呂好新，趙玲麗，霍珊珊，王若蘭

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州 450001）

花生 （Arachis hypogaea Linn.） 屬于豆科植物，原名落花生，是我國重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物。我國是世界上最大的花生生產(chǎn)國，2018年花生的種植面積在我國油料作物中居第2 位，為462 萬hm，總產(chǎn)量達(dá)1 733.2 萬t[1]?；ㄉ臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，富含脂肪和蛋白質(zhì)，且花生中的不飽和脂肪酸易被人體吸收，是我國重要的食用植物油和植物蛋白資源[2-3]。然而，花生在種植、收獲、運(yùn)輸及貯藏過程中極易受到霉菌的污染[4]，尤其是在收獲后儲(chǔ)存不當(dāng)，霉菌的繁殖會(huì)對(duì)花生品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)和脂肪含量下降，游離脂肪酸含量增加以及發(fā)芽率降低等[5]。此外，霉變的花生所含的真菌毒素會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生極大的威脅[6]。在貯藏期間，尋找安全有效的方法抑制花生上的優(yōu)勢(shì)霉菌繁殖，對(duì)于保持花生的品質(zhì)極其重要。目前，生產(chǎn)上多采用化學(xué)試劑熏蒸法對(duì)花生進(jìn)行防霉處理[7]，然而，由于化學(xué)藥劑對(duì)人類健康和環(huán)境的危害較大，因此尋找綠色安全的防霉劑顯得尤為迫切。

植物精油（essential oils，EOs）是一類從植物中提取的次生代謝物質(zhì)，因具有抑菌、殺蟲、抗氧化活性高，且易于生物降解等特點(diǎn)，近些年來在食品防腐保鮮、飼料添加劑、醫(yī)藥等方面有著廣泛應(yīng)用[8-10]。大量研究表明，植物精油對(duì)于水果、糧食收獲后攜帶的腐敗霉菌有較強(qiáng)的抑制作用，是一種非常有潛力的防霉劑[4，11-13]。然而，不同精油的抑菌成分不同，對(duì)各類霉菌的抑制作用也有所差別[11]。將不同精油按照一定的比例混合配制，研究復(fù)合精油的防霉效果具有重要意義。

本試驗(yàn)從發(fā)霉花生上分離出優(yōu)勢(shì)霉菌，通過形態(tài)學(xué)特征，并且結(jié)合18S rRNA 基因序列分析，對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌進(jìn)行鑒定。利用抑菌圈試驗(yàn)研究肉桂、山蒼子、丁香、香茅及百里香等5 種植物精油對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌的單一及復(fù)合抑菌效果。通過掃描電鏡觀察精油對(duì)霉菌BQM 菌絲結(jié)構(gòu)的影響，預(yù)測(cè)復(fù)合植物精油的防霉機(jī)理。本文旨在研究植物精油對(duì)花生貯藏期間優(yōu)勢(shì)霉菌的抑制作用，為花生貯藏過程中優(yōu)勢(shì)霉菌的綠色防治提供理論依據(jù)，為花生復(fù)合精油防霉劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

花生樣品，由河南正陽農(nóng)戶提供的2019年新收獲的花生，初始水分為5%。

肉桂、山蒼子、丁香、香茅和百里香等5 種植物精油，吉安市中香植物有限公司，保存在4 ℃冰箱中，備用。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Potato Dextrose Broth，PDB），青島海博公司；Tween-20，北京索萊寶科技有限公司，常溫下備用。所用試劑均為分析純級(jí)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

UB203i 正置生物顯微鏡，重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；Quanta 250 FEG 掃描電子顯微鏡，美國FEI 公司；HWS 恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；SW-CJ-2D 型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；MVS-1 旋渦混合器，北京金北德工貿(mào)有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-18MS 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心儀器有限公司；TOPT-10D 真空冷凍干燥機(jī)，西安特普訊儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 優(yōu)勢(shì)霉菌的分離純化 利用調(diào)水公式[14]將花生仁水分含量調(diào)至9.7%，然后將500 g 花生仁裝入密封袋中，室溫下過夜放置，平衡水分。接著將花生仁密封袋放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏至花生仁發(fā)生霉變。待花生仁霉變后，稱取25 g 霉變花生于225 g 無菌水中，充分混勻后形成菌懸液，將菌懸液依次稀釋為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5等濃度梯度，用移液槍吸取100 μL 10-1，10-3和10-5菌懸液稀釋液，并分別將其均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)3 d，從PDA 培養(yǎng)基上挑取單菌落接種于新鮮的PDA 培養(yǎng)基上，反復(fù)培養(yǎng)數(shù)代至平板內(nèi)霉菌菌落形態(tài)一致，視為純培養(yǎng)霉菌。本試驗(yàn)選取分離自霉變花生的優(yōu)勢(shì)霉菌菌株作為研究對(duì)象，將其命名為BQM。將純化后的菌株BQM 接種在新鮮的PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)5 d，用無菌水沖洗霉菌BQM，在渦旋儀上充分混勻后，采用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，將BQM 的孢子液濃度調(diào)為5×105～6×105CFU/mL 備用。

1.3.2 菌株BQM 形態(tài)鑒定 按GB/T 4789.16-2016 方法進(jìn)行操作[15]，將菌株BQM 點(diǎn)種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)，觀察記錄菌落的形態(tài)、顏色。

1.3.3 菌株BQM 的18S rRNA 基因序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 提取菌株BQM 的總DNA，用真菌通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4 （TCCTCCGCTTATTGATATGC） 進(jìn)行18S rRNA 基因片段擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。18S rRNA 基因序列通過NCBI-BLAST 網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)分析，搜索同源性較高的已知序列，用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。將泡盛曲霉（Aspergillus awamori）CBS112.52 作為外圍菌株。菌株BQM 的18S rRNA 基因序列已經(jīng)提交至NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），登錄番號(hào)為MT903388。

1.3.4 植物精油對(duì)霉菌BQM 的抑菌活性測(cè)定植物精油對(duì)霉菌的抑菌活性通過抑菌圈試驗(yàn)來評(píng)價(jià)，使用打孔法測(cè)定抑菌圈直徑。將植物精油溶于1%的Tween-20 溶液得到試驗(yàn)所需體積濃度的精油溶液。在無菌操作臺(tái)內(nèi)，吸取100 μL 孢子液至充分冷卻凝固的PDA 培養(yǎng)基上，用三角玻璃涂布棒均勻涂布。用打孔器在含菌平板中央打取直徑為7 mm 的圓孔，加入一定濃度的精油溶液100 μL。所有平板在室溫下靜置1 h，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑并進(jìn)行拍照。對(duì)照組（0 μL/mL） 加入等量的1%的Tween-20 溶液。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)[17]：抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑在10～20 mm 為中度敏感；抑菌圈直徑在7～10 mm 為低度敏感。

1.3.5 最小抑菌濃度 （Minimum Inhibitory Concentration，MIC）測(cè)定 復(fù)合精油對(duì)霉菌MIC 的測(cè)定通過瓊脂稀釋法來確定，方法略有修改[18-19]。在大約60 ℃的PDA 培養(yǎng)基中迅速加入一定體積的植物精油（用1%的Tween-20 稀釋）后立即混勻，使得培養(yǎng)基內(nèi)精油的終濃度為0.0325～4 μL/mL。隨后將20 mL 含有精油的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，待培養(yǎng)基充分冷卻凝固后，吸取100 μL 孢子液至固體培養(yǎng)基上，使用涂布棒均勻涂布。將所用平板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，以無肉眼可見菌落生長(zhǎng)的精油濃度為該精油對(duì)霉菌的MIC 值。

以分級(jí)抑菌濃度指數(shù) （Fractional Inhibitory Concentration，F(xiàn)IC）作為聯(lián)合抗菌試驗(yàn)效果的判定依據(jù)[20-21]：

FIC 指數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)為：FIC≤0.5 時(shí)，表明兩種精油的抑菌效果具有協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1 時(shí)，表明兩種精油的抑菌效果具有相加作用；1＜FIC≤2時(shí)，表明兩種精油的抑菌效果無關(guān)；FIC 指數(shù)＞2時(shí)，表明兩種精油的抑菌效果具有拮抗作用。

1.3.6 復(fù)合精油對(duì)霉菌BQM 菌絲結(jié)構(gòu)的影響根據(jù)袁康等[22]和張忠等[23]的方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。將霉菌孢子液倒入PDB 培養(yǎng)液中，置于28 ℃，150 r/min 搖床內(nèi)培養(yǎng)2 d，分別加入0，0.125，0.25 μL/mL 的復(fù)合精油繼續(xù)培養(yǎng)1 d 后，在4 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min 收集菌絲體。用無菌PBS 緩沖液反復(fù)沖洗菌絲體3 次，用2.5%的戊二醛固定過夜，離心去上清后，用無菌PBS 緩沖液反復(fù)漂洗3 次，每次10 min，再用無菌純水清洗2 次。依次用30%，50%，70%，90%乙醇脫水10 min，用100%乙醇脫水15 min；用叔丁醇∶乙醇=1∶1，2∶1 脫水10 min，用100%叔丁醇置換兩次，最后得到叔丁醇菌液。-80 ℃預(yù)凍2 h，進(jìn)行冷凍干燥。干燥后的樣品噴金處理，在掃描電鏡下觀察樣品并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件處理，用Duncan's 法進(jìn)行多重顯著性分析和標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生中優(yōu)勢(shì)霉菌菌株BQM 鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征 由圖1a 和1b 可知，霉菌菌株BQM 的菌落在PDA 固體培養(yǎng)基上呈圓形，邊緣規(guī)則。菌落初期為白色，有淺黃色區(qū)域，厚絨狀；成熟后為黑色，菌落邊緣規(guī)則，且有白色絨毛，其背面中央部位略帶黃褐色。這些形態(tài)特征與蔡靜平[24]在《糧油食品微生物學(xué)》中對(duì)黑曲霉的描述一致，因此初步判定霉菌菌株BQM 為黑曲霉。

圖1 菌株形態(tài)特征（PDA 培養(yǎng)基）Fig.1 Morphological characteristics of the strain（in PDA medium）

2.1.2 基于18S rRNA 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 將霉菌BQM 的18S rRNA 基因序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫，通過BLAST 比對(duì)，尋找與BQM具有最大相似度的序列，根據(jù)neighbour-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示，霉菌BQM 被鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖2 霉菌BQM 基于18S rRNA 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of BQM based on 18S rRNA gene

2.2 5 種植物精油對(duì)霉菌BQM 的抑菌效果分析

2.2.1 單一植物精油對(duì)霉菌BQM 的抑菌效果 5種精油單獨(dú)作用于霉菌BQM 的抑制效果如圖3a和3b 所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，5 種植物精油均能單獨(dú)抑制BQM 生長(zhǎng)，且隨著濃度的增加，抑菌圈直徑呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。當(dāng)精油濃度為60 μL/mL 時(shí)，肉桂、山蒼子、丁香精油對(duì)BQM 的抑菌圈直徑均大于20 mm，說明此時(shí)BQM 對(duì)肉桂、山蒼子、丁香精油高度敏感；而百里香精油和香茅精油對(duì)BQM 的的抑菌圈直徑在10～20 mm 之間，說明此時(shí)BQM對(duì)這兩種精油均表現(xiàn)為中度敏感。

由圖3a 和3b 可知，肉桂精油在濃度10～60 μL/mL 時(shí)，抑菌圈直徑都大于20 mm，這是因?yàn)槿夤鹁偷闹饕志煞秩夤鹑┯袕?qiáng)烈的抗真菌活性，且揮發(fā)性較低，顯示出穩(wěn)定持久的抑菌特點(diǎn)；山蒼子精油對(duì)BQM 具有很強(qiáng)的抑制效果，這是因?yàn)樯缴n子精油的主要抑菌成分檸檬醛具有很強(qiáng)且廣泛的抗真菌作用，有研究證明檸檬醛通過影響線粒體功能來抑制微生物生長(zhǎng)[25]；丁香精油對(duì)BQM 也有明顯的抑制效果，Jahani 等[26]的試驗(yàn)也證明了丁香精油對(duì)黑曲霉具有強(qiáng)烈的抑制效果，并發(fā)現(xiàn)丁香精油通過影響細(xì)胞能量代謝來影響真菌的生理活性。

圖3 5 種植物精油對(duì)霉菌BQM 的抑菌效果Fig.3 The antifungal activity of five essential oils against BQM

2.2.2 不同復(fù)合精油對(duì)霉菌BQM 的抑菌效果根據(jù)圖3可知，肉桂、山蒼子和丁香精油對(duì)BQM的抑菌效果較好，將這3 種精油以不同的混合方式（兩兩混合或全部混合）進(jìn)行等體積混合，使復(fù)合精油的濃度為60 μL/mL，通過抑菌圈試驗(yàn)來測(cè)定不同組合的復(fù)合精油對(duì)BQM 的抑菌效果。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在所有復(fù)合精油中，肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)BQM 的抑菌效果最佳，其抑菌圈直徑為39.8 mm，顯著高于其它復(fù)合精油的抑菌圈直徑（P＜0.05）；山蒼子-丁香復(fù)合精油在所有復(fù)合精油中抑菌圈直徑最小，為22.3 mm，比丁香精油單獨(dú)使用時(shí)略大，但兩者之間差異不顯著。唐雅珂[27]的研究也證明，肉桂和山蒼子精油（不稀釋）等體積復(fù)合使用后，對(duì)大米中的黑曲霉顯示出很強(qiáng)的抑制效果。

圖4 不同復(fù)合精油對(duì)霉菌BQM 的抑制效果Fig.4 The antifungal activity of various mixed essential oils against BQM

2.2.3 肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)霉菌BQM 的MIC值的測(cè)定 根據(jù)圖4可知，肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)BQM 的抑菌效果最好，因此，本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法測(cè)定肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)BQM 的MIC值。從表1可以得知，肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)BQM 的MIC 值為0.125 μL/mL，說明肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)BQM 有很好的抑制效果；肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)BQM 的FIC 值為0.75，介于0.5～1之間，說明肉桂精油和山蒼子精油的抑菌效果有復(fù)合相加作用[28]，表明肉桂與山蒼子精油等比例復(fù)配使用對(duì)BQM 的抑菌效果比二者單獨(dú)使用的效果好。

表1 不同含量的肉桂-山蒼子復(fù)合植物精油對(duì)霉菌BQM 的生長(zhǎng)抑制情況Table 1 The inhibitory effects of various cinnamon-litsea cubeba mixed oils on the growth of BQM

2.2.4 肉桂-山蒼子復(fù)合植物精油最佳配比的確定 根據(jù)圖4以及聯(lián)合抗菌試驗(yàn)結(jié)果可知，肉桂精油和山蒼子精油在等體積混合后對(duì)BQM 有很好的抑菌效果，為進(jìn)一步探索復(fù)合精油中兩種精油的最佳比例，以肉桂精油和山蒼子精油為原料，按照不同比例混合進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。結(jié)果如圖5所示，V肉桂精油∶V山蒼子精油=3∶5 時(shí)，抑菌圈直徑最大，為45.3 mm，顯著高于其它配比的復(fù)合精油的抑菌圈直徑（P＜0.05），說明此配比的復(fù)合精油對(duì)BQM 具有最佳抑制效果。抑菌圈直徑達(dá)到最大值后，隨著山蒼子精油占比的減小，抑菌圈直徑也在不斷減小，最后趨于穩(wěn)定，故推測(cè)兩種精油在協(xié)同抑菌時(shí)以山蒼子精油的作用為主導(dǎo)[17]。

圖5 不同體積比的肉桂精油和山蒼子精油配制成的肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)BQM 的抑制效果Fig.5 The antifungal effect of various mixed essential oils composed of cinnamon oil and litsea cubeba oil on BQM

2.3 肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)霉菌BQM 菌絲結(jié)構(gòu)的影響

如圖6所示，圖6a、6b 和6c 分別是掃描電鏡下觀察到的經(jīng)過0，0.125 和0.25 μL/mL 肉桂-山蒼子復(fù)合植物精油（V肉桂精油∶V山蒼子精油=3∶5）處理的霉菌BQM 菌絲結(jié)構(gòu)。由圖6a 可知，未經(jīng)肉桂-山蒼子復(fù)合精油處理的菌絲體能夠正常生長(zhǎng)，菌絲結(jié)構(gòu)完整飽滿，粗細(xì)均勻；由圖6b 所示，經(jīng)0.125 μL/mL 肉桂-山蒼子復(fù)合精油處理的菌絲體發(fā)生變形，菌絲表面出現(xiàn)明顯的干癟與皺縮；圖6c顯示，經(jīng)0.25 μL/mL 肉桂-山蒼子復(fù)合精油處理后，菌絲體除了出現(xiàn)嚴(yán)重的變形外，還受到嚴(yán)重的損傷，菌絲體表面出現(xiàn)大量的孔洞。這可能是因?yàn)橹参锞屯ㄟ^靶向作用于細(xì)胞膜上關(guān)鍵成分，破壞了霉菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，提高膜滲透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物和重要離子流失，從而達(dá)到抑菌效果[29-30]。

圖6 掃描電鏡下經(jīng)不同濃度的肉桂-山蒼子復(fù)合植物精油處理的BQM 菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.6 Scanning electron micrographs of BQM mycelia treated with different concentration of cinnamon-litsea cubeba mixed oils

3 結(jié)論

本研究所選的5 種植物精油對(duì)霉變花生優(yōu)勢(shì)霉菌BQM 單獨(dú)作用時(shí)，肉桂和山蒼子精油對(duì)黑曲霉BQM 的抑制效果最好，丁香精油次之；在等體積配比的精油組合中，肉桂-山蒼子復(fù)合精油的抑菌效果最佳，且FIC 值為0.75，即兩者復(fù)合后對(duì)黑曲霉BQM 的抑制有相加作用；當(dāng)V肉桂精油∶V山蒼子精油=3∶5 時(shí)，肉桂-山蒼子復(fù)合精油的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑達(dá)到45.3 mm。掃描電鏡結(jié)果顯示經(jīng)過肉桂-山蒼子復(fù)合精油處理后的黑曲霉BQM 菌絲體發(fā)生嚴(yán)重的變形及損傷。據(jù)此推測(cè)，肉桂-山蒼子復(fù)合精油對(duì)黑曲霉菌BQM 的作用主要是通過破壞其菌絲體結(jié)構(gòu)而達(dá)到抑菌效果的。因此，肉桂-山蒼子復(fù)合精油有望成為花生霉變的抑制劑，應(yīng)用于花生的貯藏中。