居悅俊,沈 婷,陳 剛,孔穎宏

(江蘇省常熟市第二人民醫(yī)院,1.內分泌科,2.超聲科,江蘇 常熟,215500)

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統(tǒng)腫瘤[1],受該病影響最嚴重的是中年婦女，其中約85%為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[2-3]。PTC的分化良好，周邊的侵犯性低，通過手術切除通常可以治愈，并且5年生存率超過95%[4]。但是,PTC有時會分化為更具侵襲性和致命性的甲狀腺癌。另外，約30%的PTC患者中觀察到復發(fā)[5]。因此，有必要對該疾病的分子特征進行進一步分析。目前，已經(jīng)在大多數(shù)PTC病例中發(fā)現(xiàn)了高頻率激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中編碼效應子的基因的體細胞變化，這些基因在細胞凋亡中起重要作用[6]。目前，已鑒定出許多與PTC致癌相關的潛在生物標志物[包括金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP1)、血小板衍生生長因子(PDGF)和上皮muctin-1(MUC-1)],但有關其分子機制仍存在不確定性[7-9]。本研究通過公共數(shù)據(jù)庫及本院甲狀腺細針穿刺數(shù)據(jù)探索LncRNA CRNDE在PTC中的表達情況及其與預后及免疫浸潤的關系。

1 資料與方法

1.1 RNA測序數(shù)據(jù)和生物信息學分析

使用TCGA數(shù)據(jù)庫，從395例甲狀腺癌(THCA)項目(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/studied-cancers/thyroid)中收集PTC RNA序列(RNA-seq)數(shù)據(jù)和臨床信息，其中58例有匹配的鄰近組織。下載的數(shù)據(jù)格式為每百萬千堿基(FPKM)3級高通量測序片段，然后轉換為每百萬轉錄本(TPM)格式以供后續(xù)分析。同時下載了GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE60542數(shù)據(jù)集的33例PTC組織和29例癌旁組織，以及基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫 (GTEx,https://gtexportal.org/home/eqtls/tissuetissueName=Thyroid)中653例正常甲狀腺組織的TPM格式的RNA-seq數(shù)據(jù)。本研究中執(zhí)行的所有程序均符合赫爾辛基宣言(2013年修訂)。

1.2 樣本CRNDE 和BRAF V600E突變檢測

標本來源:選取2020年8月—2020年12月在本院內分泌科行甲狀腺結節(jié)細針穿刺(FNA)的標本，按甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統(tǒng)(TBSRTC),選取良性結節(jié)及PTC各40例。

CRNDE檢測:使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)提取總RNA并進行逆轉錄。在Applied Biosystems 7500進行實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR),使用2-△△Ct法計算相對于甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表達的mRNA表達。BRAF V600E突變檢測:檢測采用qPCR檢測人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒(艾得生物，中國廈門)。所有測量均根據(jù)標準方案進行。

1.3 免疫浸潤分析

PTC的免疫浸潤分析是通過來自R包ggstatsplot方法[10]進行的，描述了CRNDE與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及髓樣樹突狀細胞免疫評分之間的相關性。

1.4 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均使用R(v.4.0.3)進行。使用Wilcoxon秩和檢驗分析CRNDE在各數(shù)據(jù)集中的表達情況,t檢驗及卡方檢驗分析臨床病理特征與CRNDE之間的關系。使用Kaplan-Meier方法計算TCGA患者的存活率。使用Cox比例風險模型進行單變量和多變量分析，以估計臨床和遺傳臨床特征與總生存率(OS)之間的關聯(lián)。Spearman分析CRNDE與免疫細胞評分之間的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CRNDE在PCT中高表達

首先分析了CRNDE在TCGA泛癌中的表達，可以確認THCA數(shù)據(jù)集中有顯著表達差異(P<0.001,圖1A)。CRNDE在58個PTC組織中表達水平為(2.062±0.942),CRNDE在58個配對癌旁組織中表達水平為(1.550±0.560),CRNDE在PTC中高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,圖1B)。同時還分析了TCGA中395個PTC組織及GTEx數(shù)據(jù)庫中653個正常甲狀腺組織中的CRNDE表達,CRNDE在PTC組織中顯著高表達(P<0.000 1,圖1C)。受試者工作特征(ROC)曲線分析CRNDE表達水平，區(qū)分PTC與非腫瘤組織的有效性及敏感性,CRNDE的曲線下面積(AUC)為0.839 7(P<0.000 1,圖1D)。

通過Wilcoxon秩和檢驗分析GEO數(shù)據(jù)庫中GSE60542數(shù)據(jù)集中33例PTC組織及29例癌旁組織中CRNDE的表達，發(fā)現(xiàn)CREND在PTC中顯著高表達(P=0.000 6,圖2A)。非配對樣本t檢驗對FNA數(shù)據(jù)分析顯示,CRNDE在PTC組織中表達為(2.797±0.168),在Ⅱ級分類良性結節(jié)中表達為(2.661±0.147),差異有統(tǒng)計學意義(t=2.938,P=0.003 8,圖2B)。Spearman相關性分析顯示,CRNDE與BRAF V600E顯著相關(r=0.714,P<0.000 1,圖2C)。

2.2 CRNDE表達與 PTC的臨床病理特征的關系

從TCGA數(shù)據(jù)庫收集了395個具有臨床和基因表達數(shù)據(jù)的原發(fā)性PTC。根據(jù)CRNDE相對表達的平均值，將PTC患者分為高表達組(n=198)和低表達組(n=197),評估CRNDE的表達水平與PTC患者臨床病理特征之間的關聯(lián)?？ǚ綑z驗顯示CRNDE表達與T分期、N分期、M分期、TNM分級無相關性(P>0.05)。見表1。

2.3 CREND表達與PTC患者OS之間的關系

CREND的表達與PTC患者的OS呈正相關(P=0.012 6)。見圖3。

2.4 PTC預后因素的Cox單因素和多因素分析

Cox單因素回歸模型中(圖4A)顯示,CRNDE(P<0.000 1)、年齡(P<0.000 1)、T分期(P=0.000 7)、TNM分期(P<0.000 1)與PTC預后相關。多因素分析進一步顯示(圖4B),CRNDE(P=0.001 6)、年齡(P<0.000 1)是PTC患者OS的獨立預后因素。

表1 CRNDE表達與PTC的臨床病理特征

2.5 CRNDE表達與免疫浸潤的相關性

CRNDE的表達與B細胞、CD8+T細胞及巨噬細胞的浸潤水平呈正相關(P<0.05,圖5A、C、D),與CD4+T細胞的浸潤水平呈負相關(P<0.000 1,圖 5B)。

3 討 論

PTC被認為是遺傳背景和預后極為不同的癌癥，特征是多種生物學行為，從輕微到極具侵略性，這些是由于癌癥亞型的基因突變不同導致[11-13]。隨著qPCR及高通量測序技術的成熟，大量的PTC基因數(shù)據(jù)呈現(xiàn)在公共數(shù)據(jù)庫中。目前，研究[14]認為PTC的基因表達譜足夠穩(wěn)定，可用于診斷，即使癌細胞未超過腫瘤基質，也很容易檢測到。

lncRNA可調節(jié)包括PTC在內的各種癌癥的進展，促進癌細胞的增殖、侵襲、遷移和耐藥[15]。體外實驗[16]表明,CRNDE通過競爭性結合miR-384,在PTC中促進細胞增殖、侵襲和遷移。本研究表明,lncRNA CRNDE在PTC中上調,CRNDE高表達與PTC患者較差的生存期相關。研究[17]認為,lncRNA CRNDE產生的有效危險因素評分能夠評估PTC患者的預后，且將其分組后，高風險組的預后不佳，這與本研究結果相似。腫瘤浸潤免疫細胞已被證明與PTC的腫瘤進展和預后相關[18]。研究[19]表明,T細胞和 B 細胞對甲狀腺進行淋巴浸潤的細胞免疫反應，以及導致特異性抗體產生體液免疫反應。本研究結果顯示,CRNDE與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞及巨噬細胞的浸潤水平相關,CRNDE可能參與PTC發(fā)生的免疫反應，導致PTC患者預后不良。免疫反應參與PTC,導致其預后不良的機制尚不明確，目前認為有以下幾種可能:先前存在的免疫炎性反應導致惡性腫瘤;免疫圍繞先前存在的腫瘤細胞，導致特定的免疫反應;免疫耐受導致惡性腫瘤。本研究表明，在THCA中,CRNDE與患者的腫瘤分期無關。目前研究[1]顯示,PTC中BRAF V600E突變等位基因的平均百分比為25.3%,80.0%的腫瘤BRAF V600E呈陽性，本研究顯示BRAF V600E突變樣本中在CRNDE呈現(xiàn)高表達，提示CRNDE與BRAF V600E突變可能存在相關性，但目前大樣本量的相關研究較少。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，驗證樣的GEO及實驗樣本為小樣本資料;TCGA的主要目的不是獲得全面的臨床數(shù)據(jù)，一些重要的臨床因素，如TMN分期及預后數(shù)據(jù)受到限制，故存在一定局限性，需要進一步的前瞻性臨床試驗來驗證結果。Lnc CRNDE在PTC中的分子機制并未完全闡明，也仍需進一步驗證。

綜上所述,LncRNA CRNDE在PTC中高表達，與PTC的BRAF V600E突變、不良預后、免疫浸潤存在相關性。LncRNA CRNDE可能是評估PTC的一種有前景的預后生物標志物。