杜蕾，谷令彪，位子昂，高會(huì)會(huì)，張光杰

(安陽(yáng)工學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000)

花生，又名長(zhǎng)生果，一年生草本植物，在我國(guó)很多地區(qū)均有種植，是重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。近幾年，我國(guó)花生年均產(chǎn)量可達(dá)1700萬(wàn)噸以上，與此同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量的花生殼等加工副產(chǎn)物?；ㄉ鷼ぶ亓空蓟ㄉ傊氐?0%左右，其中不僅含有豐富的木質(zhì)素和纖維素，少量淀粉、蛋白質(zhì)等成分，還含有木犀草素、5,7-二羥基色原酮、圣草酚等多種黃酮類物質(zhì)[1-2]。

黃酮類物質(zhì)廣泛存在于植物的根、莖、葉、花及果實(shí)中，且種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，以C6-C3-C6為基本骨架見(jiàn)圖1，是在A、B、C環(huán)上連接不同的取代基而形成的一組化合物。黃酮類物質(zhì)具有抑菌、消炎、清除自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、增強(qiáng)免疫力等生物活性，是中草藥的重要成分[3-7]。從植物中提取出的黃酮類物質(zhì)具有明顯的抗氧化性及抑菌性，可以將其應(yīng)用于肉制品及乳制品的保鮮[8-9]。黃酮類物質(zhì)除作為食品保鮮劑外，還可以將其用來(lái)開(kāi)發(fā)調(diào)味品[10-11]。

圖1 黃酮類物質(zhì)的C6-C3-C6骨架結(jié)構(gòu)

目前，花生殼并沒(méi)有得到很好的開(kāi)發(fā)利用，絕大部分花生殼被焚燒或丟棄，只有少部分被制成飼料，造成了花生殼資源的大量浪費(fèi)，而且會(huì)危害環(huán)境。本研究以花生殼為原料，利用纖維素酶來(lái)輔助提取其中的黃酮類物質(zhì)，并進(jìn)行抗氧化及抑菌試驗(yàn)，以期為其在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。對(duì)農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物進(jìn)行綜合利用不但是對(duì)農(nóng)產(chǎn)品廢棄物高效轉(zhuǎn)化的一種體現(xiàn)，還可以獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益，對(duì)我國(guó)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有深遠(yuǎn)影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生：購(gòu)于河南安陽(yáng)某市場(chǎng)，手工剝殼；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海哈靈生物科技有限公司；纖維素酶(10 U/mg)：深圳綠微康生物科技有限公司；2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基(DPPH)：上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸(Vc)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AB-8大孔樹(shù)脂：北京索萊寶科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌：由安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；其他化學(xué)試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-400A粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TD02D電子分析天平 余姚市金諾天平儀器有限公司；201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；T9紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH8臺(tái)式低速大容量離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；L550數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；HL-2F恒流泵 上海嘉鵬科技有限公司； STELLAR 85真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Millrock公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；TM-XD50D臺(tái)式快速蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 提取方法

篩選出外觀完好的花生殼，洗凈，干燥，粉碎，過(guò)60目篩，備用。向250 mL具塞三角瓶中加入5 g花生殼粉、一定量的纖維素酶、體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液，置于恒溫水浴中進(jìn)行酶解提取，冷卻至室溫后進(jìn)行過(guò)濾。收集濾液，經(jīng)離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000 r/min離心10 min，收集上清液，測(cè)定黃酮的提取率。

1.4 提取率的計(jì)算

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，得線性回歸方程為：y=3.5022x+0.0055(R2=0.9967)。

將提取到的上清液置于100 mL的容量瓶中，用70%乙醇定容，取5 mL于25 mL的容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定花生殼黃酮的提取率，公式如下：

式中：R為花生殼黃酮的提取率，%；m為花生殼質(zhì)量，g；c為測(cè)得黃酮濃度，mg/mL；v為樣品溶液體積，mL；n為溶液稀釋倍數(shù)。

1.5 單因素及正交試驗(yàn)

以黃酮提取率為響應(yīng)值，分別選擇酶添加量(0.4%～1.4%，占花生殼的質(zhì)量)、酶解時(shí)間(60～180 min)、酶解溫度(35～65 ℃)、料液比(1∶4～1∶14，g/mL)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以單因素試驗(yàn)結(jié)果來(lái)設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化黃酮提取工藝，以獲得最佳工藝參數(shù)。

1.6 大孔樹(shù)脂純化

AB-8大孔樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h后，用蒸餾水沖洗至無(wú)乙醇味，加入層析柱中?；ㄉ鷼S酮提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃，200 r/min進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液加蒸餾水稀釋至2 mg/mL，設(shè)置恒流泵轉(zhuǎn)速45 r/min，流速1.42 mL/min，上樣量2.5倍樹(shù)脂體積；5倍樹(shù)脂體積蒸餾水進(jìn)行洗滌后，4倍樹(shù)脂體積70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液減壓蒸餾，得到濃縮液備用。

將1.3和1.6得到的濃縮液置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，冷凍條件：-40 ℃、10 h，-60 ℃、26 h；干燥條件：10 ℃、28 h，20 ℃、20 h，真空度100 mt，分別得到花生殼黃酮粗提物、純化后花生殼黃酮。

1.7 抗氧化試驗(yàn)

取純化后的花生殼黃酮，用70%乙醇配制成5 mg/mL的樣品溶液，再梯度稀釋成不同濃度的花生殼黃酮溶液(1，2，3，4，5 mg/mL)，測(cè)定其對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除作用，以70%乙醇作陰性對(duì)照，相同濃度的Vc溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

1.8 抑菌試驗(yàn)

1.8.1 抑菌試驗(yàn)

采用濾紙片法對(duì)花生殼黃酮的抑菌性進(jìn)行測(cè)定[13]。配制牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，滅菌，備用；在超凈工作臺(tái)上，采用劃線法將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌接種至斜面培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，備用；分別用無(wú)菌水對(duì)斜面培養(yǎng)基上的4種細(xì)菌進(jìn)行稀釋，得到菌體濃度為106個(gè)/mL的菌懸液，備用；取純化后的花生殼黃酮，用無(wú)菌水配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL的樣品溶液，取直徑為6 mm的圓形濾紙片，高壓滅菌后放入不同濃度樣品溶液中浸泡1 h，備用；分別向平板培養(yǎng)基上加入0.5 mL的菌懸液，并涂布均勻，將浸濕的濾紙片貼在平板表面，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次取平均值，以生理鹽水作為陰性對(duì)照。

1.8.2 最小抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)

取純化后的花生殼黃酮，用無(wú)菌水溶解后，加入無(wú)菌培養(yǎng)基中，使其在培養(yǎng)基中的濃度分別為0.50，0.75，1.00，1.25 mg/mL，倒入培養(yǎng)皿，凝固后，分別加入金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌各100 μL，涂布均勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，肉眼觀察是否有可見(jiàn)菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對(duì)提取率的影響

固定料液比1∶8、酶解時(shí)間150 min、酶解溫度50 ℃，考察酶添加量對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酶添加量對(duì)提取率的影響

由圖2可知，隨著酶添加量的增大，黃酮提取率也逐漸增大，在酶添加量達(dá)到1.0%時(shí)，提取率為2.378%，此后再增大酶添加量，提取率并沒(méi)有明顯提高?；ㄉ鷼ぷ鳛榈孜?，濃度是固定的，當(dāng)增加纖維素酶的用量時(shí)，酶的濃度被提高，加速了酶與底物的反應(yīng)速度，促進(jìn)了細(xì)胞破裂，從而使黃酮類物質(zhì)溶出，提取率提高；當(dāng)酶的濃度達(dá)到飽和時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到平衡，再增加酶的用量也不會(huì)明顯地提高提取率。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

固定酶添加量1.0%、料液比1∶8、酶解溫度50 ℃，考察酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，花生殼黃酮提取率明顯提高，當(dāng)酶解時(shí)間為90 min時(shí)，提取率為2.403%，此后再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提取率反而有所下降。在反應(yīng)初期，延長(zhǎng)酶解時(shí)間可以使酶與底物之間的反應(yīng)充分進(jìn)行，提高黃酮提取率；在反應(yīng)完成以后，酶逐漸失去活性，長(zhǎng)時(shí)間的作用也可能導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)被破壞，降低了提取率。

2.1.3 酶解溫度對(duì)提取率的影響

固定酶添加量1.0%、料液比1∶8、酶解時(shí)間90 min，考察酶解溫度對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)提取率的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，黃酮提取率變化明顯，在35～45 ℃時(shí)，提取率隨著溫度的升高而增大，在45 ℃時(shí)達(dá)到最大，為2.495%。當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃后，隨著溫度的持續(xù)增大，黃酮提取率卻開(kāi)始下降。酶活性受溫度的影響較大，酶可以在短時(shí)間內(nèi)耐受較高的溫度，而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，最適溫度會(huì)向溫度降低的方向移動(dòng)。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)酶促反應(yīng)作用時(shí)間的長(zhǎng)短，選定不同的最適溫度。

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

固定酶添加量1.0%、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度45 ℃，考察料液比對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)提取率的影響

由圖5可知，隨著料液比的改變，黃酮提取率發(fā)生變化明顯，在料液比為1∶4～1∶8時(shí)，黃酮提取率隨提取液的增加而提高，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，提取率達(dá)到最大值2.576%，之后再增加提取液提取率反而下降。提取液的添加量會(huì)直接影響到酶和底物的濃度，提取液過(guò)少時(shí)，酶和底物接觸不充分，提取液過(guò)多又會(huì)稀釋酶和底物的濃度，只有當(dāng)酶和底物的濃度達(dá)到理想值時(shí)，反應(yīng)才能充分進(jìn)行。

2.2 正交試驗(yàn)

酶解法提取花生殼黃酮的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交組合及試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，RC>RA>RD>RB，即4個(gè)因素對(duì)提取率的影響主次順序依次為酶解溫度>酶添加量>料液比>酶解時(shí)間。各因素最優(yōu)組合為A2B3C2D2，經(jīng)驗(yàn)證最佳工藝條件是：酶添加量1.0%、酶解時(shí)間120 min、酶解溫度45 ℃、料液比1∶10，在此條件下進(jìn)行花生殼黃酮的提取試驗(yàn)，最終提取率可達(dá)到2.593%。

2.3 大孔樹(shù)脂純化

對(duì)正交試驗(yàn)得到的最佳工藝進(jìn)行提取，對(duì)比純化前后提取物中黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)花生殼黃酮提取物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化后，其黃酮含量由12.71%提高到25.32%。

2.4 抗氧化性試驗(yàn)

2.4.1 對(duì)羥基自由基的清除作用

花生殼黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用見(jiàn)圖6。

圖6 黃酮對(duì)羥基自由基的清除率

由圖6可知，隨著黃酮濃度的增加，花生殼黃酮對(duì)羥基自由基的清除效果增強(qiáng)，在相同濃度下，黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力均高于Vc；在濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為84.5%。

2.4.2 對(duì)DPPH自由基的清除能力

花生殼黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力見(jiàn)圖7。

圖7 黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率

2.5 抑菌性試驗(yàn)

花生殼黃酮的抑菌作用見(jiàn)表3，最小抑菌濃度見(jiàn)表4。

表3 花生殼黃酮的抑菌作用Table 3 The antibacterial effect of flavonoids from peanut shells

表4 花生殼黃酮最小抑菌濃度(MIC)

由表3和表4可知，隨著花生殼黃酮濃度的增大，其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯增強(qiáng)，濃度為1.25 mg/mL時(shí)對(duì)這4種細(xì)菌均有明顯的抑制作用，花生殼黃酮對(duì)4種細(xì)菌的MIC分別為金黃色葡萄球菌1.00 mg/mL、大腸桿菌1.25 mg/mL、沙門氏菌0.75 mg/mL、枯草芽孢桿菌1.00 mg/mL。

3 結(jié)論

黃酮類物質(zhì)多存在于植物細(xì)胞中，纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分，通過(guò)添加纖維素酶可以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出速度。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比四因素三水平的正交試驗(yàn)，得到花生殼黃酮最佳提取工藝為：酶添加量1.0%、酶解時(shí)間120 min、酶解溫度45 ℃、料液比1∶10，在此條件下花生殼黃酮的提取率可達(dá)到2.593%。

機(jī)體內(nèi)存在大量自由基會(huì)加速衰老和疾病的產(chǎn)生，黃酮類物質(zhì)所含的酚羥基可以與自由基結(jié)合，終止氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到抗氧化的作用。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除效果來(lái)測(cè)定花生殼黃酮的抗氧化性，結(jié)果表明花生殼黃酮對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率與其濃度呈正相關(guān)；在相同濃度下，其清除能力均高于Vc。

黃酮類物質(zhì)的抑菌性與其骨架結(jié)構(gòu)上連接的羥基位置和數(shù)量有關(guān)，抑菌機(jī)理主要包括破壞菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制菌體內(nèi)酶的活性、抑制菌體內(nèi)物質(zhì)及能力的代謝等作用。抑菌性試驗(yàn)表明花生殼黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌都有較好的抑制作用，且抑菌效果與其濃度呈正相關(guān)；最小抑菌濃度試驗(yàn)表明在濃度達(dá)到1.25 mg/mL時(shí)，對(duì)以上4種細(xì)菌即可表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

我們可以利用花生殼黃酮的抗氧化性和抑菌性，將其應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃酮類物質(zhì)作為食品保鮮劑的報(bào)道比較多，但將其應(yīng)用于調(diào)味品的研究還比較少見(jiàn)。近年來(lái)，人們對(duì)調(diào)味品的要求不僅僅是要滿足味蕾的需求，還要求其更加營(yíng)養(yǎng)、安全、健康，因此，營(yíng)養(yǎng)調(diào)味品、功能調(diào)味品等復(fù)合調(diào)味品具有廣闊的市場(chǎng)前景[14]。黃酮類物質(zhì)作為天然功能性成分雖然健康、安全、無(wú)副作用，但其穩(wěn)定性不如化學(xué)合成物質(zhì)，因此，可以利用微膠囊等技術(shù)來(lái)減少其營(yíng)養(yǎng)成分的損失，延長(zhǎng)貨架期，擴(kuò)大其在調(diào)味品中的應(yīng)用范圍[15]。