尚智援 竇彩霞 王克瑋 劉雪姣 李海花 喬家運*

(1.天津師范大學生命科學學院，天津市動物多樣性保護與利用重點實驗室，天津 300387；2.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

細胞和組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生是由于其細胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量。氧化應(yīng)激可以破壞腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，是腸損傷發(fā)生的關(guān)鍵因素[1]。應(yīng)激可誘導(dǎo)腸細胞產(chǎn)生大量ROS代謝物，影響細胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)穩(wěn)定性，增加細胞凋亡，導(dǎo)致腸黏膜損傷[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，斷奶會破壞仔豬機體的氧化平衡，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[3]，致使斷奶仔豬小腸細胞周期阻滯和細胞凋亡[4-5]。氧化應(yīng)激已被證實參與腸道屏障功能障礙和各種消化道疾病的發(fā)生，其對腸道形態(tài)的不良影響還伴隨著緊密連接蛋白表達的下調(diào)[6]。豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis，SC)屬于革蘭氏陰性菌，作為一種人畜共患病原體可以侵入宿主并導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生，并且耐藥性沙門氏菌等在疾病中出現(xiàn)的概率增加[7]。當SC侵入腸道黏膜后，通過分泌免疫球蛋白A(IgA)、抗菌肽和消化酶等逃避宿主腸腔防御機制[8]。沙門氏菌黏附在上皮細胞的表面后，通過介導(dǎo)內(nèi)吞作用侵入腸上皮的M細胞、上皮細胞和樹突狀細胞等非吞噬性腸細胞[9]，并且在病原體繁殖時產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，內(nèi)毒素作用于白細胞進而引起炎癥、氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機體高燒和腹瀉。有研究表明，沙門氏菌黏附到腸上皮細胞后，宿主防御機制被激活，這種早期促炎狀態(tài)可以通過激活微生物特異性Toll樣受體(TLRs)來啟動，TLRs激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依賴性信號通路[10]。

核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路是細胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激通路之一，在氧化應(yīng)激條件下，細胞核中Nrf2積聚，Nrf2與ARE結(jié)合后啟動下游一系列保護性基因的表達，如谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)等[11]。有研究表明，p38 MAPK可以將Nrf2中的3個絲氨酸殘基(Ser215、Ser408和Ser577)磷酸化，這促進了Nrf2核積累的減少[12-13]。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum，CB)是一種革蘭氏陽性菌，存在于人和動物胃腸道中[14]。據(jù)報道，CB能夠改善腸道環(huán)境、促進宿主健康[14]，其作用機制主要包括：1)在腸道內(nèi)通過發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸、B族維生素、多種消化酶等益生物質(zhì)，為腸道上皮細胞提供能量，促進腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收[15-16]；2)通過與致病菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)及黏膜定植位點，阻止病原菌生長與定植[17]；3)通過調(diào)節(jié)腸道微生物及其代謝產(chǎn)物(如丁酸、乙酸、丙酸)，降低腸道pH，保護腸道免受致病菌感染[18-20]；4)通過TLRs介導(dǎo)的免疫信號通路調(diào)控免疫細胞分泌促炎細胞因子(如白細胞介素-6)和抑炎細胞因子(如白細胞介素-10)，提高機體免疫力[21-22]。此外，有研究表明，CB能促進小鼠機體中Nrf2的表達，緩解氧化應(yīng)激[23]。但CB能否緩解SC對機體造成的影響尚不清晰，因此，本研究以豬小腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)為模型，以p38 MAPK和Nrf2信號通路為切入點，探究CB緩解SC導(dǎo)致氧化損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和細胞

SC來自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，保存于天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院實驗室。CB為健康仔豬糞便中分離菌株，已通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色和16S rDNA核苷酸序列確定其為CB。試驗前，將活化的SC接種到營養(yǎng)肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h；將活化的CB接種到液體強化梭菌培養(yǎng)基(RCM)，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h；以菌液：甘油(體積比1∶1)保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)試驗。分別用營養(yǎng)瓊脂和瓊脂RCM對SC和CB進行活菌計數(shù)。

IPEC-J2細胞購買于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的條件下，用含89% RPMI Medium 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清(BSA)和1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2 試驗試劑

RPMI Medium 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)消化液均購于美國Gibco公司。青鏈霉素和二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶生物公司。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM購自美國Invitrogen公司。細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自東仁化學科技有限公司。丙二醛(MDA)、GPX和SOD酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒均購自美國Gene Copoeia公司?？筽38 MAPK抗體購買于美國Cell Signaling Technology公司?？筃rf2抗體和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 試驗1：SC適宜劑量選擇

將濃度為1×104個/mL的IPEC-J2細胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后進行以下處理，即分為對照組(添加100 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、SC1組(添加1×101CFU/mL SC)、SC2組(添加1×102CFU/mL SC)、SC3組(添加1×103CFU/mL SC)和SC4組(添加1×104CFU/mL SC)，每組3個重復(fù)。分別培養(yǎng)3、6、12、18和24 h后，檢測細胞活力及培養(yǎng)上清液中SOD、GPX活性和MDA含量。

1.3.2 試驗2：CB對SC感染IPEC-J2細胞后p38 MAPK/Nrf2信號通路活化的影響

將濃度為1×105個/mL的IPEC-J2細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板，做不同處理。CB選用感染復(fù)數(shù)(MOI)為50、孵育時間為3 h進行后續(xù)試驗[24]。試驗分為3組，即對照組(添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、SC組(添加1×103CFU/mL SC)和CB+SC組(CB孵育3 h和添加1×103CFU/mL SC)，每組3個重復(fù)。待SC分別處理3、6、12和24 h后收集細胞并裂解，檢測細胞中Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1、GPX2和GAPDHmRNA相對表達量，并在SC處理12 h后檢測細胞中Nrf2和p38 MAPK蛋白相對表達量。

1.3.3 試驗3：Nrf2信號通路在CB影響SC感染IPEC-J2細胞氧化損傷中的作用

豬Nrf2的小干擾RNA(siRNA)序列：正向5′-GCCCAUGAUGUCUCUGUTT-3′，反向5′-AUCAGAGAUGAUGGCTT-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。在進行試驗之前，以Nrf2非特異性siRNA作為陰性對照(NC)，檢測了Nrf2特異性siRNA的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)Nrf2非特異性siRNA對Nrf2的表達沒有影響，而Nrf2特異性siRNA能夠顯著下調(diào)Nrf2的表達，因此，可以采用Nrf2特異性siRNA進行后續(xù)細胞轉(zhuǎn)染試驗。將濃度為1×105個/mL的IPEC-J2細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板，試驗分為7組，即對照組(添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、NC組(Nrf2非特異性siRNA單獨處理細胞6 h)、siRNA組(siRNA單獨處理細胞6 h)、NC+SC組(先進行Nrf2非特異性siRNA處理細胞6 h，再進行1×103CFU/mL SC處理細胞12 h)、siRNA+SC組(先進行siRNA處理細胞6 h，再進行1×103CFU/mL SC處理細胞12 h)、NC+CB+SC組(先進行Nrf2非特異性siRNA處理細胞6 h，再進行CB孵育3 h，最后進行1×103CFU/mL SC處理細胞12 h)和siRNA+CB+SC組(先進行siRNA處理細胞6 h，再進行CB孵育3 h，最后進行1×103CFU/mL SC處理細胞12 h)，每組3個重復(fù)。待SC處理12 h后，收集細胞及其培養(yǎng)上清液，檢測上清液中SOD、GPX活性以及細胞中SOD1、SOD2、GPX1、GPX2和Nrf2 mRNA相對表達量。

1.3.4 試驗4：p38 MAPK信號通路在CB影響SC感染IPEC-J2細胞氧化損傷中的作用

用DMSO溶解SB-203580(p38 MAPK抑制劑)，制備終濃度為50 μmol/L的p38 MAPK抑制劑。將IPEC-J2細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，試驗分為7組，即對照組(添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、DMSO組(50 μmol/L DMSO處理細胞1 h)、p38組(p38 MAPK抑制劑處理細胞1 h)、DMSO+SC組(50 μmol/L DMSO處理細胞1 h后再用SC感染細胞12 h)、p38+SC組(p38 MAPK抑制劑處理細胞1 h后再用SC感染細胞12 h)、DMSO+CB+SC組(50 μmol/L DMSO處理細胞1 h后，CB孵育細胞3 h，SC感染細胞12 h)和p38+CB+SC組(p38 MAPK抑制劑處理細胞1 h后，CB孵育細胞3 h，SC感染細胞12 h)，每組3個重復(fù)。待SC處理12 h后，收集細胞及培養(yǎng)上清液，檢測上清液中SOD、GPX活性以及細胞中p38MAPK、SOD1、SOD2、GPX1、GPX2和Nrf2的mRNA相對表達量。

1.4 細胞活力分析

細胞在培養(yǎng)特定時間后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，每孔加入90 μL RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10 μL CCK-8孵育2 h，用酶標儀檢測波長為450 nm的吸光度并計算細胞活力。

1.5 細胞培養(yǎng)上清中GPX、SOD活性和MDA含量檢測

嚴格按照制造商說明書要求分別檢測培養(yǎng)上清液中SOD、GPX活性和MDA含量。

1.6 RT-qPCR

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.7 蛋白印跡法(Western blotting)

將細胞裂解后，與上樣緩沖液充分混勻，煮沸10 min，獲得蛋白樣品，采用蛋白定量法測定蛋白總量。運用12%變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，參照Qiao等[31]的方法進行Western blotting試驗。運用Image軟件來檢測相關(guān)蛋白的灰度值(相對灰度值=相關(guān)蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值)，檢測Nrf2、p38 MAPK和GAPDH蛋白相對表達量。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗結(jié)果使用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行初步處理，采用SPSS 20.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并通過Graphpad Prism 7.0軟件制作柱形圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SC適宜劑量選擇

由圖1可知，同一處理時間，與對照組相比，其他各組細胞活力均顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性。在SC處理3 h后，與SC2組相比，SC1組和SC3組細胞活力沒有顯著差異(P>0.05)；SC4組細胞活力顯著低于SC1組和SC2組(P<0.05)。在SC處理12 h后，SC2組和SC3組細胞活力沒有顯著差異(P>0.05)，且與SC1組和SC4組存在極顯著差異(P<0.01)。在SC處理6、18和24 h后，SC1組、SC2組、SC3組和SC4組之間細胞活力均存在顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。相同濃度的SC，隨處理時間的延長，細胞活力呈現(xiàn)下降趨勢。細胞培養(yǎng)上清液檢測結(jié)果表明，不同濃度的SC在同一處理時間內(nèi)，與對照組相比，隨著SC濃度的增加，MDA含量(3 h的SC1組除外)均呈顯著或極顯著上升(P<0.05，P<0.01)，抗氧化酶SOD、GPX活性呈極顯著下降(P<0.01)，并且每個時間點SC4組MDA含量最多，SOD、GPX活性最低。相同濃度的SC在不同處理時間內(nèi)，MDA含量增加，SOD、GPX活性降低，且均呈時間依賴性。試驗結(jié)果表明，SC3組細胞活力顯著降低，且在此濃度長時間處理細胞后對細胞損傷較小。因此，選擇1×103CFU/mL作為SC的適宜劑量進行后續(xù)試驗。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.圖1 SC適宜劑量選擇Fig.1 SC Appropriate dose selection

2.2 CB對SC感染IPEC-J2細胞后p38 MAPK/Nrf2信號通路活化的影響

由圖2可知，SC處理細胞3 h后，與對照組相比，SC組Nrf2和GPX1的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，GPX2的mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)，然而SOD1和SOD2的mRNA相對表達量沒有顯著變化(P>0.05)；與SC組相比，CB+SC組的SOD1和SOD2的mRNA相對表達量沒有顯著變化(P>0.05)，Nrf2和GPX1的mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)，GPX2的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)。SC處理細胞6 h后，與對照組相比，SC組除SOD1的mRNA相對表達量沒有顯著變化(P>0.05)，其他基因的相對表達量均極顯著降低(P<0.01)；與SC組相比，CB+SC組Nrf2、SOD2和GPX2的mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)，SOD1和GPX1的mRNA相對表達量沒有顯著變化(P>0.05)。SC處理細胞12和24 h后，與對照組相比，SC組Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對表達量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與SC組相比，CB+SC組Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)。此外，Western blotting結(jié)果顯示，SC處理細胞12 h后，與對照組相比，SC組Nrf2和p38 MAPK蛋白相對表達量極顯著降低(P<0.01)；與SC組相比，CB+SC組Nrf2和p38 MAPK蛋白相對表達量極顯著升高(P<0.01)。試驗結(jié)果表明，與SC組相比，CB+SC組Nrf2及其下游基因在12 h后的mRNA相對表達量均極顯著升高，CB預(yù)處理能緩解SC誘導(dǎo)的細胞內(nèi)抗氧化酶mRNA相對表達量的降低。因此，選用12 h作為SC處理細胞的時間點，進行后續(xù)試驗。

Nrf2：核因子E2相關(guān)因子 NF-E2-related factor 2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；p38 MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶 p38 mitogen activated protein kinase。圖2 CB對SC感染IPEC-J2細胞內(nèi)p38 MAPK/Nrf2信號通路相關(guān)基因表達的影響Fig.2 Effects of CB on expression of genes related to p38 MAPK/Nrf2 signaling pathway in SC-infected IPEC-J2 cells

2.3 驗證Nrf2信號通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞氧化損傷中的積極作用

用siRNA沉默IPEC-J2細胞中Nrf2的表達，采用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性，RT-qPCR方法檢測細胞中Nrf2及其下游基因的mRNA相對表達量，以此確定CB調(diào)控致病菌感染引起的IPEC-J2細胞氧化損傷是否與Nrf2信號通路的活化有關(guān)。由表2和圖3可知，與對照組相比，NC組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細胞中Nrf2、SOD1、SOD2和GPX1的mRNA相對表達量均無顯著變化(P>0.05)，NC+SC組和siRNA+SC組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對表達量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與NC+SC組相比，siRNA+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細胞中Nrf2、SOD1、GPX1和GPX2的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)；NC+CB+SC組培養(yǎng)上清液中SOD活性極顯著降低(P<0.01)，GPX活性極顯著升高(P<0.01)，細胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)；siRNA+CB+SC組僅GPX2的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。與siRNA+SC組相比，NC+CB+SC和siRNA+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，并且與siRNA+CB+SC組相比，NC+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細胞中Nrf2、SOD1、GPX1和GPX2均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。試驗結(jié)果表明，Nrf2信號通路的下調(diào)在一定程度上加重了SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞氧化損傷，CB可通過上調(diào)Nrf2信號通路緩解這種損傷，且用siRNA沉默Nrf2表達后CB的益生作用會有所降低。

表2 Nrf2信號通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞氧化損傷中的積極作用Table 2 Positive role of Nrf2 signaling pathway in CB alleviating SC-induced oxidative damage in IPEC-J2 cells U/mL

圖3 Nrf2信號通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞氧化損傷中的積極作用Fig.3 Positive role of Nrf2 signaling pathway in CB alleviating SC-induced oxidative damage in IPEC-J2 cells

2.4 p38 MAPK信號通路對SC誘導(dǎo)氧化損傷后Nrf2及其下游基因表達的影響

由圖4可知，與對照組相比，DMSO組p38MAPK的mRNA相對表達量顯著上升(P<0.05)；p38組p38MAPK的mRNA相對表達量顯著下降(P<0.05)，DMSO+SC組和p38+SC組p38MAPK的mRNA相對表達量亦顯著下降(P<0.05)。與DMSO+SC和p38+SC組分別相比，DMSO+CB+SC組和p38+CB+SC組p38MAPK的mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)。試驗結(jié)果表明，CB能上調(diào)SC造成的p38MAPKmRNA相對表達量的下降，并對Nrf2信號通路起到激活作用。

用抑制劑抑制IPEC-J2細胞中p38 MAPK的活化后，采用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性，RT-qPCR方法檢測細胞中Nrf2及其下游抗氧化酶基因的相對表達量來檢測p38 MAPK信號通路對Nrf2信號通路的積極作用。由表3和圖4可知，與對照組相比，DMSO組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對表達量無顯著變化(P>0.05)；p38組、DMSO+SC組和p38+SC組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對表達量均顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)。與DMSO+SC組相比，DMSO+CB+SC組和p38+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細胞中SOD1、GPX1、GPX2和Nrf2的mRNA相對表達量均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，僅DMSO+CB+SC組細胞中SOD2的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。與p38+SC組相比，DMSO+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細胞中SOD2和GPX1的mRNA相對表達量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；p38+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對表達量均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。試驗結(jié)果表明，p38 MAPK信號通路的下調(diào)會造成Nrf2及其下游基因的相對表達量降低，CB可通過上調(diào)p38 MAPK通路緩減SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞氧化損傷。

表3 p38 MAPK信號通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞氧化損傷中的積極作用Table 3 Positive role of p38 MAPK signaling pathway in CB alleviating SC-induced oxidative damage in IPEC-J2 cells U/mL

3 討 論

活性氧(ROS)包括超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)，這些分子主要來源于在線粒體、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中發(fā)生的各種代謝反應(yīng)中消耗的氧氣[32]。細胞內(nèi)ROS水平的調(diào)節(jié)對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，過量的ROS會損害細胞成分，如導(dǎo)致DNA損傷、脂類過氧化水平升高、蛋白質(zhì)損傷等[33]，因此這些損傷的生物大分子可作為氧化應(yīng)激的評估指標，例如MDA就是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是反映氧化損傷的典型參數(shù)[34]。

CB對動物具有多種有益作用，包括緩解氧化應(yīng)激[35]、平衡腸道菌群[36]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[37]、改善神經(jīng)功能缺損[38]等。有研究表明，濃度為5×108CFU/mL的CB預(yù)處理可降低不同胃潰瘍模型小鼠血清中MDA含量，提高胃組織中SOD和過氧化氫酶(CAT)活性[39]。四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷后，小鼠肝臟中MDA含量增加，CB預(yù)處理后增加了肝臟中SOD和CAT活性，并降低了MDA含量，另外還增加了Nrf2含量[23,35]。本試驗通過檢測p38MAPK、Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1、GPX2的mRNA相對表達量來說明CB對IPEC-J2細胞的保護作用，研究發(fā)現(xiàn)，在SC處理12 h后，CB預(yù)處理能夠顯著提高IPEC-J2細胞p38MAPK、Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對表達量。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因敲除的小鼠更容易受到氧化應(yīng)激導(dǎo)致腫瘤發(fā)生以及加重肥胖帶來的有害影響[40-41]。目前，有關(guān)沉默Nrf2的表達對IPEC-J2細胞影響的研究尚未見報道。本研究用siRNA干擾細胞中Nrf2的表達后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細胞中Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對表達量均顯著降低，加入SC處理細胞后，上清液中抗氧化酶活性和細胞中各基因的mRNA相對表達量均顯著降低，而添加CB后能顯著增加細胞中Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對表達量，表明CB可通過Nrf2信號通路減輕致病菌造成的IPEC-J2細胞損傷。

MAPK在細胞分化、有絲分裂和凋亡等多種細胞活動中發(fā)揮一定作用而受到了廣泛關(guān)注[42]。MAPK信號通路還參與很多生物學過程，如調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和細胞增殖等，與腸上皮屏障功能密切相關(guān)[43]。MAPK信號通路由三級激酶組成，包括絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)、絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)和MAPK，依次被激活，實現(xiàn)信號從細胞表面向細胞核傳遞，誘導(dǎo)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細胞的生長、分化、增殖和炎癥反應(yīng)[44-45]。MAPK通路由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1和ERK2，p38 MAPK，C-Jun氨基末端激酶(JNK)1、JNK2和JNK3，以及ERK5共4種分支組成[45-46]。其中，p38 MAPK信號通路與炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)，是促炎性細胞因子合成的關(guān)鍵調(diào)控路徑[47]。ERK1和ERK2、p38 MAPKs以及JNK1、JNK2和JNK3是研究最廣泛的MAPK[47]。在MAPK中，p38 MAPK參與了一系列的信號通路，這些通路刺激了多種不同的生物功能[48]。p38 MAPK對炎癥細胞因子和ROS等應(yīng)激刺激有反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)磷酸化p38 MAPK蛋白水平在致病菌誘導(dǎo)的斷奶仔豬腹瀉中顯著升高，表明p38 MAPK對致病菌誘導(dǎo)的仔豬腹瀉有重要貢獻[49]。Nrf2啟動抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的活性也受到p38 MAPK的正調(diào)控[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，CB能上調(diào)SC造成的p38MAPK的mRNA相對表達量的下降，并對p38 MAPK信號通路起到激活作用。另外，本研究通過抑制p38MAPK的表達后，檢測p38 MAPK信號通路對Nrf2信號通路的積極作用。試驗結(jié)果表明，p38 MAPK抑制劑單獨處理、DMSO與SC處理和p38 MAPK抑制劑與SC處理均會降低上清液中抗氧化酶的活性以及細胞中Nrf2及其下游基因的mRNA相對表達量，而CB預(yù)處理后上調(diào)致病菌造成的抗氧化基因的mRNA相對表達量降低。這表明p38 MAPK信號通路下調(diào)會造成Nrf2及其下游基因的相對表達量降低，加重SC造成的IPEC-J2細胞氧化損傷，CB可通過上調(diào)p38 MAPK通路緩解這種損傷。

微生物在消化道中定植離不開其細胞壁成分與腸道黏膜之間的相互作用[51]。據(jù)報道，金黃色葡萄球菌細胞壁成分(脂磷壁酸)能夠誘導(dǎo)HT-29細胞炎癥反應(yīng)和凋亡，而CB的脂磷壁酸可以緩解這一現(xiàn)象[52]。Zhao等[53]研究證實了CB可以通過其細胞壁成分和丁酸等代謝物降低Caco-2細胞脂肪的生成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CB能夠通過激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPRs)抑制腸道腫瘤細胞增殖[54]。值得注意的是，丁酸可以通過與其受體(如GPR41、GPR43、GPR109A)結(jié)合來影響腸道內(nèi)多種信號通路[55]。例如，丁酸能夠激活GPR109A，抑制NF-κB信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[56]，并且丁酸在進入細胞后會分解產(chǎn)生氫離子[57]，激活鈉離子(Na+)/氫離子(H+)交換系統(tǒng)，維持細胞內(nèi)外pH穩(wěn)定，抑制病原體增殖，維持腸道微生物平衡[58]；同時H+可以通過與自由基的結(jié)合，增強了機體抗氧化酶的活性，減輕氧化應(yīng)激，提高機體抗氧化能力[59]。以上研究表明，CB發(fā)揮益生作用可能依賴于其細胞壁成分及代謝產(chǎn)物。然而，具體的某種細胞壁成分或代謝產(chǎn)物所具有的益生作用及其機制仍然需要進行更深入的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，CB能夠通過上調(diào)p38MAPK的表達，激活Nrf2信號通路，進而介導(dǎo)下游抗氧化相關(guān)基因的表達，緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細胞氧化損傷。