蘇楠，吳亦楠，陳韻億，金麗華，張翀，Shimpei Aikawa，Tomohisa Hasunuma，Akihiko Kondo，邢新會，4，5

（1清華大學化學工程系生物化工研究所，工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，合成與系統(tǒng)生物學中心，北京 100084；2北京電子科技職業(yè)技術學院生物技術系，北京 100029；3神戶大學工程研究生院，化學科學與工程系，日本 神戶 657-8501；4清華大學深圳國際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院，廣東 深圳 518055；5深圳灣實驗室醫(yī)藥健康技術與工程研究所，廣東 深圳 518055）

引 言

微藻是一類體積小、單細胞/群體生長、可通過光合作用固定CO2的水生低等生物的總稱，在全球碳循環(huán)中扮演著重要的角色。研究表明，微藻光合作用所固定CO2的量可達全球總固定量的40%[1]。隨著溫室效應引起的全球氣候問題的日益嚴峻，微藻因其高光合效率、高碳水化合物含量和高油脂含量等特點，被視為新一代生物柴油、生物乙醇、生物產氫的重要光合細胞工廠[2-3]。此外，微藻還能夠利用太陽能直接合成眾多高附加值化合物，其大規(guī)模培養(yǎng)和應用有助于“碳達峰”和“碳中和”的實現，具有重要的社會及經濟效益[4]。因此，微藻育種及后續(xù)生物質發(fā)酵、應用成為新的研究熱點之一。

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）是一種多細胞纖維狀微藻，常被發(fā)現于堿性湖泊中。因具有倍增速度快、蛋白含量極高（干重的65%～71%）、維生素、礦物質及色素含量豐富等特點，一直被大規(guī)模培養(yǎng)并應用于食品[5]、保健品[6-7]、藥品[8-9]、化妝品[10-11]和飼料添加劑[4]的工業(yè)生產。近年來，因規(guī)?；囵B(yǎng)技術成熟、碳水化合物含量高（干重的15%）且易水解等優(yōu)點，鈍頂螺旋藻亦被視為第三代生物乙醇發(fā)酵生產的理想原料之一[12]。為了進一步推進鈍頂螺旋藻在發(fā)酵領域的應用，改造和獲得具有生長速度快、碳水化合物含量豐富、抗逆性強、易絮凝收集等優(yōu)勢表型的微藻細胞工廠具有重要的研究和應用價值。

盡管鈍頂螺旋藻培育歷史悠久且在電轉化方面取得較大進展[13-15]，但由于胞內大量限制酶、修飾酶、插入元件、Ⅱ型內含子及成簇的間隔短回文重復序列（CRISPR）的存在，目前鈍頂螺旋藻的分子改造仍受限于可用分子元件的缺失[16]。相較于其他微藻，其改造主要依賴于誘變育種策略。殷春濤等[17]利用亞硝基胍（NTG）作用于鈍頂螺旋藻，篩選得到耐低溫突變株；李建宏等[18]利用紫外突變，獲得了富含藻藍蛋白且菌體增長的突變株；Fang等[19]利用自主研發(fā)的常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma,ARTP）成功誘變鈍頂螺旋藻，獲得生長速率增強、碳水化合物含量增加或絮凝度增加的代表性菌株；Shirnalli等[20]利用NTG處理鈍頂螺旋藻，得到蛋白含量或類胡蘿卜素含量增加的突變株；Cheng等[21]利用60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻，得到生長速率和CO2固定速率增加的菌株；Zhu等[22]利用60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻，得到苯酚耐受性增強、可以利用煙道氣中CO2的突變株。此外，An等[23]還結合ARTP誘變與β-紫羅酮篩選，成功誘變得到蝦青素產量增加的菌株。不同的表型具有不同的工業(yè)價值，如抗低溫有利于拓寬生產地域；生長速率增強有利于提高固碳效率；菌株目標代謝產物含量和絮凝度增加有利于提高生產效率和降低收集成本等。

優(yōu)勢突變體的產生不僅能夠為工業(yè)生產提供理想菌株，同時也為胞內代謝網絡及其調控機理的深入研究提供了比較素材。隨著組學技術（全基因組測序、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等）與生物信息學技術的發(fā)展，近年來，在分子水平解析優(yōu)勢表型產生的機理得以實現，并在大腸桿菌、釀酒酵母等底盤微生物育種中起到重要的作用。然而，盡管已經獲得了完整的鈍頂螺旋藻基因組[24]，鈍頂螺旋藻突變體基因型-表型的關聯(lián)分析仍然鮮有報道。除了Cheng等[25]利用轉錄組測序解析60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻突變體生長速率增強的原因外，大部分研究主要基于蛋白質組學或轉錄組學研究鈍頂螺旋藻瞬時抗逆響應（抗鹽、抗高溫、抗低溫、抗離子等）產生的代謝網絡擾動[26-29]。因此，更多突變表型的組學分析亟待進一步挖掘。

本團隊前期利用ARTP誘變得到了三株突變株[19,30]。為模擬鈍頂螺旋藻室外培養(yǎng)條件，避免光飽和及光抑制過程，采用“12小時光照+12小時避光”的交替培養(yǎng)方法進行研究。本研究則采用“連續(xù)光照+短期培養(yǎng)（7天）”的方式進行培養(yǎng)，在獲得實驗室可控條件下的最大固碳、生長效率的基礎上，研究突變體的表型變化及其產生的可能的分子機制。表型表征表明，三株突變株在強化培養(yǎng)的條件下，具有高絮凝表型及不同的胞內重要化合物含量。隨后，通過代謝組學與比較基因組學結合的方法對所觀察到表型的分子機制進行初步闡釋，以期為未來鈍頂螺旋藻表型理性改造提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

鈍頂螺旋藻原始菌株FACHB-904購自武漢中科院水生生物研究所淡水藻種庫，突變株3-A10，3-B2，4-B3為本實驗室前期利用ARTP誘變育種儀（http://www.tmaxtree.com/）誘變篩選獲得[19]。在12小時光照+12小時避光的培養(yǎng)條件下，突變體在絮凝度、碳水化合物含量、生長速度或葉綠素含量方面與野生型有顯著差異。

1.2 培養(yǎng)基

本研究中的野生型鈍頂螺旋藻及ARTP突變菌株，均使用Zarrouk培養(yǎng)基進行培養(yǎng)[19]。

1.3 主要試劑

所有培養(yǎng)基的成分均為分析純等級，硫酸為化學純等級。碳酸氫鈉、硫酸鉀、七水合硫酸鎂、七水合硫酸鐵、乙二胺四乙酸、硼酸、氫氧化鈉、二硝基水楊酸、甲醇和氯仿購自于Sigma公司以及Takara公司。碳酸鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鈉、氯化鈉、二水合氯化鈣、一水合硫酸錳、二水合鉬酸鈉、五水合硫酸銅、六水合氯化鈷、氯化銅、氯化鋅、硫酸購自北京益利精細化學品有限公司。

螺旋藻基因組提取純化試劑盒DNeasy Plant Mini kit購自Qiagen公司。玻璃珠（acid-washed,150～212μm）購自Sigma公司。

1.4 儀器與設備

水 平 搖 床，NC350-HC plant chamber，日 本Nippon Medical and Chemical Instruments；光強測量儀，Testo540，美國Testo；紫外可見分光光度計，UV757CRT，上海精科；毛細管電泳質譜（CE/MS）系統(tǒng)，Agilent G7100CE/Agilent G6224AA LC/MSD time-of-flight system，美 國Agilent；HPLC/QqQ-MS系統(tǒng)，Agilent1200LC/Agilent6460QqQ-MS，美國Agilent；LC/酶標儀，TECAN infinite M200pro，瑞士TECAN；水浴鍋；微量玻璃比色皿；研缽/勻漿器。

1.5 培養(yǎng)條件

在200ml三角瓶中加入100ml Zarrouk培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌（115℃，30min）。螺旋藻種子液在（30±2）℃，光強50μmol/(m2·s)，100r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5～6d。達到對數生長期后，按照細胞干重比為0.0 3g/L的比例接種至新的Zarrouk培養(yǎng)基中，相同條件下，連續(xù)光照培養(yǎng)7d。每24h進行取樣，檢測藻株培養(yǎng)相關指標。

由于螺旋藻胞內代謝產物受環(huán)境、培養(yǎng)條件影響顯著，為保證數據準確，本研究將WT、3-A10、3-B2、4-B3置于燈箱內水平搖床上培養(yǎng)（附錄圖A1）。每批次培養(yǎng)均保持三個生物學平行，并嚴格控制放置位置，保證各瓶所接受光照強度一致（采用光強測量儀進行光強檢測）；同時，為避免環(huán)境光的干擾，燈箱用黑布作遮光處理。

1.6 檢測方法

1.6.1 細胞濃度（細胞干重）及比生長速率的測定 使用紫外分光光度計檢測鈍頂螺旋藻在560nm處的光密度（OD560）[19,31]，根據所測定的OD560（y）和細胞干重（dry cell weight,DCW）（x）標準曲線[式(1)，附錄圖A2]計算鈍頂螺旋藻的細胞干重(g/L)。

比生長速率[μ，g/（L·d）]由式(2)計算。

其中，x1和x2分別為t1和t2時刻的細胞干重。

1.6.2 碳水化合物含量測定 螺旋藻碳水化合物提取及含量測定采用Fang等[19]的方法：取5ml藻株培養(yǎng)液，13000g離心10min，用0.9% NaCl溶液清洗3次，棄掉上清液。在沉淀細胞中添加3ml HCl（6mol/L），煮騰15min。冷卻后，添加相同體積的NaOH(6mol/L)進行中和并采用DNS方法檢測樣品處理后所得還原糖濃度（DNS溶液：NaOH16g，二硝基水楊酸1g，酒石酸鈉鉀300g，蒸餾水定容至1L）。用紫外分光光度計檢測標準品和待測樣品在波長560nm的吸光度(Abs560)，根據測定的Abs560（y）和碳水化合物濃度（x）標準曲線[式(3)，附錄圖A3]計算待測樣品的碳水化合物濃度（μg）。

1.6.3 葡萄糖含量測定 采用Solarbio葡萄糖含量測定試劑盒進行檢測。取0.1g組織（干重），加入1ml蒸餾水研磨成勻漿，置沸水浴中煮沸10min。冷卻后，8000g離心10min。取20μl蒸餾水、標準品、離心所得樣品上清液分別與180μl試劑盒測定混合試劑混合，并在96孔內于37℃孵育15min。之后，利用酶標儀測定波長505nm處的吸光度A1、A2和A3，根據式(4)計算葡萄糖含量（y，μmol/mg）。

1.6.4 葉綠素含量測定 螺旋藻葉綠素提取及含量測定采用Fang等[19]的方法：取5ml藻株培養(yǎng)液，13000g條件下離心10min，用0.9% NaCl溶液清洗3次，棄掉上清液，在回收的沉淀細胞中添加5ml濃度為90%的甲醇，超聲破碎（超聲1s，間隔2s，100個循環(huán)）后萃取葉綠素。用紫外分光光度計檢測樣品在665nm和650nm處的吸光度，由式(5)計算待測樣品的葉綠素含量（y，mg/L）。

1.6.5 絮凝度測定 將分別培養(yǎng)1、3、5、7d的藻株，于三角瓶中靜置24h，后吸取上清液，利用紫外可見分光光度計檢測澄清液在560nm的吸光度(As)及混勻后的樣品的吸光度(Am)。由式(6)計算得到藻株絮凝度（F）。

生長早期絮凝度檢測，則選取培養(yǎng)24h后的藻株進行靜置，分別在2、4、6、8、10、12、14和24h節(jié)點吸取上清部分，用上述方法進行吸光度檢測及絮凝度計算。

1.6.6 胞內代謝產物分析樣品處理 量取干重約5～10mg的藻株細胞培養(yǎng)液，使用10μm濾膜(Millipore)過濾，隨后用4℃預冷的NaH2CO3（260nmol/L）清洗1次，離心后的藻株細胞立刻加入2ml在-30℃預冷的甲醇溶液（含有PIPES溶液）。振蕩重懸。隨后，取1ml藻株細胞，加入100μl4℃預冷的超純水和300μl氯仿（含有濃度為15μmol/L反-β-阿樸-8′-胡蘿卜烯醛）。在避光、4℃、1200r/min條件下混勻30min，隨后4℃、14000g離心5min。取980μl上清液與440μl超純水混合，水相與有機相分層后，4℃、14000g離心5min，平行移取兩份水相溶液（450μl/份）至潔凈的樣品管。隨后用5kDa的濾膜移除可溶蛋白組分，將水相層提取物進行凍干，-80℃存放備用，或用超純水溶解后直接進行CE/MS和LC/QqQ-MS分析。

1.6.7 CE/MS代謝物分析 將凍干的胞內代謝產物提取物溶于20μl超純水后利用CE/MS系統(tǒng)進行CE/MS分析。CE分離系統(tǒng)介質為融合二氧化硅的毛細管(1m×50μm i.d.)，裝填1mol/L甲酸（pH=1.8）或50mmol/L醋酸銨（pH=9）作為電解液進行陽離子或陰離子代謝物分析。CE電極以電解液輸入端為陽極，離子化輸出端作為陰極。樣品注入CE系統(tǒng)時，選用50mbar(1bar=105Pa)、10s的條件分析陽離子或陰離子代謝物。CE系統(tǒng)電壓設置為30kV，斜坡時間0.3min。對于陰離子代謝產物分析，使用空氣泵將電解液注入毛細管，壓力先設置為10mbar（進樣時間為0.4 ～30min）再設置為100mbar（進樣時間為30.1 ～49.5min）。鞘流液的流速設置為8μl/min。ESI-MA分析可以在陽離子或者陰離子模式進行，對應的毛細管壓力設定為-3.5 kV或者3.5 kV。TOF-MS劃分器、分離器以及八極性分離電壓分別設定為100V、65V和750V。1.6.8 LC/QqQ-MS代謝物分析 凍干的胞內代謝產物提取物使用50μl超純水溶解后利用LC/QqQ-MS系統(tǒng)配合MassHunter Workstation Data Acquisition v.B.04.01 軟件進行代謝物分析。本實驗使用質譜多反應監(jiān)測（MRM）進行數據采集。

1.6.9 螺旋藻基因組提取及測序 取50ml培養(yǎng)10d的螺旋藻菌液，利用縮水濾紙減壓過濾。分離出來的藻體用0.9%NaCl洗滌三次后，移到1.5ml管。加入1ml重懸溶液（0.1mol/L EDTA，0.1 5mol/L NaCl）并重懸。接著，先利用液氮快速冷凍重懸菌液30s，后放入37℃培養(yǎng)箱孵化至溶解。重復速凍與融化3次。離心去掉上清液，利用植物基因組提取試劑盒進行基因組提取。提取的基因組先用微量紫外分光光度計進行濃度檢測。將符合測序標準的基因組樣品交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序和后續(xù)的突變分析。

2 實驗結果與討論

2.1 藻株培養(yǎng)及表型分析

連續(xù)光照培養(yǎng)有助于強化藻株的光合作用，實現更加高效的固碳。為了探究強化光照培養(yǎng)下藻株的表型，本實驗在實驗室可控的連續(xù)光照培養(yǎng)下，對原始菌株及突變株的生長及重要化合物含量進行了表征。

2.1.1 比生長速率測定 在間歇光照培養(yǎng)（12h+12h）情況下，3-A10、3-B2、4-B3和野生型（WT）的比生長速率分別為(0.0583 ±0.016 )、(0.0786 ±0.016 )、(0.0930 ±0.025 )和(0.0842 ±0.018 )g/(L·d)[19]。3-A10遠低于WT，3-B2接近于WT，4-B3則較WT有所提升。在強化光照條件下，3-A10、3-B2、4-B3和WT的比生 長 速 率 可 達(0.4349 ±0.0059 )、(0.4350 ±0.0016 )、(0.4521 ±0.0063 )以及(0.4531 ±0.0064 )g/(L·d)，分別提高了6.5 倍、4.5 倍、3.9 倍和4.4 倍（圖1）。強化的光照條件促進了藻株的生長，但同時弱化了各藻株之間的生長差異。

圖1 野生和三株突變藻株在連續(xù)光照培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.1 Growth curves of wild-type S.platensis and the three mutants under the continuous light irradiation culture

2.1.2 絮凝度分析 在絮凝方面，間歇光照培養(yǎng)（12h+12h）情況下，僅3-B2相較于WT具有更好的絮凝表型[19]。然而，在本實驗的強化光照培養(yǎng)條件下，相較于WT，盡管生長速度相似，3-A10、3-B2、4-B3均表現出了易絮凝表型[圖2（a）、（b）]。在生長早期，細胞密度較低時，3-A10、3-B2、4-B3就具有較高的絮凝度，并于第3天均達到了最大值。從培養(yǎng)1d后的絮凝度來看，3株突變體間也有所差異，3-B2＞4-B3＞3-A10[圖2（b）、（c）]?？梢酝茰y，絮凝度表型的差異來源于各突變體基因型的不同以及環(huán)境變化所引起的代謝網絡的改變。

圖2 突變體藻株在生長過程中的絮凝度變化:(a)各藻株搖床培養(yǎng)24h后，靜置5min時的照片;(b)各藻株搖床7d培養(yǎng)過程中的絮凝度變化;(c)經24h搖床培養(yǎng)的藻株，靜置培養(yǎng)不同時間后的絮凝度Fig.2 Change of flocculation over culture time.(a)Pictures of S.platensis strain cultures after24h incubation in the shaker;(b)The change of flocculation of strain cultures during7d of incubation in the shaker;(c)The change of flocculation of strain cultures(harvested after24h of incubation in the shaker)after stationary sedimentation in tubes for different time periods

2.2 藻株重要組分分析

除了上述表觀的生長、絮凝度的表征，對不同藻株的重要基本組分（葉綠素含量、總碳水化合物含量、葡萄糖含量）也進行了分析。

2.2.1 葉綠素含量測定 各藻株在第1天的葉綠素含量均為最高水平且WT＞3-A10＞3-B2＞4-B3（圖3）。隨著光照培養(yǎng)時間的延長，有所下降。WT的葉綠素含量則持續(xù)降低，3-A10與3-B2的葉綠素含量在培養(yǎng)過程中先降低后又部分恢復，并在第7天高于WT。突變株4-B3葉綠素含量整體變化最小，始終維持在較低水平。

圖3 各藻株在生長過程中的葉綠素含量測定Fig.3 Change of chlorophyll concentrations over time

2.2.2 碳水化合物含量測定 藻株內的碳水化合物是生產生物燃料的重要原料，因此，總碳水化合物含量也是微藻的一個重要生理指標。第1天各藻株的總碳水化合物含量都相對比較高，隨著培養(yǎng)過程的進行，各藻株都有不同程度的下降，至第7天時各藻株總碳水化合物含量基本維持在相似水平（圖4）。該結果表明在該段培養(yǎng)時間內，糖合成途徑總體上得到了增強。突變株3-A10和4-B3與野生型的差異不明顯，但3-B2在培養(yǎng)周期的前3天都表現出明顯的高總碳水化合物含量。結合3-B2在培養(yǎng)前期絮凝度最高的表型，該突變株高碳水化合物有可能參與形成胞外多糖（EPS），使得細胞之間產生更為緊密的相互作用。

圖4 各藻株在生長過程中的總碳水化合物含量測定Fig.4 Change of total carbohydrate concentrations over time

2.2.3 葡萄糖含量測定 作為原核生物中糖原合成的前體，螺旋藻在生長過程中葡萄糖含量直接決定了其糖原的合成量，本研究也對幾個藻株碳水化合物中的葡萄糖的含量進行了測定（圖5）。

圖5 各藻株在生長過程中的葡萄糖含量測定Fig.5 Change of glucose concentrations over culture time

野生型的葡萄糖含量水平基本保持穩(wěn)定，沒有顯著差異，相比之下，突變體的葡萄糖含量則有比較明顯的變化。在生長的起始階段，突變體的胞內葡萄糖含量為野生型的175%～225%，而突變體之間的胞內葡萄糖含量則沒有特別明顯的差異，這可能為后期突變體絮凝度增加所需的糖原合成奠定了基礎。在第3天，突變體的胞內葡萄糖含量迅速降為和野生型基本一致的水平，而此時三個突變體的絮凝度則顯著上升，可能表明細胞表面的糖蛋白合成消耗了大量的葡萄糖。在第4～7天，突變體3-A10和3-B2的葡萄糖含量保持穩(wěn)定狀態(tài)，對應其絮凝度也達到了平臺期。突變體4-B3在這個時期內，雖然絮凝度未再有顯著的提升，但其胞內葡萄糖的含量卻有了大幅度的增加，表明該突變株在該時期內的葡萄糖合成途徑得到了迅速的加強，其上游的中間代謝產物有可能也會有比較明顯的含量變化。

2.3 藻株重要代謝中間物含量與表型關聯(lián)分析

相較于WT，三株螺旋藻突變體具有明顯的高絮凝表型，同時，在生長特定階段，在葉綠素含量、碳水化合物含量以及葡萄糖含量方面也與WT具有差異。為了深入解析三個突變體在表型上的顯著特點，在不同時間節(jié)點對連續(xù)光照培養(yǎng)過程中各藻株的16種重要胞內代謝產物進行測定（圖6）。這16種代謝物分布在與螺旋藻生長發(fā)育密切相關的糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑（TCA cycle）、糖代謝途徑以及固碳/氮途徑中，包括磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、D-3-磷酸甘油酸（3PGA）、甘油醛-3-磷酸（GAP）、D-果糖-6-磷酸（F6P）、D-葡萄糖-1-磷酸(G1P)、D-葡萄糖-6-磷酸(G6P)、UDP-D-葡萄糖(UDP-GLC)、ADP-D-葡 萄 糖(ADP-GLC)、檸 檬 酸(CA)、α-酮 戊 二 酸(αKG)、琥 珀 酸(SUCC)、蘋 果 酸(MAA)、D-景天庚酮-7-磷酸(S7P)、D-2-磷酸甘油酸(2-PGA)、乳 酸(LAC)、GDP-D-葡 萄 糖（GDPGLC）（圖7）。

圖6 各藻株胞內主要代謝產物含量測定Fig.6 Change of the concentrations of import metabolites over time

圖7 測定中間代謝產物在各代謝途徑中的分布Fig.7 Location of detected important metabolites in strain metabolic networks

上述16種主要代謝產物的測定中，在持續(xù)光照培養(yǎng)條件下，三種突變體大部分胞內代謝產物含量隨時間變化趨勢與WT差異不大。但可以看到，隨著生長過程的進行，突變體在上述途徑中處于核心位置的代謝中間產物的含量均存在明顯的變化。

在糖原合成/糖酵解平衡途徑中，上游處于核心位置的PEP、3PGA以及GAP，在生長初期突變體含量顯著比野生型高，隨著培養(yǎng)時間的進行，逐漸與野生型一致，在生長后期又出現高于野生型的現象（圖6）；F6P在培養(yǎng)前期的含量高于野生型，在培養(yǎng)中后期基本與野生型保持在同一水平，并未有突變體含量再次升高的現象。在F6P向G6P和G1P轉化過程中，G6P和G1P含量變化趨勢與PEP、3PGA、GAP含量變化趨勢有比較明顯的相反的表現，即突變體在早期（如培養(yǎng)1d）PEP、3PGA、GAP含量高于野生型時，G6P和G1P含量與野生型差別不大；在3～5d突變體PEP、3PGA、GAP含量接近野生型時，G6P和G1P含量則出現明顯高于野生型的表現，隨后再逐步趨于與野生型相似水平。這個趨勢顯著表明代謝流在向著糖原合成的方向進行，并且這個趨勢有周期性變化的特征（即有可能隨著培養(yǎng)時間的延長連續(xù)、順次出現）。在進入糖代謝循環(huán)后，突變體ADP-GLC和UDP-GLC的含量與野生型差異不明顯（只有突變體3-A10的ADP-GLC在培養(yǎng)末期有顯著升高的趨勢），說明糖原合成途徑處于比較高效的狀態(tài)，終產物糖原與葡聚糖的合成量均得到提高（本研究中總碳水化合物含量測定也證實該推論）。螺旋藻合成的糖原/葡聚糖除了供給本身的生長需求外，還能夠以胞外多糖（ESP）的形式存在于細胞壁表面。推測細胞間ESP含量增加造成相互之間的互作力增強，從而可以使得螺旋藻絮凝度和沉降度都得到增強。

三羧酸循環(huán)中，突變體CA和α-KG的含量在整個培養(yǎng)周期內都顯著高于野生型，而MAA和SUCC的含量與野生型保持一致，說明在代謝流從PEP向OAA傳遞后，琥珀酸合成途徑并沒有變化，主要是α-KG途徑得到了顯著加強。α-KG作為三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產物，是生物體內L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸等多種氨基酸、維生素和有機酸的生物合成前體。α-KG又可在α-酮戊二酸脫氫酶的作用下進一步代謝成琥珀酰-CoA，進入碳代謝節(jié)點，在這一過程中伴隨著電子傳遞和能量產生，該過程能夠為螺旋藻的生長繁殖提供大量碳源物質和能量；此外，α-KG還可通過轉氨基作用形成L-谷氨酸，進入氮代謝。因此，突變體中α-KG含量的增加，表明藻株的碳代謝和氮代謝都同時得到了加強（突變體處于N代謝途徑中心位置的S7P含量在生長早期顯著高于野生型）。

2.4 藻株比較基因組分析

進一步，對野生型和突變體藻株的基因組進行了提取和重測序，以期在基因組層面上探討ARTP突變體產生表型差異的可能原因。利用已有的Arthrospira platensisNIES-39基因組，對基因序列進行Clusters of Orthologous Groups of proteins（COG）注釋，預測得到編碼蛋白量約3900個。與WT相比，三株突變體3-A10、3-B2和4-B3的基因組上分別存在1591、1059和1823個錯譯單堿基突變以及82、56和81個錯譯插入/缺失突變。通過Gene Ontology（GO）注釋分析，對上述突變基因編碼蛋白的功能進行聚類分析（表1，附錄圖A4～A6）。突變體分布在三大類突變基因的數量差異較大（附錄表A1），與生物途徑和分子功能相關基因改變的數量較多，分別達到900和660個以上，是突變體產生多種表型差異的主要原因；但相對地，發(fā)生在細胞主要組件相關基因上的突變只有100個左右，表明突變體在與生長發(fā)育相關的關鍵途徑/網絡的變化相對較小，這與之前表征所得，突變體生長速度與野生型相近的結果相吻合。

表1 突變體突變基因GO聚類分析Table1 Gene Ontology clustering analysis of mutated strains

使用KEGG數據庫（https://www.kegg.jp/）中代謝網絡分析功能，對突變體相對野生型有顯著差異（差異性大于0.1%）的基因進行所屬代謝網絡的歸類（附錄表A2）?？梢钥吹?，顯著突變基因涉及的代謝途徑多達68條，表明ARTP誘變可以在系統(tǒng)層面上造成螺旋藻基因組的大規(guī)模突變。相比于WT，突變體在嘌呤代謝、氨基酸生物合成、葉綠素代謝、光合作用/固碳、氮元素代謝途徑、糖類合成/代謝相關的途徑出現了較多的突變基因。這些突變可能對突變株表型的改變起到了重要的作用。由于缺乏有效的基因改造工具，目前，對這些基因突變的功能暫時無法進行回補驗證。隨著新的微藻分子生物學工具的開發(fā)，這些潛在的作用位點將有助于微藻基因型-表型關聯(lián)的進一步深入研究。

3 結 論

螺旋藻的誘變育種及表型解析具有重要的工業(yè)價值。本研究對本團隊前期研究獲得的三株螺旋藻突變株的表型，在強化培養(yǎng)的條件下進行了詳細表征。結果表明，強化培養(yǎng)下，突變株與野生型菌株的生長差異較小，但均具有高絮凝表型。此外，在特定的生長階段，突變株胞內的重要化合物含量（葉綠素、碳水化合物總量、葡萄糖）與野生型具有明顯差異。進一步，通過代謝組學，測定了藻體內16種重要代謝物的含量變化情況，對突變株的表型進行了初步解析。結果表明，突變株的高絮凝表型根源于生長早期糖合成過程的強化。最后，通過全基因組測序和比較基因組學分析，得到三株突變體3-A10、3-B2和4-B3基因組上1591、1059和1823個錯譯單堿基突變以及82、56和81個錯譯插入/缺失突變。初步的功能聚類分析表明，顯著突變基因涉及的代謝途徑多達68條，涉及嘌呤代謝、氨基酸生物合成、葉綠素代謝、光合作用/固碳、氮元素代謝途徑、糖類合成/代謝等眾多重要的生理過程。隨著未來螺旋藻分子工具的增加，驗證和解析這些突變的具體功能將成為可能。