謝煜，王玉軍

（化學(xué)工程聯(lián)合國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084）

引 言

哌拉西林(PRL)是一種重要的廣譜低毒的三代半合成青霉素，對部分革蘭陽性菌和大部分革蘭陰性菌均有較強(qiáng)的抗菌作用，且是較少的對銅綠假單胞菌作用的菌株之一[1-5]。其下游制劑以混方產(chǎn)品哌拉西林鈉他唑巴坦鈉為主，其在復(fù)方青霉素用藥中占比超過50%。2019年中國公立醫(yī)療注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉銷售額超過80億元，同比增長2.4%，排在全身用抗細(xì)菌藥通用名藥品競爭格局首位。哌拉西林的合成路線主要有混合酸酐法[6]、氨芐酰氯法[7-9]、氨芐酰咪唑法[10]等，其中氨芐酰氯法被認(rèn)為是最簡單經(jīng)濟(jì)的合成路線，也是目前工業(yè)生產(chǎn)的主要方法。氨芐酰氯法具體是指母核氨芐西林與酰化劑發(fā)生N-?；磻?yīng)合成哌拉西林，合成路線如圖1所示[9]。傳統(tǒng)反應(yīng)釜具有微觀混合效果差、局部pH不易精確控制、散熱效果差等缺點(diǎn)，合成的哌拉西林往往雜質(zhì)含量比較高，導(dǎo)致產(chǎn)品不能通過藥物一致性評價，影響產(chǎn)品銷售。本課題組通過開發(fā)新型多相工藝并結(jié)合膜分散微反應(yīng)器，成功合成高品質(zhì)低雜質(zhì)的哌拉西林并實(shí)現(xiàn)工業(yè)放大[11-12]。然而，哌拉西林合成反應(yīng)機(jī)理及其反應(yīng)動力學(xué)模型還缺乏相關(guān)研究。

圖1 哌拉西林合成路線Fig.1 The synthetic pathway of piperacillin

4-乙基-2,3-二氧-1-哌嗪甲酰氯(EDPC)的二氯甲烷溶液與氨芐西林的水溶液在微反應(yīng)器中快速混合并反應(yīng)。該體系下，EDPC分子遇水分子將會發(fā)生降解反應(yīng)，而氨芐西林分子不溶于二氯甲烷，因此推測快速的N-酰基化反應(yīng)發(fā)生在二氯甲烷與水的相界面處[13]。N-酰基化反應(yīng)已有很多研究[14-17]，但本體系涉及非均相下的哌拉西林合成，且反應(yīng)速度快，難以實(shí)現(xiàn)油水兩相的迅速分離，因此，反應(yīng)動力學(xué)的測量存在一定難度。恒界面池法具有裝置簡單、操作方便的優(yōu)勢[18]，常用于研究界面反應(yīng)動力學(xué)[19-23]。本工作將恒界面池用于研究哌拉西林非均相合成的表觀反應(yīng)動力學(xué)，反應(yīng)過程中比界面積大大減小，有效降低了反應(yīng)速率且兩相分離便于取樣。二氯甲烷和水由于密度不同且互不相容形成界面，在攪拌過程中保持兩相界面穩(wěn)定，并通過研究各個操作條件對界面反應(yīng)速率的影響，可以確定反應(yīng)速率常數(shù)與各個因素之間的關(guān)系并得到表觀動力學(xué)與熱力學(xué)數(shù)據(jù)。

為進(jìn)一步確定N-?；磻?yīng)的原理，借助DFT[24-25]模擬哌拉西林合成反應(yīng)路徑自由能變化并計(jì)算反應(yīng)發(fā)生的自由能壘。通過反應(yīng)路徑的模擬從本質(zhì)上揭示了N-?；磻?yīng)機(jī)理，并通過自由能壘與活化能的比較，Gibbs自由能與生成物與反應(yīng)物自由能壘的比較，驗(yàn)證模擬的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

氨芐西林（AMP，98%），4-乙基-2,3-二氧-1-哌嗪甲酰氯(EDPC，98%)，由華北制藥集團(tuán)先泰藥業(yè)有限公司提供。二氯甲烷(DCM，AR)，氨水(NH3·H2O,AR),磷酸二氫鈉(NaH2PO4，AR)，磷酸(H3PO4,85%)，乙腈(ACN,AR),甲醇(CH3OH，AR)，由上海泰坦科技股份有限公司提供。

1.2 恒界面池中哌拉西林合成反應(yīng)

恒界面池反應(yīng)裝置如圖2所示，由恒界面池萃取裝置、雙層玻璃反應(yīng)器、冷浴等組成。雙層玻璃反應(yīng)器由高為5cm、內(nèi)徑為3.63 cm、壁厚為0.5 cm的玻璃圓筒構(gòu)成，裝有同軸攪拌槳，界面處攪拌槳有0.5 cm的擋板，攪拌時由攪拌器帶動攪拌槳可保持上下同速逆向轉(zhuǎn)動。打開冷浴，將反應(yīng)器溫度降低至0℃。配制3mmol/L的氨芐西林水溶液，并用氨水將pH調(diào)節(jié)到7±0.2 ；配制3mmol/L的EDPC的二氯甲烷溶液。將原料置于冷浴槽中降低至反應(yīng)溫度。將17ml冷卻的EDPC溶液加入到反應(yīng)器中，隨后用注射器沿?cái)嚢铇焖傧蚍磻?yīng)器中加入17ml冷卻的氨芐西林溶液，并盡量保持界面穩(wěn)定。打開反應(yīng)器的攪拌裝置，并記錄反應(yīng)時間。每間隔2min，取上層水相0.4ml樣品進(jìn)行液相檢測。

圖2 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of experimental device

1.3 檢測方法

本工作利用高效液相色譜測定樣品中哌拉西林和氨芐西林含量，首先通過內(nèi)標(biāo)法確定峰面積與溶液濃度的關(guān)系。隨后通過樣品中哌拉西林和氨芐西林出峰面積計(jì)算得到哌拉西林和氨芐西林的濃度。使用Thermo ODS-15711(5μm,4.6mm×250mm)反相色譜柱。待液相色譜儀的基線穩(wěn)定后，將過濾后的20μl稀釋液注入儀器，按預(yù)先設(shè)定的程序進(jìn)行分析。

柱溫：30℃；流速：1ml/min；檢測波長：220nm；進(jìn)樣量：20μl；流動相A：配制3.1 2g/L磷酸二氫鈉溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5 ±0.2 ；流動相B：甲醇。流動相梯度如表1所示。

表1 流動相梯度Table1 Mobile phase gradient

1.4 高斯計(jì)算方法

所有的計(jì)算結(jié)果都是通過Gaussian09程序完成的[26]。勢能面中所有的反應(yīng)物、過渡態(tài)、中間體、產(chǎn)物均采用密度泛函理論(DFT)中b3lyp方法[27-29]，并且加上了d3(bj)色散校正，計(jì)算模型中原子使用6-31g(d)基組[30-31]。對反應(yīng)勢能面上的各駐點(diǎn)進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化，優(yōu)化完成后會對該構(gòu)型使用相同的基組和方法進(jìn)行振動頻率的計(jì)算，以確定優(yōu)化得到的結(jié)構(gòu)是最低點(diǎn)(沒有虛頻)或者是過渡態(tài)。內(nèi)稟反應(yīng)坐標(biāo)(intrinsic reaction coordinate)[32-33]來確定所得到過渡態(tài)連接的是正確的中間體。此外還考慮了溶劑化效應(yīng)，此次計(jì)算選取了PCM溶劑化模型。溶劑化下單點(diǎn)能計(jì)算使用了更大的基組def2tzvp。液相Gibbs自由能是由液相單點(diǎn)能和氣相Gibbs自由能的校正項(xiàng)(0℃)相加所得到的。除了特殊說明之外，本文討論部分都是液相Gibbs自由能。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)速對反應(yīng)速率的影響

為了初步判斷反應(yīng)的控制模式，首先研究了轉(zhuǎn)速對反應(yīng)速率的影響。實(shí)驗(yàn)步驟按照1.2 節(jié)所述，選擇兩相初始濃度均為3mmol/L，攪拌槳逆向同速攪拌保持兩相界面穩(wěn)定，攪拌速度從50r/min逐漸增加到300r/min，水相中哌拉西林濃度(CPRL)隨時間變化的結(jié)果如圖3所示。可以看出，隨著反應(yīng)時間的推進(jìn)，水相中哌拉西林含量逐漸增加。當(dāng)攪拌速率從50r/min增加到250r/min時，哌拉西林的合成速度隨攪拌速度的增加而增大。但攪拌速度增加到250r/min以上時，哌拉西林生成速率不再受攪拌強(qiáng)度的影響，說明此時消除了擴(kuò)散對反應(yīng)的影響。因此，攪拌速率在250～300r/min時，屬于反應(yīng)控制區(qū)域，即“坪區(qū)”。

圖3 不同轉(zhuǎn)速下水相中哌拉西林濃度隨時間的變化Fig.3 Change of piperacillin concentration in aqueous phase with time at different rotational speeds

2.2 反應(yīng)級數(shù)的確定

將哌拉西林的合成反應(yīng)簡化為：

測量過程中只取反應(yīng)初始很短一段時間的濃度變化，因此忽略反應(yīng)過程中pH對反應(yīng)的影響。設(shè)化學(xué)反應(yīng)的速率公式可以寫為式(2)：

假設(shè)α=β=0.5，則反應(yīng)為一級反應(yīng)，反應(yīng)物初始濃度相同，則速率方程可表示為式(3)：

將攪拌速率保持在300r/min，改變反應(yīng)物初始濃度(0.35 、1.5 、3、5mmol/L)進(jìn)行四組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示哌拉西林含量隨時間的變化如圖4所示，可以看出在最初一分鐘反應(yīng)生成的哌拉西林相對較多，這是因?yàn)閷⑺嗉尤氲胶憬缑娉氐倪^程中，反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生。因此，在加入水相時需要快速且盡量保持界面穩(wěn)定，同時在擬合動力學(xué)方程時從第1分鐘的數(shù)據(jù)開始采用。將上述條件下反應(yīng)物濃度按照一級反應(yīng)動力學(xué)擬合，如圖5。擬合結(jié)果R2均在99.9%以上，且不同初始濃度下，擬合得到的反應(yīng)速率k相近。忽略誤差的影響，認(rèn)為此時反應(yīng)速率常數(shù)穩(wěn)定，說明表觀界面反應(yīng)動力學(xué)方程符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，且反應(yīng)速率常數(shù)與濃度無關(guān)，說明此時均在反應(yīng)控制區(qū)域，不受擴(kuò)散的影響，這與2.1 節(jié)中結(jié)論一致。這與文獻(xiàn)[16]中報(bào)道的均相體系N-?；亩壏磻?yīng)動力學(xué)不同，推測原因有兩反應(yīng)物界面濃度與相本體濃度不同，相界面?zhèn)髻|(zhì)阻力的存在。

圖4 不同初始濃度下哌拉西林含量隨時間變化Fig.4 Change of piperacillin content with time at different initial concentrations

圖5 不同初始濃度下一級反應(yīng)動力學(xué)擬合圖Fig.5 Fitting diagram of first-order reaction kinetics at different initial concentrations

2.3 比界面積的影響

通過在恒界面池界面處裝配大小不同的圓環(huán)，來減小油水兩相接觸面積的大小。設(shè)置界面積分別為9.67 、8.45 、7.00 、6.05 、4.24 cm2，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他實(shí)驗(yàn)操作與1.2 節(jié)相同。將反應(yīng)過程中氨芐西林的濃度變化與時間擬合，得到反應(yīng)速率常數(shù)k，如圖6所示，擬合結(jié)果良好。隨后將反應(yīng)速率常數(shù)k-比界面積A/V作圖。結(jié)果如圖7所示，反應(yīng)速率常數(shù)隨著比界面積的增大而增大，并且擬合的直線不通過原點(diǎn)，說明反應(yīng)過程屬于化學(xué)反應(yīng)控制，并且反應(yīng)主要發(fā)生在相界面上。這說明界面面積對反應(yīng)影響很大，增大兩相的接觸面積可以有效加快反應(yīng)速率。驗(yàn)證前期工作，在微反應(yīng)體系中，通過膜分散微反應(yīng)器，將二氯甲烷相切割成微小的液滴，再與連續(xù)相的氨芐西林溶液混合，增大了兩相的接觸面積強(qiáng)化反應(yīng)的機(jī)制。

圖6 不同界面積下反應(yīng)速率常數(shù)k的擬合圖Fig.6 Fitting diagram of reaction rate constant k under different boundary areas

圖7 比界面積對反應(yīng)速率常數(shù)k的影響Fig.7 The effect of specific interfacial area on the rate constant k

2.4 pH的影響

氨芐西林和EDPC生成哌拉西林的過程中，體系的pH控制很重要。pH較低時，合成的縮合液中，兩種主要雜質(zhì)超標(biāo)；pH過高時，合成的縮合液中哌拉西林含量低。但pH對哌拉西林合成速率的影響并不清楚。這部分工作通過討論pH對哌拉西林合成反應(yīng)速率的影響，說明pH對哌拉西林產(chǎn)品品質(zhì)的影響原因。

按照1.2 節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，改變初始氨芐西林、EDPC濃度，并測量水相中氨芐西林濃度隨時間的變化。將氨芐西林的濃度與時間擬合，得到反應(yīng)速率常數(shù)k，如圖8所示，擬合結(jié)果良好。隨后將反應(yīng)速率常數(shù)k-pH作圖，結(jié)果如圖9所示。圖9顯示，隨著pH升高，反應(yīng)速率大幅加快。哌拉西林合成是快速的N-?；磻?yīng)，而反應(yīng)過快容易導(dǎo)致體系的不均勻性。一定的混合強(qiáng)度下，反應(yīng)越快體系越容易不均勻。體系不均勻?qū)?dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生和副產(chǎn)物增多，產(chǎn)品品質(zhì)下降。因此過高的pH對合成的哌拉西林產(chǎn)品的品質(zhì)是不利的。另一方面，堿性條件下β-內(nèi)酰胺四元環(huán)降解加快，降解副產(chǎn)物的增多也會導(dǎo)致哌拉西林產(chǎn)品品質(zhì)的下降。因此反應(yīng)中需要對pH進(jìn)行精確控制。

圖8 不同pH下反應(yīng)速率常數(shù)k的擬合圖Fig.8 Fitting diagram of reaction rate constant k at different pH

圖9 pH對反應(yīng)速率常數(shù)k的影響Fig.9 The effect of pH on the reaction rate constant k

2.5 溫度的影響

為了測量哌拉西林合成的表觀活化能，研究了溫度對反應(yīng)速率常數(shù)的影響。首先測量不同初始濃度(1.5、3、5mmol/L)反應(yīng)物條件下，反應(yīng)過程中氨芐西林的濃度隨反應(yīng)時間的變化，其他實(shí)驗(yàn)條件與1.2 節(jié)相同。擬合氨芐西林-時間，得到反應(yīng)速率常數(shù)k，如圖10所示，擬合結(jié)果良好。

圖10 不同溫度下反應(yīng)速率常數(shù)k的擬合圖Fig.10 Fitting diagram of reaction rate constant k at different temperatures

圖11 溫度對反應(yīng)速率常數(shù)k的影響Fig.11 Effect of temperature on the reaction rate constant k

為了對哌拉西林合成過程有更深入的了解，根據(jù)Eyring方程[35]計(jì)算活化焓ΔH和活化熵ΔS等熱力學(xué)參數(shù)，其表達(dá)式如式（4）：

圖12 ln(k/T)-T-1擬合圖Fig.12 Fitting diagram of ln(k/T)-T-1

工業(yè)中，通常將哌拉西林的合成反應(yīng)控制在0℃左右進(jìn)行，此時的Gibbs自由能約為87.7 kJ/mol。

2.6 模擬計(jì)算

通過高斯計(jì)算，尋找過渡態(tài)，計(jì)算反應(yīng)物、生成物、中間體、過渡態(tài)的自由能變化(圖13)，從而推測氨芐西林和EDPC合成哌拉西林的反應(yīng)機(jī)理。模擬體系溫度為0℃，溶液中兩種反應(yīng)物靠近時，能量略有增加；隨著氨芐西林的氨根上的氮原子進(jìn)攻EDPC的碳原子，能量大幅升高，形成過渡態(tài)ts1；碳氮鍵形成后能量下降，得到中間體ts2-ini，親核加成結(jié)束。接著C上的氯原子和N上的氫原子互相碰撞，脫掉氯化氫，得到最終產(chǎn)物哌拉西林。高斯計(jì)算結(jié)果顯示反應(yīng)過程中決速步驟是第一步親核加成，自由能壘為39.7 kJ/mol。高斯計(jì)算通常單分子反應(yīng)以自由能壘小于88kJ/mol作為標(biāo)準(zhǔn)判斷常溫下反應(yīng)是否容易發(fā)生，其半衰期為4.5min；當(dāng)能壘降低到63kJ/mol時，其半衰期只有0.01 s，可以推測合成哌拉西林的反應(yīng)是非?？斓摹?shí)驗(yàn)測得的表觀活化能為26.5 kJ/mol，二者存在一定的誤差，分析其來源可能主要有兩點(diǎn)原因：一是高斯計(jì)算模擬兩個反應(yīng)物分子在非常理想情況下的反應(yīng)，而實(shí)際體系要復(fù)雜的多，需要考慮反應(yīng)物分子與分子之間的相互作用以及溶劑與溶質(zhì)分子之間的相互作用；二是模擬中是均相體系而實(shí)際體系是多相，溶劑環(huán)境不同導(dǎo)致二者差異。

圖13 氨芐西林與EDPC合成哌拉西林過程中自由能變化及中間體、過渡態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.13 Free energy changes,intermediate and transition state structures during the synthesis of piperacillin with ampicillin and EDPC

3 結(jié) 論

氨芐西林水溶液和EDPC的二氯甲烷溶液在油水界面處反應(yīng)，合成哌拉西林。本文利用恒界面池研究非均相反應(yīng)體系的界面表觀反應(yīng)動力學(xué)，詳細(xì)討論了攪拌速率、比界面積、pH、溫度對反應(yīng)速率的影響，得到反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)與熱力學(xué)數(shù)據(jù)，并通過與DFT結(jié)合推導(dǎo)反應(yīng)機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：攪拌速度大于250r/min時，出現(xiàn)與攪拌強(qiáng)度無關(guān)的化學(xué)反應(yīng)控制“坪區(qū)”，隨后確定表觀界面反應(yīng)動力學(xué)符合一級動力學(xué)模型；反應(yīng)速率常數(shù)與比界面積成正比，隨pH升高快速增大；由溫度與反應(yīng)速率常數(shù)的關(guān)系可知，這是一個放熱反應(yīng)，反應(yīng)的活化能Ea=26.5 kJ/mol，焓 變ΔH為23.9 kJ/mol，熵 變ΔS為232.7 J/(mol·K)，在T=273.15 K時，Gibbs自 由 能87.7 kJ/mol。隨后通過高斯計(jì)算，推測N-酰基化反應(yīng)過程中自由能變化及中間體、過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，說明反應(yīng)的決速步驟是第一步親核加成，并得到反應(yīng)273.15 K下自由能壘為39.7 kJ/mol，合成反應(yīng)是快反應(yīng)，反應(yīng)的自由能變化為95.8 kJ/mol。