梁若飛，張亞蘭，向 月，唐曉平

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科1，病理科2，四川 南充 637002）

利用現(xiàn)代科技手段從傳統(tǒng)中藥中篩選新的廣譜、高效的抗腫瘤藥物已成為近年來科研工作者的研究熱點(diǎn)。毛蘭素（erianin）是從中藥石斛中分離提取出來的單體，其化學(xué)名稱是2-甲氧基-5-[2-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-乙基]-苯酚（分子量為318.36）。目前已有研究發(fā)現(xiàn)[1-4]，毛蘭素對包括膀胱癌、鼻咽癌及肺癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤作用。本研究以毛蘭素為研究對象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測篩選并分析，一方面，希望為毛蘭素的藥理作用機(jī)制研究提供新思路，另一方面，為尋找毛蘭素的潛在抗腫瘤機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛蘭素作用靶點(diǎn)預(yù)測 在Pubchem[5]查詢毛蘭素信息，打開相應(yīng)的條目，下載毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)，保存為“sdf”格式。將毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入HT Docking 數(shù)據(jù)庫中（https://www.cbligand.org/HTDocking/search_struct.php）進(jìn)行基于蛋白結(jié)構(gòu)特征的反向分子對接的潛在靶點(diǎn)的預(yù)測，選取Docking Score＞7.8 靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 毛蘭素作用靶點(diǎn)相關(guān)通路富集分析 排除非人靶蛋白后利用Uniprot[6]查詢所獲取的相關(guān)靶蛋白對應(yīng)的基因名，進(jìn)行檢索和整理。運(yùn)用Cytoscape 軟件[7]中ClueGO 分析插件，對上述靶蛋白對應(yīng)的基因信息進(jìn)行KEGG 通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析 將毛蘭素治療靶點(diǎn)信息上傳至蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站Gene－MANIA[8]，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過Cytoscape 軟件中ClueGO 分析插件對蛋白對應(yīng)的基因信息進(jìn)行KEGG 通路富集分析，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用超幾何富集分析Enrichment（Two-sided Hypergeometric test），校正方法采用多重比較Bonferroni step down，當(dāng)P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蘭素預(yù)測靶點(diǎn)信息分析 根據(jù)篩選條件，將毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入HT Docking 數(shù)據(jù)庫中，最終得到毛蘭素2D 結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的101 種人源潛在靶蛋白，見表1。

表1 毛蘭素預(yù)測靶點(diǎn)信息

表1（續(xù)）

2.2 毛蘭素作用靶點(diǎn)相關(guān)通路富集分析 運(yùn)用Cytoscape 軟件對將上述靶蛋白對應(yīng)的基因信息進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示毛蘭素直接作用靶點(diǎn)參與13 條腫瘤相關(guān)通路，包括腫瘤通路、膠質(zhì)瘤通路、前列腺癌通路、膀胱癌通路、胃癌通路、結(jié)直腸癌通路、胰腺癌通路、非小細(xì)胞肺癌通路、子宮內(nèi)膜癌通路、癌癥蛋白聚糖通路、癌癥中心碳代謝通路、癌癥膽堿代謝通路及急性髓性白血病通路，見表2、圖1。

圖1 毛蘭素作用靶點(diǎn)KEGG 信號通路富集圖

表2 毛蘭素作用靶點(diǎn)KEGG 通路富集的基因情況

2.3 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析 蛋白之間相互作用主要通過基因相關(guān)性、共享蛋白域、物理相關(guān)性、共定位、預(yù)測、蛋白共表達(dá)及通路表現(xiàn)出來。將毛蘭素作用靶點(diǎn)信息上傳至蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站GeneMANIA，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，其中基因相關(guān)性占30.45%、預(yù)測占26.99%、共享蛋白域占15.69%、物理相關(guān)性占11.58%、共定位占5.99%、蛋白共表達(dá)占5.14%、通路占4.15%，見圖2。

圖2 毛蘭素靶點(diǎn)蛋白交互作用圖

3 討論

中藥單體一直是新藥研發(fā)的重要來源，尤其在腫瘤藥物研發(fā)方面。盡管近年來大量相關(guān)研究證實(shí)中藥單體具有廣泛的藥理學(xué)和生物學(xué)活性，但如何快捷有效地尋找其潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制成為廣大研究者們的困擾。中藥往往具備多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)的藥理特性，目前雖然已有基因芯片等技術(shù)應(yīng)用于中藥靶點(diǎn)的篩選研究，但由于其價(jià)格相對較高且周期較長，在一定程度上限制了其在中藥研究中的應(yīng)用。然而，隨著生物醫(yī)學(xué)公共數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展完善，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，其為闡明中藥單體及復(fù)方的作用機(jī)制開辟了一條新途徑[9-12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，其主要是針對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行綜合分析，并選取特定的信號節(jié)點(diǎn)，從而進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)[13-16]。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行分析，不僅能夠了解中藥單體在不同疾病中的作用，而且也能了解其在同一種疾病中的多種作用機(jī)制，這大大節(jié)省了前期研究成本及時(shí)間。

近年來研究表明毛蘭素具有一定的抗腫瘤作用。Zhu Q 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素能通過線粒體凋亡途徑和JNK 途徑抑制膀胱癌細(xì)胞的生長。Liu YT等[2]研究報(bào)道，毛蘭素能通過ERK 途徑誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡。Zhang H 等[3]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛蘭素能抑制肺癌細(xì)胞的增殖，并將其細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期。同時(shí)，Li M 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素能夠阻止宮頸癌HeLa 細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡和阻止其細(xì)胞周期于G2/M 期。Wang Y 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素能通過HRAS/PI3K/AKT 信號通路抑制胃癌的癌前病變進(jìn)展。Sun Y 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長并促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用。Zhang X 等[20]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毛蘭素具有抗肝癌的作用，其機(jī)制主要與毛蘭素對氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體凋亡和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對毛蘭素的潛在靶蛋白進(jìn)行了虛擬篩選，結(jié)果顯示毛蘭素潛在作用靶蛋白共101 個(gè)。同時(shí)，進(jìn)一步探討了其KEGG 通路，其中有13 條通路與腫瘤相關(guān)。蛋白之間相互作用主要通過基因相關(guān)性、共享蛋白域、物理相關(guān)性、共定位、預(yù)測、蛋白共表達(dá)及通路表現(xiàn)出來。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，基因相關(guān)性占30.45%、預(yù)測占26.99%、共享蛋白域占15.69%、物理相關(guān)性占11.58%、共定位占5.99%、蛋白共表達(dá)占5.14%、通路占4.15%，表明毛蘭素是一個(gè)潛在的通過多靶點(diǎn)治療多種腫瘤的新的中藥單體，其中AKT1 作為一種致癌基因，是AKT家族中的重要成員之一，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)過程中起著重要作用。而CDK6 作為一種調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的演進(jìn)過程密切相關(guān)。本研究結(jié)果為后續(xù)毛蘭素抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究提供了理論參考和指導(dǎo)方向。

綜上所述，毛蘭素通過AKT1、CDK6、AR、BRAF、CSF1R、DAPK1 等靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，這些靶點(diǎn)參與13 條腫瘤相關(guān)通路，本研究為進(jìn)一步深入探討毛蘭素抗腫瘤作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。