后在受體(細(xì)菌、酵母或動物細(xì)胞)中表達(dá),可直接免疫接種或收集表達(dá)產(chǎn)物并加入佐劑后再進行免疫的一類疫苗。亞單位疫苗不含有病原體的其他遺傳信息,因此具有安全性好的優(yōu)點。但重組亞單位疫苗缺乏抗原識別需要的病原體相關(guān)的分子模式,導(dǎo)致這類疫苗的免疫原性通常比完整病原體差[21～22],需要通過多次免疫、加入佐劑或者使用其他能增強免疫反應(yīng)的物質(zhì)來增強免疫效果,才能使機體獲得有效保護[23～24]。常規(guī)佐劑有鋁佐劑[25]、弗氏佐劑[26]等。為進一步發(fā)展亞單位疫苗,研究者們嘗試使用新型佐劑,如皂甙[27]、含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODNs)[28]、白介素-2(interleukin-2,IL-2)[29]等。另外,病毒的衣殼蛋白一般具有天然的自我裝配能力[30],由其組裝而成的介于15～400 nm的病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)在形態(tài)上與真正的病毒粒子相似,可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞,從而有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)[31],具有開發(fā)成為病毒亞單位疫苗的可能性。目前,相關(guān)研究已通過細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生豬圓環(huán)病毒[32]、口蹄疫病毒[33]、寨卡病毒[34]等多種病毒的VLPs,VLP是未來亞單位疫苗的熱點研究方向。

1.3 基因工程活病毒載體疫苗

基因工程活病毒載體疫苗是利用基因操作技術(shù)將異源性病毒的保護性抗原基因及啟動子序列插入到作為載體的另一種病毒如減毒疫苗株的基因組非必需區(qū)中而構(gòu)建的疫苗[35]。由于異源病毒基因已成為載體病毒基因組的一部分,可隨載體病毒的繁殖而不停的表達(dá),所以這種疫苗在機體可同時誘導(dǎo)產(chǎn)生針對載體病毒及異源性病毒的特異性免疫反應(yīng),可達(dá)到一針防兩病或多病的目的[36～38]。目前,重組病毒構(gòu)建時人們主要通過同源重組、fosmid多片段拯救系統(tǒng)或細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)系統(tǒng)編輯病毒載體基因組,編輯后的病毒能正常復(fù)制,免疫原性不受影響,因此該類疫苗通常不需要再添加佐劑,但選擇插入位點時需要考慮該位點對載體病毒的復(fù)制能力及免疫原性的影響,其次還要考慮插入基因的表達(dá)情況,包括表達(dá)盒元件啟動子、增強子、起始密碼子和終止密碼子等影響因素。目前,常用的病毒載體主要有痘病毒、腺病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和桿狀病毒。

2 細(xì)小病毒新型疫苗的免疫效果

細(xì)小病毒的基因組包含兩個開放閱讀框(open reading frame,ORF),左側(cè)ORF編碼與病毒復(fù)制和細(xì)胞凋亡有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白;右側(cè)ORF編碼與病毒粒子形成有關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白,又稱衣殼蛋白。衣殼蛋白決定著病毒的吸附與進入、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和定位、外排及其在環(huán)境中的穩(wěn)定性,含有抗原表位[1],因此是研制細(xì)小病毒新型疫苗的靶抗原。目前,國內(nèi)外學(xué)者以細(xì)小病毒衣殼蛋白為基礎(chǔ)進行了各種新型疫苗的研究,探究了各新型疫苗免疫預(yù)防細(xì)小病毒的效力(表1)。

表1 細(xì)小病毒新型疫苗Table 1 Novel vaccines against parvoviruses

2.1 DNA疫苗

韓新鋒等[39]以鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus,GPV)-CHv株VP3為靶基因,構(gòu)建含VP3基因的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體,并以此為基因疫苗肌肉注射小鼠和鵝,結(jié)果顯示,接種后30 d開始能在小鼠和鵝體內(nèi)檢測到中和抗體,第90天中和抗體水平達(dá)到峰值,105 d后仍能檢測到中和抗體。王印等[40]將豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)VP2基因重組到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),并將重組質(zhì)粒肌肉注射BALB/c小鼠,結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PPV特異性抗體,但抗體水平略低于PPV減毒疫苗組;重組質(zhì)粒誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力與減毒疫苗接近,并且重組質(zhì)粒組小鼠在免疫后CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著增加,說明其能有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。需要指出的是,該重組質(zhì)粒組小鼠在免疫后CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯低于空白對照組,具體原因有待進一步探究。此外,該研究團隊在首免56 d后對小鼠實質(zhì)器官的總DNA進行了PCR檢測,未擴增出PPV-VP2片段,表明VP2基因未整合到小鼠染色體上,該核酸疫苗無基因整合的風(fēng)險。孫彥欣等[41]將豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus type 2,PCV2)中編碼T細(xì)胞表位P21多肽的基序與PPV-VP2基序的5'端相連插入pcDNA3.1(+),并將重組質(zhì)粒肌肉注射BALB/c小鼠,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PPV和PCV特異性抗體,且對淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)有明顯促進作用。Wu等[42]首先構(gòu)建了表達(dá)GPVVP2的重組質(zhì)粒pTCY-VP2,同時通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組蛋白rVP2,隨后以CpG ODNs作為佐劑,在pTCY-VP2初次免疫鴨14 d后實施pTCY-VP2或rVP2加強免疫。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,兩種免疫方案均顯著提高了鴨體內(nèi)特異性抗體的滴度、淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)、CD4+和CD8+細(xì)胞百分比以及α干擾素(interferon-α,IFN-α)、IFN-γ、IL-6 和 IL-12 的轉(zhuǎn)錄水平。此外,與pTCY-VP2+pTCY-VP2同源prime-boost方案相比,pTCY-VP2+rVP2異源prime-boost方案在加強免疫兩周后能更顯著提高機體外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力、CD4+和CD8+細(xì)胞百分比、細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。

Dahiya等[43]將犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2插入包含NSP1～4的SBV復(fù)制子[14]并轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌,隨后口服免疫犬只,初次免疫21 d后進行1次加強免疫。結(jié)果顯示:接種商品化滅活疫苗和復(fù)制型DNA疫苗后機體淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)均明顯增強,且復(fù)制型DNA疫苗接種21 d后機體內(nèi)特異性抗體水平和中和抗體水平均高于商品化滅活疫苗組;此外,在體外用滅活CPV抗原刺激淋巴細(xì)胞后,復(fù)制型DNA疫苗組CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞增加的數(shù)量高于商品化滅活疫苗組兩倍,表明接種該DNA疫苗后犬體內(nèi)產(chǎn)生了致敏淋巴細(xì)胞,對病毒攻擊能更快激發(fā)免疫應(yīng)答,因此口服復(fù)制型DNA疫苗接種可能是犬類疫苗接種的有效替代策略,是一種有潛力的犬類大規(guī)模疫苗接種方法。

2.2 基因工程亞單位疫苗

Lee等[44]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組的鴨細(xì)小病毒(duck parvovirus,DPV)VP2蛋白(rVP2),并將其作為抗原,以AI-gel或CpG-ODNs為佐劑免疫母鴨,初次免疫14 d后加強免疫。結(jié)果顯示,免疫含CpG 2佐劑的rVP2的母鴨所孵出的雛鴨的母源抗體水平明顯高于其他組且能維持高抗體滴度至少28 d,同時DPV攻毒后雛鴨不產(chǎn)生特征病變,體內(nèi)免疫器官檢測不到病毒。

丁軻等[45]構(gòu)建了表達(dá)GPV-VP3的重組乳酸桿菌質(zhì)粒pMJ-SP-GPV-VP3,同時將能增強機體細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的IL-2[46]與VP3串聯(lián)構(gòu)建了重組乳酸桿菌質(zhì)粒pMJ-SP-GPV-VP3-gIL2,將兩種重組乳酸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至乳酸桿菌后口服免疫雛鵝。結(jié)果顯示,pMJ-SP-GPV-VP3-gIL2免疫組的保護率、血清GPV中和抗體效價和小腸黏膜sIgA水平均比pMJ-SP-GPV-VP3免疫組高,但比減毒疫苗組低,提示重組乳酸桿菌質(zhì)粒pMJ-SP-GPV-VP3-gIL2有開發(fā)成口服疫苗的潛力。Xu等[47]構(gòu)建了重組乳酸桿菌共表達(dá)PPVVP2蛋白和豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位290基因,并在無佐劑的情況下對2～3個月大的無PPV和CSFV母源抗體的仔豬進行口服免疫,結(jié)果顯示:重組乳酸桿菌能引起機體內(nèi)CTL產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答;能誘導(dǎo)機體發(fā)生黏膜免疫反應(yīng),并產(chǎn)生高水平的黏膜IgA,表明其對CSFV攻毒能提供有效的保護。乳酸桿菌是一種腸道益生菌,重組乳酸桿菌在腸道中的定植能延長其潛在的對健康有益的作用,并且口服免疫能引起黏膜免疫反應(yīng),有利于增強該類疫苗的免疫效果。

Ju等[48]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中分別表達(dá)GPV的VP1、VP2和VP3重組蛋白。電鏡觀察結(jié)果顯示,重組蛋白(rVPs)能在昆蟲細(xì)胞中自發(fā)組裝成與天然GPV病毒顆粒相似的VLPs。將不同VLPs加入礦物油佐劑后接種雛鵝,結(jié)果顯示,每種VLP都能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的中和抗體,其中rVP2-VLP、rVP3-VLP誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體的水平明顯高于滅活疫苗組和減毒疫苗組。Chen等[49]將野生株GPV VP2的密碼子優(yōu)化為昆蟲細(xì)胞中更常見的密碼子,利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生VLPs,收集VLPs后加入礦物油佐劑并免疫雛鵝,發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的中和抗體。Xu等[50]在大腸桿菌中表達(dá)融合了小分子泛素相關(guān)修飾物蛋白(small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)的CPV-VP2蛋白,SUMO裂解后VP2蛋白自組裝成VLPs,將這些VLPs皮下接種小鼠后發(fā)現(xiàn),其能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體,促進淋巴細(xì)胞增殖。Nan等[51]將序列優(yōu)化后的CPV-VP2克隆到pET-30a載體并轉(zhuǎn)化至能表達(dá)觸發(fā)因子的BL21(DE3)進行共表達(dá),發(fā)現(xiàn)獲得的VLPs能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體、IFN-γ和 IL-4。

2.3 基因工程活病毒載體疫苗

細(xì)小病毒基因組較小,為4.5～5.5 kb,因此人們通常選擇其結(jié)構(gòu)蛋白基因作為插入基因構(gòu)建重組病毒。Wang等[52]將GPV-VP3基因重組到對F蛋白進行修飾致弱[53～55]的新城疫病毒(NDV)NA-1型菌株構(gòu)建rmNA-VP3,將該活病毒載體疫苗接種雛鵝后發(fā)現(xiàn),雛鵝無明顯病征,疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的GPV和NDV中和抗體,且高水平的中和抗體能維持至少12周而不出現(xiàn)明顯下降。此外,進一步的研究發(fā)現(xiàn),重組病毒在雞胚中連續(xù)傳代10次后F蛋白修飾位點和插入的VP3基因仍然很穩(wěn)定,提示該重組病毒活載體疫苗的遺傳穩(wěn)定性良好。陳柳等[56]將GPV-VP2表達(dá)框插入鴨腸炎病毒(duck enteritis virus,DEV)US7和US8基因之間構(gòu)建重組病毒rDEV-VP2,并將重組病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryo fibroblast,CEF),結(jié)果顯示其增殖滴度與親本株無顯著差異,且在CEF中能正常表達(dá)GPV-VP2蛋白;進一步將重組病毒接種7日齡雛番鴨,結(jié)果顯示其能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生GPV-VP2抗體,3周后抗體陽性率為50%,但免疫保護力有待進一步研究。Luo等[57]使用基于HEP-Flury株狂犬病毒(rabies virus,RABV)改造的攜帶雙糖蛋白(G)基因的狂犬病毒rHEP-dG和RAVB HEP-Flury株,構(gòu)建表達(dá)CPV-VP2蛋白的兩種重組病毒rHEP-dG-VP2和rHEPVP2,發(fā)現(xiàn)兩種重組病毒的增殖速率均高于親本株,同時兩種重組病毒均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的犬細(xì)小病毒和狂犬病毒特異性抗體,并且免疫保護率均超過90%。

3 總結(jié)與展望

通常,一款獸用疫苗的研制程序需要經(jīng)歷毒種分離、種子批建立與鑒定、培養(yǎng)材料選擇、生產(chǎn)工藝(滅活、凍干)選擇、效果評價、試制及臨床試驗等過程,新型疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗最大的優(yōu)勢就是利用成熟的技術(shù)直接構(gòu)建疫苗,免去了毒種篩選、分離和鑒定的過程,開發(fā)時間更短;同時,沒有致病基因存在,安全性更好。目前,國內(nèi)外已有許多種病毒的新型疫苗成功商品化,但針對細(xì)小病毒的新型疫苗尚未成功商品化,國內(nèi)近期只有兩種豬細(xì)小亞單位疫苗處于臨床試驗階段。不過,目前處于研制階段的各種細(xì)小病毒新型疫苗大部分能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的中和抗體,保護動物免受強毒的攻擊,顯示出了繼續(xù)開發(fā)的潛力。核酸疫苗和亞單位疫苗的主要優(yōu)勢在于僅含能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的基因,對機體無致病性,比較安全,但核酸疫苗所用的載體可能存在對機體有害的隱患,而亞單位疫苗大多情況下都需要加入佐劑等才能增強免疫反應(yīng)以提高免疫原性,因此開發(fā)新型佐劑、優(yōu)化表達(dá)載體是發(fā)展這兩種疫苗所需解決的關(guān)鍵問題。重組活病毒載體疫苗的主要優(yōu)勢是與自然病毒感染刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效果接近,不需要為了加強免疫原性而再進行處理。另外,細(xì)小病毒重組活載體疫苗在開發(fā)時通常選擇同樣對該種動物危害大的病毒作為載體,具有病毒載體容量更大、能容納多個異源片段、一苗防多病的優(yōu)勢。當(dāng)然,該類疫苗也還存在一些問題有待進一步研究和解決,比如:使用鴨瘟病毒這類研究還不夠全面的載體病毒時,插入位點對外源基因表達(dá)和抗原遞呈的影響、外源基因?qū)d體病毒免疫原性的影響等問題是未來研究的關(guān)鍵?？傊?各種新型疫苗各有優(yōu)劣,在開發(fā)新型疫苗時可以根據(jù)實際情況選擇合適的疫苗類型及疫苗配方,未來對于細(xì)小病毒的防控還可以從疫苗免疫途徑及免疫周期等與免疫程序相關(guān)的方面進行探索,找到更理想、更有效、更適合于生產(chǎn)實際的疫苗及免疫程序。