張雪，唐建華

(1.吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林 四平 136001；2.揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

1 概述

南瓜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是一種既營(yíng)養(yǎng)又美味的家常蔬菜[1]。而南瓜籽含有的豐富蛋白質(zhì)、維生素，使其醫(yī)藥功效加倍，具有實(shí)際研究?jī)r(jià)值[2]。在南瓜研發(fā)熱潮中，蛋白質(zhì)是南瓜研發(fā)的一個(gè)重要熱點(diǎn)[3]。南瓜籽蛋白質(zhì)含量約為35%，人體吸收率在88%～97%之間，具有良好的平衡能力。南瓜籽富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，也是優(yōu)良的植物蛋白[4]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，南瓜籽發(fā)芽后，蛋白質(zhì)更具降血糖效果[5]。

以往使用三氯醋酸-丙酮沉淀法提取南瓜籽蛋白質(zhì)，低溫下將南瓜籽充分研磨后，加入三氯醋酸和丙酮共溶于離心管內(nèi)，渦旋振蕩，在20 ℃靜置2 h，離心反復(fù)洗滌，沉淀至無(wú)色，并進(jìn)行真空冷凍干燥。該方法容易破壞蛋白質(zhì)，導(dǎo)致提取結(jié)果雜質(zhì)較多；使用電泳法提取南瓜籽蛋白質(zhì)，借助多種蛋白酶水解南瓜籽蛋白，并篩選出適用于制備南瓜籽蛋白的抑制肽蛋白酶，結(jié)合響應(yīng)面方法優(yōu)化提取工藝。使用該方法在電場(chǎng)環(huán)境中，容易受到背景顏色的影響，使蛋白質(zhì)無(wú)法全部提取，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取效率低下。因此，在提取南瓜籽蛋白質(zhì)時(shí)，首先要考慮到蛋白質(zhì)資源的利用，采用冷榨法可以很好地保存南瓜籽的營(yíng)養(yǎng)成分，以南瓜籽作為原料，采用冷榨法提取蛋白質(zhì)，并對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性進(jìn)行分析，為其有效利用提供參考。

2 材料與方法

2.1 主要材料與試劑

南瓜籽仁：廣州雪馨花食品有限公司的白瓜籽；正己烷：淄博協(xié)創(chuàng)化工有限公司；冰乙酸：濟(jì)南金百禾工貿(mào)有限公司；乙醇：山東匯豐生物工程有限公司；丙酮：寧波印川國(guó)際貿(mào)易有限公司；碘化鉀：上海氏典化工科技發(fā)展有限公司；硫代硫酸鈉：武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司；乙酸鈉：鄭州潤(rùn)稼化工產(chǎn)品有限公司，上述試劑均為分析純。

2.2 儀器與設(shè)備

GY95-冷榨機(jī) 廣州國(guó)研機(jī)械設(shè)備制造有限公司；Alpha Imager HP蛋白凝膠成像系統(tǒng) 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；M249300超低溫冰箱 北京海富達(dá)科技有限公司；LGJ-10-50系列冷凍干燥機(jī) 南京貝帝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DR3900紫外分光光度計(jì) 上海植茂環(huán)?？萍加邢薰?。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 南瓜籽蛋白質(zhì)特點(diǎn)分析

2.3.1.1 蛋白質(zhì)持水性和持油性

蛋白質(zhì)的持水性和持油性是南瓜籽蛋白質(zhì)中重要功能特性之一，當(dāng)溫度和加熱時(shí)間增加時(shí)，蛋白質(zhì)出現(xiàn)的反應(yīng)見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)持水性和持油性分析Fig.1 Analysis of water and oil holding capacity of proteins

由圖1可知，南瓜籽蛋白質(zhì)綜合持油能力比持水能力強(qiáng)，且隨著溫度升高，蛋白質(zhì)的持油能力在100 ℃時(shí)達(dá)到最高。蛋白質(zhì)的持水能力在60 ℃時(shí)達(dá)到最高，出現(xiàn)這種情況的主要原因是溫度升高，使蛋白質(zhì)變性，產(chǎn)生大量極性側(cè)鏈基團(tuán)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的親水性和親油性。

2.3.1.2 蛋白質(zhì)溶解性

蛋白質(zhì)與水之間的作用力是由蛋白中肽鍵的偶極-偶極作用而產(chǎn)生的，或離子化的、極性側(cè)鏈的同分子作用而產(chǎn)生的，蛋白質(zhì)的溶解性受到pH值的影響較大，其溶解性見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白質(zhì)溶解性Fig.2 The solubility of protein

由圖2可知，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解性最差，該值為蛋白質(zhì)溶解度最低值，因此，可將該點(diǎn)作為提取蛋白質(zhì)時(shí)酸性沉淀的pH值[6]。

pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)表1。

表1 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Table 1 The effect of pH value on the extraction rate of protein

隨著pH值不斷升高，蛋白質(zhì)的提取率也在不斷增大(P<0.01)[7]。為了確定最佳pH值，不同pH值下提取蛋白質(zhì)的各個(gè)參數(shù)試驗(yàn)條件見(jiàn)表2。

表2 蛋白質(zhì)各個(gè)參數(shù)試驗(yàn)條件Table 2 The test conditions for each parameter of protein

由表3可知，隨著pH值升高，蛋白質(zhì)的提取效率也在不斷升高[8]。當(dāng)pH值為10時(shí)，變性蛋白的需求量最大，而提取蛋白的含水量最大，故 pH值以10為最佳[9-10]。

表3 測(cè)定結(jié)果Table 3 The determination results

2.3.1.3 其他特性

對(duì)于南瓜籽蛋白質(zhì)的其他特性進(jìn)行研究，以大豆蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蛋白質(zhì)其他特性

由表4可知，南瓜籽蛋白質(zhì)比大豆蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性低，而其他特性比大豆蛋白質(zhì)要高。

2.3.2 工藝流程

南瓜籽→溫度低于60 ℃→調(diào)制→冷榨→冷榨蛋白質(zhì)→精濾→冷榨南瓜籽蛋白質(zhì)。

2.3.3 蛋白質(zhì)提取效率計(jì)算

(1)

式中：m1表示提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量；m表示南瓜籽中蛋白質(zhì)質(zhì)量。

2.4 指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 冷榨溫度對(duì)工藝的影響

在用冷榨法提取南瓜籽蛋白時(shí)，適當(dāng)?shù)母邷赜欣诒３值鞍踪|(zhì)的可塑性，有利于破壞解脂酶、脂肪氧化酶，也便于蛋白質(zhì)提取后進(jìn)行儲(chǔ)存和使用。但在高溫環(huán)境下，冷榨工藝也會(huì)產(chǎn)生一些副作用，如在冷榨過(guò)程中水分大量增加，破壞蛋白質(zhì)的可塑性，在提高蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量的同時(shí)，其他雜質(zhì)也在增加，因此，研究的冷榨溫度范圍應(yīng)選擇45～60 ℃。

工藝反應(yīng)條件：選擇的冷榨溫度分別為45，50，55，60 ℃，研究冷榨溫度對(duì)南瓜籽蛋白質(zhì)提取效率的影響，見(jiàn)表5。

表5 冷榨溫度對(duì)工藝的影響Table 5 The effect of cold pressing temperature on process

由表5可知，隨著冷榨溫度的升高，蛋白質(zhì)的提取效率也不斷提高，但冷榨溫度的標(biāo)準(zhǔn)要求低于60 ℃時(shí)，若溫度過(guò)高，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害南瓜籽的營(yíng)養(yǎng)成分，故選用60 ℃為宜。

2.4.2 冷榨水分含量對(duì)工藝的影響

隨著冷榨水分含量不斷增加，蛋白質(zhì)的可塑性也在不斷發(fā)生變化。當(dāng)冷榨水分含量達(dá)到某一閾值時(shí)，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效果達(dá)到最佳，此時(shí)的水分含量即為臨界水分。臨界水分與溫度、蛋白質(zhì)變性程度有關(guān)，在冷榨過(guò)程中，主要影響蛋白質(zhì)提取純度的是含水量，當(dāng)水分含量過(guò)低時(shí)，冷榨溫度升高，此時(shí)蛋白質(zhì)變性，影響工藝效果；當(dāng)水分含量過(guò)高時(shí)，破壞南瓜籽，無(wú)法形成蛋白質(zhì)，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率低，同樣也影響工藝效果。

工藝反應(yīng)條件：通過(guò)表5確定的最佳冷榨控制溫度為60 ℃，在該溫度下，選取水分含量分別為5%、10%、15%、20%進(jìn)行冷榨，由此研究冷榨水分含量對(duì)南瓜籽蛋白質(zhì)提取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 冷榨水分含量對(duì)工藝的影響Table 6 The effect of cold pressing water content on process

由表6可知，隨著水分含量增加，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)水分含量為10%時(shí)，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率達(dá)到最高，而當(dāng)水分含量為15%時(shí)，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率下降，說(shuō)明水分含量過(guò)多不利于南瓜籽蛋白質(zhì)的提取。

2.4.3 冷榨壓力對(duì)工藝的影響

南瓜籽在冷榨過(guò)程中的壓榨，主要是由于南瓜籽受壓后固體內(nèi)外表面受到擠壓，蛋白質(zhì)被榨出造成的。在相同情況下，蛋白質(zhì)受到的壓榨程度越大，粒子塑性變形程度越大，提取出的蛋白質(zhì)成分也就越多。然而，受到某種壓力的影響，冷榨壓縮存在一定限度，即使壓力增加到最大值，壓縮能力也不再增加，此時(shí)為不可壓縮體，也就是極限壓力。

工藝反應(yīng)條件：通過(guò)表5確定的最佳冷榨控制溫度為60 ℃，通過(guò)表6確定的最佳水分含量為15%，在該溫度和水分含量下，選取冷榨壓力分別為1.0，2.0，3.0，4.0 MPa進(jìn)行冷榨，由此研究冷榨壓力對(duì)南瓜籽蛋白質(zhì)提取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 冷榨壓力對(duì)工藝的影響Table 7 The effect of cold pressing pressure on process

由表7可知，隨著冷榨壓力增加，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率升高，但變化幅度不大。為了防止在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中壓力過(guò)大影響提取效率，選擇壓力為3.0 MPa作為工藝提取指標(biāo)。

2.4.4 冷榨轉(zhuǎn)速對(duì)工藝的影響

工藝反應(yīng)條件：通過(guò)表5確定的最佳冷榨控制溫度為60 ℃，通過(guò)表6確定的最佳水分含量為15%，通過(guò)表7確定的冷榨壓力為3.0 MPa，在該溫度、水分含量和壓力下，選取冷榨轉(zhuǎn)速分別為32，34，36，38，40，42，44 r/min進(jìn)行冷榨，由此研究冷榨轉(zhuǎn)速對(duì)南瓜籽蛋白質(zhì)提取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 冷榨轉(zhuǎn)速對(duì)工藝影響Table 8 The effect of cold pressing rotating speed on process

由表8可知，轉(zhuǎn)速越大，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率也隨之變大，其中當(dāng)轉(zhuǎn)速為42 r/min時(shí)，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率達(dá)到最高為66.7%，然而，當(dāng)轉(zhuǎn)速為44 r/min時(shí)，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效率卻降低。因此，選擇42 r/min作為蛋白質(zhì)提取工藝的最佳轉(zhuǎn)速。

通過(guò)上述分析可知，影響南瓜籽蛋白質(zhì)提取的因素主要為冷榨溫度、冷榨水分含量、冷榨壓力和冷榨轉(zhuǎn)速，其中當(dāng)溫度為60 ℃、水分含量為15%、冷榨壓力為3.0 MPa、冷榨轉(zhuǎn)速為42 r/min時(shí)，南瓜籽蛋白質(zhì)的提取效果最好。為了驗(yàn)證該情況下提取效果良好，需使用不同提取方法與冷榨法對(duì)比，并在紫外分光光度計(jì)支持下完成對(duì)比分析。

3 結(jié)果與討論

將南瓜籽分成3組，每組150 g南瓜籽，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)的純度。選擇5個(gè)10 mL比色管，用0.9% NaCl溶液溶解，將蛋白質(zhì)稀釋成250 mL，3個(gè)試管大小為1.5 cm×15 cm×9 cm。分別使用三氯醋酸-丙酮沉淀法、電泳法和冷榨法提取南瓜籽蛋白質(zhì)，以下為對(duì)比內(nèi)容及結(jié)果。

3.1 基本原理

使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白質(zhì)提取效率時(shí)，由于蛋白質(zhì)中含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的吸收紫外光特性。在一定波長(zhǎng)下，分析蛋白質(zhì)溶液吸光度值與蛋白質(zhì)溶液濃度的關(guān)系，由此獲取蛋白質(zhì)提取效果。

3.2 試驗(yàn)步驟

選取光程為1 cm、波長(zhǎng)為290 nm、縱坐標(biāo)為A290、橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)濃度的石英比色皿，將1 mL待測(cè)蛋白質(zhì)溶液配以1 mL，加入3 mL蒸餾水，搖動(dòng)均勻，測(cè)定A290。

3.3 測(cè)定結(jié)果與分析

分別使用三氯醋酸-丙酮沉淀法、電泳法和冷榨法提取蛋白質(zhì)，其紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

(a)三氯醋酸-丙酮沉淀法

(b)電泳法

(c)冷榨法

3.3.1 三氯醋酸-丙酮沉淀法

使用三氯醋酸-丙酮沉淀法處理南瓜籽時(shí)較難，得到的蛋白質(zhì)濃度不高。當(dāng)蒸餾水為3.0 mL時(shí)，隨著蛋白質(zhì)濃度增加，吸收紫外光波長(zhǎng)也隨之增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為2.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為235 nm；在蒸餾水為1.5 mL情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為2.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為255 nm；在蒸餾水為0 mL情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為2.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為260 nm。

3.3.2 電泳法

使用電泳法雖然提取雜質(zhì)少，但在提取過(guò)程中會(huì)影響蛋白質(zhì)遷移速率。當(dāng)蒸餾水為3.0 mL時(shí)，隨著蛋白質(zhì)濃度增加，吸收紫外光波長(zhǎng)也隨之增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為3.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為240 nm；在蒸餾水為1.5 mL情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為3.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為255 nm；在蒸餾水為0 mL情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為3.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為270 nm。

3.3.3 冷榨法

使用冷榨法不會(huì)破壞南瓜籽的組織結(jié)構(gòu)，當(dāng)蒸餾水為3.0 mL時(shí)，隨著蛋白質(zhì)濃度增加，吸收紫外光波長(zhǎng)也隨之增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為3.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為240 nm；在蒸餾水為1.5 mL情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為3.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為265 nm；在蒸餾水為0 mL情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為3.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為290 nm。

通過(guò)上述分析結(jié)果可知，使用冷榨法能夠提取高純度蛋白質(zhì)。

4 結(jié)論

通過(guò)研究確定：

(1)南瓜籽蛋白質(zhì)的持水能力比持油能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)在pH值為4.5時(shí)，溶解度達(dá)到最低；

(2)南瓜籽蛋白質(zhì)比大豆蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性低，而其他特性比大豆蛋白質(zhì)要高；

(3)冷榨控制最佳溫度為60 ℃，最佳水分含量為15%，最佳冷榨壓力為3.0 MPa，最佳轉(zhuǎn)速為42 r/min。

通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證可知，使用冷榨法不會(huì)破壞南瓜籽的組織結(jié)構(gòu)，在蒸餾水為0 mL情況下，蛋白質(zhì)濃度為3.5 mL時(shí)，吸收紫外光波長(zhǎng)達(dá)到最高，為290 nm，能夠提取高純度蛋白質(zhì)。