祝鍇燁 吳秋雪 羅海靜 張偉偉,2* 邵淑麗,2

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾 161006；2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾 161006)

紫云英苷(AG)又名紫云英甙、山柰酚-3-葡萄糖苷、百蕊草素Ⅱ、黃芪苷，分子式為C21H20O11，是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，是多種植物如黃芪、百蕊草、荷葉、杜仲、報(bào)春花、桑樹(shù)葉、蕁麻等的生物活性成分之一[1]。陳金川[2]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷作為生物體中的抗氧化劑，能夠有效清除氧自由基。Qu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷提高了雄性Sprague-Dawley大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)的活性并降低了血清中丙二醛(MDA)的含量。但紫云英苷對(duì)過(guò)量運(yùn)動(dòng)造成的氧化損傷是否有修復(fù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)又名谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶，它能催化L-丙氨酸中的氨基酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，主要存在于肝臟和腎臟中，可參與細(xì)胞氮代謝和肝糖異生，ALT是肝臟中最活躍的轉(zhuǎn)氨酶之一，目前常作為肝臟損傷的標(biāo)志物[4]。超氧陰離子是生物體內(nèi)氧代謝首先形成的自由基，當(dāng)自由基相對(duì)過(guò)剩，會(huì)攻擊生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，進(jìn)而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。大量研究已經(jīng)證實(shí)，生物體內(nèi)本身就具有內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)，具有清除多余自由基的能力，其中包括抗超氧陰離子自由基(ASAFR)[5]。

miRNAs為長(zhǎng)度18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的研究表明miRNAs參與了體內(nèi)的氧化還原過(guò)程，在氧化應(yīng)激的過(guò)程發(fā)揮重要作用，一些miRNAs可以通過(guò)誘導(dǎo)自由基生成或抑制抗氧化過(guò)程來(lái)誘導(dǎo)氧化損傷[6]，其中的miR-155和環(huán)氧化酶(Cox)表達(dá)呈正相關(guān)，其過(guò)表達(dá)生成的自由基是哮喘患者氧化應(yīng)激的主要來(lái)源[7]；miR-155還可以靶向叉頭框蛋白O1(FOXO1)，抑制線(xiàn)粒體自噬，促進(jìn)MPC5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[8]；此外，miR-155表達(dá)增加大鼠原代心肌細(xì)胞活力,抑制H9C2細(xì)胞凋亡,促進(jìn)H9C2細(xì)胞的氧化應(yīng)激[9]。在發(fā)生肝臟疾病時(shí)，miR-155在肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[10]。此外，miR-155表達(dá)升高與急性乙肝患者血清ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性與乙肝e抗原(HBeAg)水平呈正相關(guān)[11]。但紫云英苷能否緩解急性力竭運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的肝臟組織氧化損傷，其抗氧化作用是否與miR-155相關(guān)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以C57BL/6J雄性小鼠為研究對(duì)象，采用急性力竭運(yùn)動(dòng)方法制備小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激模型，研究紫云英苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性、肝臟組織中抗超氧陰離子自由基(ASAFR)活力和miR-155表達(dá)的變化，初步探索紫云英苷抗氧化作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧：48只8周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6J雄性小鼠及基礎(chǔ)飼糧購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，將6只小鼠放在1個(gè)籠子(27 cm×17 cm×13 cm)中。試驗(yàn)開(kāi)始前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周。

主要試劑：純度為98%的紫云英苷購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；ALT和ASAFR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海東洋紡生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物。

儀器設(shè)備：Spark10M多功能酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)、Z32HK高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Hermle，德國(guó))、TH-86-340-LA(-80 ℃)超低溫冰箱(北京天地精儀科技有限公司)、Mastercycler Realplex 4熒光定量PCR儀(Eppendorf，德國(guó))、NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))、電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

將48只8周齡C57BL/6J雄性小鼠在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，基礎(chǔ)飼糧喂養(yǎng)，正常飲水，室溫環(huán)境生存且均做了游泳測(cè)試。一次性力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，二甲基亞砜(DMSO)組、力竭運(yùn)動(dòng)組、50 mg/kg紫云英苷組、100 mg/kg紫云英苷組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只。除DMSO組外，其余3組小鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)4 h；紫云英苷組在力竭運(yùn)動(dòng)后分別灌胃50和100 mg/kg的紫云英苷，力竭運(yùn)動(dòng)組在力竭運(yùn)動(dòng)后灌胃等量生理鹽水，DMSO組灌胃等體積生理鹽水配制的0.1%DMSO。各組小鼠灌注1 h后斷頸處死，取血液，離心制備血清，于冰塊上迅速解剖取肝臟，用預(yù)冷生理鹽水洗去肝臟血漬，濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 抗氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明對(duì)血清和肝臟組織樣品進(jìn)行處理，并測(cè)定血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力。

1.3.2 氧化相關(guān)miRNAs表達(dá)測(cè)定

從-80 ℃冰箱中取出4組小鼠的肝臟組織樣品，各組剪取等量組織，于液氮冷凍研磨后加入Trizol試劑提取總RNA，在NanoDropND-2000C中進(jìn)行RNA定性和定量分析。各組樣品中各取1 μg總RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover說(shuō)明，使用合成的特異性反轉(zhuǎn)錄引物將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以各組反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，選取U6基因作為內(nèi)參，在Eppendorf Mastercycler Realplex 4 PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。反應(yīng)體系為10 μL：TB Green Premix Ex TaqⅡ 5 μL，cDNA樣品2 μL，上、下游引物各0.5 μL，DEPC-treated H2O 2 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 min，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，得到miR-378a、miR-15b、miR-1906、miR-155、miR-18a、miR-99a、miR-137、miR-181a、miR-27a的Ct值，用2-△△Ct法計(jì)算各miRNAs的相對(duì)表達(dá)量。所用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)通過(guò)GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行處理分析并作圖，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力的影響

由表2可知，與DMSO組相比，急性力竭運(yùn)動(dòng)4 h后，小鼠血清中ALT活性提高16.03倍(P<0.05)，肝臟組織中ASAFR活力降低43%(P<0.05)。

表2 急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力的影響Table 2 Effects of acute exhaustive exercise on ALT activity in serum and ASAFR activity in liver tissue of mouse

2.2 急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠肝臟組織中miRNAs表達(dá)的影響

由圖1可知，與DMSO組相比，急性力竭運(yùn)動(dòng)4 h后，小鼠肝臟組織中miR-378a的相對(duì)表達(dá)量升高4.33倍(P<0.01)，miR-15b的相對(duì)表達(dá)量升高3.28倍(P<0.01)，miR-1906的相對(duì)表達(dá)量升高6.48倍(P<0.01)，miR-155的相對(duì)表達(dá)量升高6.29倍(P<0.01)，miR-18a的相對(duì)表達(dá)量升高3.80倍(P<0.01)，miR-99a的相對(duì)表達(dá)量升高4.97倍(P<0.01)，miR-137的相對(duì)表達(dá)量升高7.05倍(P<0.01)，miR-181a的相對(duì)表達(dá)量升高3.52倍(P<0.05)，miR-27a的相對(duì)表達(dá)量降低80%(P>0.05)。

“*”表示與二甲基亞砜組相比差異顯著(P<0.05)，“*”表示與二甲基亞砜組相比差異極顯著(P<0.01)，“ns”表示與二甲基亞砜組相比差異不顯著(P>0.05)?！?” mean significant difference compared DMSO group (P<0.05), “*” mean extremely significant difference compared DMSO group (P<0.01)， and “ns” mean no significant difference compared DMSO group (P>0.05).圖1 急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠肝臟組織中miRNAs表達(dá)的影響Fig.1 Effects of acute exhaustive exercise on miRNAs expression in liver tissue of mouse

2.3 紫云英苷對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠血清中ALT活性和肝臟組織ASAFR活力的影響

由表3可知，與力竭運(yùn)動(dòng)組相比，急性力竭運(yùn)動(dòng)后灌胃50 mg/kg紫云英苷使小鼠血清中ALT活性降低77%(P<0.05)，肝臟組織中ASAFR活力升高1.77倍(P<0.05)；急性力竭運(yùn)動(dòng)后灌胃100 mg/kg紫云英苷使小鼠血清中ALT活性降低91%(P<0.05)，肝臟組織中ASAFR活力升高1.95倍(P<0.05)。上述結(jié)果表明,紫云英苷可顯著改善由急性力竭運(yùn)動(dòng)造成的小鼠血清中ALT活性提高和肝臟組織ASAFR活力的降低。

表3 紫云英苷對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠血清中ALT活性和肝臟組織中ASAFR活力的影響Table 3 Effects of astragalin on ALT activity in serum and ASAFR activity in liver tissue of mouse after acute exhaustive exercise

2.4 紫云英苷對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟組織中miR-155表達(dá)的影響

由圖2可知，與力竭運(yùn)動(dòng)組相比，急性力竭運(yùn)動(dòng)后灌胃50 mg/kg紫云英苷使小鼠肝臟組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量降低66%(P<0.01)；急性力竭運(yùn)動(dòng)后灌胃100 mg/kg紫云英苷使小鼠肝臟組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量降低60%(P<0.01)。

“*”表示與二甲基亞砜組相比差異顯著(P<0.05)，“*”表示與二甲基亞砜組相比差異極顯著(P<0.01)。“##”表示與力竭運(yùn)動(dòng)組相比差異極顯著(P<0.01)?！?” mean significant difference compared with DMSO group (P<0.05), and “*” mean extremely significant difference compared with DMSO group (P<0.01). “##” mean extremely significant difference compared with exhaustive exercise group (P<0.01).圖2 紫云英苷對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟組織中miR-155表達(dá)的影響Fig.2 Effects of astragalin on miR-155 expression in liver tissue of mouse after acute exhaustive exercise

3 討 論

不同強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體影響并不相同，中低強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)健康有益，而當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)使機(jī)體進(jìn)入力竭狀態(tài)時(shí)，產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥，造成氧化應(yīng)激以及器官損害。肝臟是代謝內(nèi)源性和外源性化合物并負(fù)責(zé)解毒的主要器官，可通過(guò)多種途徑維持正常的體內(nèi)平衡。由于在急性力竭運(yùn)動(dòng)中作為能量來(lái)源的是肝糖原，所以肝臟也是力竭運(yùn)動(dòng)后ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源，當(dāng)肝臟組織中增加生成2～3倍或更多的ROS，超過(guò)正常的生理適應(yīng)范圍時(shí)，則導(dǎo)致ROS的積累和抗氧化劑狀態(tài)的降低，從而增加氧化應(yīng)激，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能下降和氧化損傷增加，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，使肝臟組織出現(xiàn)纖維化，中心靜脈充血，產(chǎn)生炎性浸潤(rùn)和局灶性壞死。造成肝臟組織損傷[12-14]。Lim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中，腸上皮的通透性增加，脂多糖(LPS)很容易泄漏到門(mén)脈循環(huán)中，然后被進(jìn)一步運(yùn)輸?shù)礁闻K。Ruhee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，急性力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致雄性C57BL/6J小鼠的肝臟組織損傷和肝細(xì)胞死亡，肝臟組織中促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加。通常ALT被作為肝組織的病理?yè)p傷標(biāo)志物，血液中ALT活性提高代表肝細(xì)胞的膜功能完整性喪失，急性力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)嚴(yán)重?fù)p害肝臟，增加血液中ALT活性[17]。氧自由基具有強(qiáng)氧化性，可引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物如MDA等，嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)，同時(shí)在生物體內(nèi)本身就具有清除多余氧自由基的能力，抗氧化物質(zhì)主要包括SOD、CAT等[5]。研究表明，ASAFR活力作為抗氧化能力的標(biāo)志物之一，反映了組織清除超氧陰離子自由基的總能力，ASAFR活力下降代表組織內(nèi)抗氧化能力的下降[18]。本試驗(yàn)中C57BL/6J雄性小鼠一次性游泳4 h后，與DMSO組相比，肝臟組織中ASAFR活力下降、血清中ALT活性升高，該結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明4 h游泳運(yùn)動(dòng)造成了小鼠肝臟組織抗氧化能力下降和氧化損傷。

肝臟是人類(lèi)等哺乳動(dòng)物的主要代謝器官，它充當(dāng)糖原、脂蛋白、維生素、鐵和血液的儲(chǔ)存器官。已有研究表明肝細(xì)胞和肝臟組織中共有277個(gè)miRNAs表達(dá)，這些miRNAs參與調(diào)節(jié)多種代謝途徑，因此miRNAs表達(dá)的變化可能反映了肝臟組織潛在的損傷[19]。miRNA-155被認(rèn)為是炎癥的重要調(diào)節(jié)劑，Klieser等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)導(dǎo)致脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)和低密度脂蛋白受體(LDLR)表達(dá)上調(diào)，在肝巨噬細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中釋放TNF-α，ROS導(dǎo)致炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)生。Bala等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155表達(dá)水平的提高促進(jìn)C57BL/6J小鼠的肝纖維化和酒精引起的脂肪性肝炎。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-378a的相對(duì)表達(dá)量在高血脂癥的小鼠肝臟組織中顯著提升。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b在非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)SD大鼠模型和棕櫚酸酯誘導(dǎo)的NAFLD LO2細(xì)胞模型中高表達(dá)。Lu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a在肝硬化和肝癌患者的血清中的相對(duì)表達(dá)量顯著提升。本試驗(yàn)中，C57BL/6J小鼠4 h游泳運(yùn)動(dòng)后，與DMSO組相比，miR-155、miR-378a、miR-15b、miR-18a的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提升，與上述研究結(jié)果一致。

在我們前期的研究中，檢測(cè)了不同濃度紫云英苷灌胃后C57BL/6J雄性小鼠血清中ALT活性的變化，結(jié)果表明灌胃50或100 mg/kg紫云英苷均不會(huì)對(duì)小鼠肝臟組織造成損傷。紫云英苷作為一種黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化的作用。Soromou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷通過(guò)核因子-κB(NF-κB)途徑發(fā)揮抗炎作用，抑制白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生。Park等[25]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷可以作為暴露于太陽(yáng)輻射的皮膚的抗氧化劑并保護(hù)可以保護(hù)細(xì)胞膜免受ROS的損傷。Cho等[26]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷可抑制LPS引起的上皮細(xì)胞凋亡和嗜酸性粒細(xì)胞增多，并作為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)的LPS-Toll樣受體(TLR)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的拮抗劑。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)也有抑制作用。Vongsak等[28]研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生抑制作用，并顯著降低了H2O2誘導(dǎo)的HEK-293細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生。在本試驗(yàn)中，與急性力竭運(yùn)動(dòng)組相比，小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)4 h后，灌胃50或100 mg/kg紫云英苷均可以顯著改善急性力竭運(yùn)動(dòng)造成的血清中ALT活性提高和肝臟組織中ASAFR活力的降低，其中ASAFR活力與DMSO組無(wú)顯著差異，說(shuō)明50和100 mg/kg的紫云英苷可以作為急性力竭運(yùn)動(dòng)造成的小鼠肝臟氧化損傷的抗氧化劑，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，但并未呈現(xiàn)顯著的劑量相關(guān)性。

研究表明miR-155與肝臟炎癥和氧化損傷相關(guān)性較高，并且紫云英苷對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟組織中miR-155表達(dá)的影響較為顯著，因此我們檢測(cè)了急性運(yùn)動(dòng)后灌胃紫云英苷對(duì)miR-155表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與急性力竭運(yùn)動(dòng)組相比，急性力竭運(yùn)動(dòng)后灌胃50或100 mg/kg的紫云英苷均可以顯著改善急性力竭運(yùn)動(dòng)造成的肝臟組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量的提高，與上一結(jié)果相同，但miR-155相對(duì)表達(dá)量的改變并沒(méi)有呈現(xiàn)對(duì)紫云英苷的劑量相關(guān)性。

綜上所述，我們推測(cè)紫云英苷的抗氧化作用與miR-155相關(guān)，但紫云英苷抗氧化作用的具體分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

紫云英苷可以作為急性力竭運(yùn)動(dòng)引起的小鼠肝臟氧化損傷的抗氧化劑，灌胃50和100 mg/kg的紫云英苷均能改善急性力竭運(yùn)動(dòng)造成的小鼠血清中ALT活性的提高和肝臟組織中ASAFR活力的降低，并改善急性力竭運(yùn)動(dòng)造成的小鼠肝臟組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量的提高。