楊美竹，王慧森，劉璇，馬春穎，李雙燕，2，鄂旭，王鑫，李穎暢*

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013)

秘魯魷魚(Dosidicusgigas)又稱美洲大魷魚，集中分布在東部太平洋的秘魯海域[1]。魷魚中含有大量的氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, TMAO)和多種與呈味有關(guān)的氨基酸，TMAO是水產(chǎn)品中純天然的鮮味成分[2-3]。但是魷魚中的甲醛(Formaldehyde, FA)是強(qiáng)致癌、致畸物質(zhì)，嚴(yán)重影響了魷魚制品的品質(zhì)和食用安全[4]。目前，國內(nèi)外研究表明，魷魚中內(nèi)源性甲醛的產(chǎn)生途徑主要有兩條：一是酶催化途徑，二是非酶途徑生成[5]。Lin等[6]研究發(fā)現(xiàn)將5種魷魚在 200 ℃的條件下加熱 1 h 后，魷魚體內(nèi)大部分的 TMAO熱分解生成了二甲胺(Dimethylamine, DMA)和三甲胺(Trimethylamine,TMA)。付雪艷等[7]表明加熱過程可促進(jìn)魷魚中甲醛的生成。并且已有的研究表明，氧化三甲胺通過高溫裂解產(chǎn)生甲醛的現(xiàn)象僅在魷魚加工過程中比較普遍和顯著。靳肖等[8]通過確立簡單的TMAO非酶作用反應(yīng)模型體系以TMAO和Fe(Ⅱ)為反應(yīng)物，與魷魚絲提取的上清液進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，TMAO熱分解反應(yīng)越劇烈，但當(dāng)加熱30 min后FA和DMA的生成量逐漸呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢。

通過測定反應(yīng)前后魷魚上清液中FA、DMA、TMA生成量的變化、氨基酸和還原糖含量的變化，研究不同的反應(yīng)條件對魷魚上清液中TMAO熱分解的影響，探究魷魚體內(nèi)含有的氨基酸和還原糖與TMAO降解的相關(guān)性，找出加熱前后變化較為顯著的內(nèi)源性氨基酸和還原糖，為進(jìn)一步研究內(nèi)源性氨基酸和還原糖對TMAO熱分解的影響奠定了基礎(chǔ)，且為魷魚中甲醛含量的控制提供了理論依據(jù)，促進(jìn)了水產(chǎn)品行業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

秘魯魷魚：購于錦州市林西路水產(chǎn)市場；甲醇(色譜純)：購于上海吉至生化科技有限公司；無水硫酸鈉：購于上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷：購于天津博迪化工股份有限公司；對甲苯磺酰氯：購于江蘇新鑫隆醫(yī)藥科技股份有限公司；甲苯(色譜純)：購于北京市通廣精細(xì)化工公司；氯化鐵：購于嶸匯創(chuàng)新科技有限公司；以上無特殊說明均為分析純。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2550紫外-可見分光光度儀 日本島津儀器公司；冷凍高速離心機(jī) 美國Thermo公司；7890高效氣相色譜儀、高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；電子分析天平 Mettler Toledo公司；PHS-C型pH計(jì) 北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魷魚上清液的提取

將冷凍儲藏的魷魚在室溫下解凍，將魷魚表面的皮去掉后用絞肉機(jī)絞碎，稱取2.00 g魚肉于50 mL離心管中，加入20 mL 7.5% TCA，冰浴超聲30 min，靜置10 min沉淀蛋白后，以10000 r/min高速離心10 min，取上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至6左右，定容至50 mL，冰浴冷卻至室溫，測定FA、DMA、TMA和TMAO的含量。

1.3.2 溫度對魷魚上清液中TMAO熱分解的影響

取10 mL魷魚上清液分別于60，70，80，90，100 ℃條件下反應(yīng)30 min后迅速冷卻，以 5000 r/min離心15 min，測定TMAO、FA、DMA、TMA含量、紫外吸光度和褐變程度。

1.3.3 時(shí)間對魷魚上清液中TMAO熱分解的影響

取10 mL魷魚上清液，于100 ℃條件下分別反應(yīng)0，15，30，45，60，75 min后，迅速冷卻，以5000 r/min離心15 min后，測定TMAO、FA、DMA、TMA含量、紫外吸光度和褐變程度。

1.3.4 TMAO、FA、DMA、TMA、紫外吸光度和褐變程度的測定

TMA的測定參考朱軍莉[9]的方法。TMAO含量的測定：先取2 mL的反應(yīng)液，加入1%的三氯化鈦溶液0.25 mL，在80 ℃水浴鍋中水浴90 s，將TMAO還原為TMA，取出冷卻后測定方法同TMA。DMA的測定參考賈佳[10]的方法。

FA的測定參考勵(lì)建榮等[11]建立的高效液相色譜法。

紫外吸光度和和褐變程度的測定參考Ajandouz等[12]的方法。將反應(yīng)后的溶液稀釋100倍，分別在294 nm和420 nm處測吸光度。

1.3.5 氨基酸含量的測定

按GB/T 5009.124-2003[13]規(guī)定的方法進(jìn)行測定。

1.3.6 還原糖含量的測定

還原糖的測定參照趙凱等[14]建立的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對魷魚上清液中TMAO降解的影響

在不同的加熱溫度條件下魷魚上清液中TMAO、FA、DMA、TMA含量的變化情況見圖1。

圖1 加熱溫度對魷魚上清液中TMAO降解的影響Fig.1 Effect of heating temperature on TMAO degradation in squid supernatant

由圖1可知，隨著加熱溫度的升高，TMAO含量顯著(P<0.05)降低，同時(shí)FA、DMA、TMA含量顯著(P<0.05)升高，加熱溫度對TMAO的降解具有顯著影響(P<0.05)。當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí)，F(xiàn)A、DMA和TMA的含量增加迅速，分別從4.85，69.87，10.54 mg/L增加至29.55，224.71，48.49 mg/L。相應(yīng)的TMAO含量下降，從最初的1986.88 mg/L下降到1190.2339 mg/L。加熱到100 ℃后，F(xiàn)A含量增加了6.09倍，DMA含量增加了3.22倍，TMA含量增加了4.6倍，TMAO含量減少了40.1%。付雪艷等[15]研究發(fā)現(xiàn)FA在130 ℃條件下加熱60 min后仍有上升的趨勢。韓冬嬌等[16]研究表明隨著貯藏溫度的升高，南美白對蝦中TMAO含量降低，TMA含量隨溫度升高增長速度變快。本文的研究結(jié)果與其是一致的。

2.2 時(shí)間對魷魚上清液TMAO降解的影響

在100 ℃的條件下經(jīng)不同加熱時(shí)間處理后氧化三甲胺、甲醛、二甲胺和三甲胺含量的變化情況見圖2。

圖2 加熱時(shí)間對魷魚上清液中TMAO降解的影響Fig.2 Effect of heating time on TMAO degradation in squid supernatant

由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，TMAO降解速率加快，含量顯著(P<0.05)降低，甲醛、二甲胺、三甲胺的生成量隨著加熱時(shí)間的增加呈上升的趨勢。加熱時(shí)間在0～45 min內(nèi)TMAO熱分解生成的FA、DMA和TMA含量迅速升高，與初始含量相比分別增加了7.13倍、7.2倍和4.16倍；隨后在45～75 min之間，F(xiàn)A、DMA和TMA的含量增加緩慢，但是100 ℃的條件下加熱75 min的過程中TMAO熱分解反應(yīng)仍在進(jìn)行。靳肖等研究發(fā)現(xiàn)魷魚絲在100 ℃的條件下加熱0～60 min后TMAO熱分解變化顯著，F(xiàn)A、DMA生成量增加顯著，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其研究的結(jié)果一致，說明加熱時(shí)間是影響TMAO降解生成FA、DMA和TMA的重要因素。

2.3 時(shí)間對魷魚上清液褐變程度的影響

在100 ℃的條件下加熱不同時(shí)間后魷魚上清液褐變程度的變化情況見圖3。

圖3 加熱時(shí)間對魷魚上清液褐變程度的影響Fig.3 Effect of heating time on the browning degree of squid supernatant

由圖3可知，隨著加熱時(shí)間的延長，魷魚上清液的褐變程度呈現(xiàn)持續(xù)增大的趨勢，魷魚上清液在420 nm和294 nm處的初始吸光度值分別為0.028和0.511，加熱75 min后吸光度值分別增加到0.068和0.906，較初始吸光度值分別增加了0.04和0.415，隨著加熱時(shí)間的延長，吸光度值變大，顏色加深。褐變程度增加的原因可能是在加熱過程中加熱時(shí)間越長，魷魚上清液中含有的氨基酸和還原糖之間發(fā)生的美拉德反應(yīng)越劇烈，吸光度值越高，褐變越顯著。

2.4 溫度對魷魚上清液褐變程度的影響

在不同加熱溫度下加熱相同時(shí)間后魷魚上清液褐變程度的變化趨勢見圖4。

圖4 加熱溫度對魷魚上清液褐變程度的影響Fig.4 Effect of heating temperature on the browning degree of squid supernatant

由圖4可知，隨著加熱溫度的升高，魷魚上清液的褐變程度呈現(xiàn)持續(xù)增大的趨勢，魷魚上清液在420 nm和294 nm處的初始吸光度值分別為0.062和0.163，在加熱60～100 ℃的過程中吸光度值分別增加到了0.089和0.255，較初始吸光度值分別增加了1.44倍和1.56倍。在60～70 ℃之間褐變程度不顯著，這是因?yàn)樵谠摐囟确秶鷥?nèi)對魷魚上清液中的氨基酸和還原糖所發(fā)生的美拉德反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，褐變程度變化相對不明顯。吳惠玲等[17]研究發(fā)現(xiàn)糖和氨基酸在大于80 ℃條件下發(fā)生的美拉德反應(yīng)明顯，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在80～100 ℃之間魷魚上清液的褐變程度顯著(P<0.05)。

2.5 加熱前后氨基酸的變化

魷魚上清液在100 ℃的條件下加熱60 min后氨基酸含量的變化情況見表1。

表1 加熱前后魷魚上清液中氨基酸含量的變化Table 1 The changes in amino acids＇ content in squid supernatant before and after heating

由表1可知，秘魯魷魚上清液中總氨基酸含量為94.61 g/100 g，其中以谷氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸的含量最高，F(xiàn)u等在對魷魚熱處理過程中物理化學(xué)性質(zhì)變化的研究中發(fā)現(xiàn)，加熱前以谷氨酸和脯氨酸的含量最高。隨著加熱溫度的升高，17種氨基酸的含量均呈下降的趨勢。當(dāng)在100 ℃下加熱60 min后，賴氨酸含量從最初的9.93 g/100 g下降到6.37 g/100 g，減少率為35.85%；谷氨酸含量由16.47 g/100 g下降至10.58 g/100 g，減少率為35.76%；精氨酸含量由2.25 g/100 g下降至1.32 g/100 g，減少率為41.33%，其中以賴氨酸含量變化最大，加熱前后存在顯著性差異(P<0.05)。Tsai等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在所有的氨基酸中Lys對美拉德反應(yīng)最敏感，褐變率也最高。魷魚中含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸[19]，魷魚在加熱的過程中氨基酸含量的顯著減少很可能是由于氨基酸參與了美拉德褐變反應(yīng)。

2.6 加熱前后還原糖的變化

加熱前后魷魚上清液中還原糖含量的變化情況見表2。

表2 加熱前后魷魚上清液中還原糖含量的變化Table 2 The changes in reducing sugars＇ content in squid supernatant before and after heating

由表2可知，隨著加熱的進(jìn)行，半乳糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖含量呈下降的趨勢，除半乳糖以外，另外幾種還原糖在加熱后因含量<10 mg/L而未檢出。加熱后半乳糖含量從最初的353.23 mg/L下降到了260.72 mg/L。還原糖含量降低的原因可能是魷魚在加熱的過程中體內(nèi)含有的還原糖和氨基化合物之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，并且隨著加熱溫度的升高，美拉德反應(yīng)進(jìn)行的速率逐漸加快，從而使得還原糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢[20]。

3 結(jié)論

魷魚上清液隨著溫度的升高和加熱時(shí)間的延長，TMAO逐漸熱分解為甲醛、二甲胺和三甲胺。加熱溫度越高、加熱時(shí)間越長，TMAO的分解速度越快，相應(yīng)的FA、DMA和TMA含量也就生成的越多。

魷魚上清液中氨基酸含量非常豐富，其中以賴氨酸、谷氨酸、半胱氨酸含量最高。隨著加熱溫度的升高，大部分氨基酸含量呈下降趨勢；但魷魚上清液中半乳糖的含量較高，經(jīng)加熱處理后乳糖含量顯著降低，麥芽糖、葡萄糖、果糖均因含量過低而未檢出。

加熱溫度和加熱時(shí)間對魷魚上清液的褐變程度具有顯著變化。溫度越高、加熱時(shí)間越長，魷魚上清液的褐變程度越顯著，這是因?yàn)樵诩訜崽幚淼臈l件下易發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生褐變物質(zhì)，導(dǎo)致魷魚上清液的褐變程度加深。