李 健，劉友花，解福雙，王 丹，郭志剛

（浙江清華長(zhǎng)三角研究院，浙江嘉興 314000）

0 引言

大豆孢囊線蟲病是由大豆孢囊線蟲Heterodera glycines Ichinohe引起的一種世界性大豆病害[1]，農(nóng)業(yè)上主要以優(yōu)化栽培模式、施用化學(xué)藥劑等方式進(jìn)行防治，但收效低且易引起環(huán)境污染等問(wèn)題[2]。植物中的天然代謝產(chǎn)物大多具有高效低毒、對(duì)環(huán)境友好等特性，將其開發(fā)成殺線蟲農(nóng)藥，對(duì)線蟲防治及綠色農(nóng)藥發(fā)展具有重要意義。博落回Macleaya corada（Willd）R.Br屬于罌粟科Papaveraceae博落回屬M(fèi)acleaya，是一味常用中藥，已有學(xué)者對(duì)其提取物殺菌或藥理活性進(jìn)行試驗(yàn)[3]。但對(duì)其殺蟲活性研究較少，現(xiàn)有殺蟲研究方向主要為鱗翅目[4]、雙翅目的害蟲。

為解決化學(xué)農(nóng)藥所帶來(lái)的食品安全性問(wèn)題，本文對(duì)博落回粉末分離提取，將提取物進(jìn)行追蹤活性實(shí)驗(yàn)，研究博落回提取物對(duì)大豆孢囊線蟲幼蟲是否具有致死活性，以求用植物源物質(zhì)對(duì)大豆孢囊線蟲進(jìn)行防控，實(shí)現(xiàn)防治大豆胞囊線蟲的目標(biāo)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器：柱色譜正相硅膠（200~300目），青島海洋化工廠。HPLC儀器，LC-20A型液相色譜儀（日本島津公司）；MPLC采用Dr Flash-S分離純化系統(tǒng)（蘇州匯通有限公司），色譜柱為ODS（C18，MB100 40~75μm，F(xiàn)uji，日本）。江南NSZ-608T三目體式顯微鏡，南京市鼓樓區(qū)淘微視光學(xué)儀器銷售部。

1.1.2 材料：博落回粗粉購(gòu)于長(zhǎng)沙上禾生物有限公司，由郭志剛教授鑒定，并存放于浙江清華長(zhǎng)三角研究院1801標(biāo)本柜。大豆孢囊線蟲（H.glycines），自浙江省嘉興市秀洲區(qū)油車港鎮(zhèn)一大豆種植地分離得到。灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），取自西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，存放于浙江清華長(zhǎng)三角研究院1801標(biāo)本柜。6cm培養(yǎng)皿，24孔板，人工氣候箱，移液槍，PDA培養(yǎng)基，無(wú)菌水，乙醇，石油醚，乙酸乙酯，丙酮，乙醇。

1.2 提取和分離

博落回粗粉20 kg，用75%乙醇回流提取2次，得到乙醇提取液。乙醇提取液經(jīng)減壓濃縮后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3~4次，經(jīng)HPLC檢驗(yàn)石油醚部位提取物和乙酸乙酯部位提取物成分類似，合并記為M。M經(jīng)正向硅膠柱層析，增加梯度洗脫，經(jīng)TLC檢查合并，得到M1~M8共8個(gè)部分（M2發(fā)霉，不進(jìn)行試驗(yàn)），根據(jù)活性追蹤結(jié)果，將有效部分經(jīng)MPLC分離，TLC板以及HPLC分析驗(yàn)純，得到二次分離提取物。

1.3 大豆孢囊線蟲培養(yǎng)方法

將灰葡萄孢菌接種到PDA培養(yǎng)基中，置于人工氣候箱培養(yǎng)（T=26℃，RH=72%，光周期光：暗=14：10）。菌絲長(zhǎng)滿后，取200 μ l線蟲原液加入培養(yǎng)皿中，送回人工氣候箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿中的菌絲被線蟲食盡，取2 ml無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)皿上蓋，將沖洗液吸取至1.5 ml的離心管中，得到線蟲液A，備用。

1.4 大豆孢囊線蟲實(shí)驗(yàn)方法

取1 ml無(wú)菌水加入到新的2 ml離心管中，再取10 μ l線蟲液A轉(zhuǎn)移至該離心管中得到稀釋后的線蟲液B，混勻后取50 μ l線蟲液置于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，得到線蟲密度。

利用24孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理中，線蟲數(shù)50條左右，單個(gè)處理含藥量為1 mg/mL。實(shí)驗(yàn)組：50 μ l線蟲液B，10 μ l藥液（濃度100 mg/ml）+1 ml無(wú)菌水，單個(gè)實(shí)際藥物量1 mg，6個(gè)重復(fù)（3個(gè)重復(fù)用于統(tǒng)計(jì)24h效果，6個(gè)重復(fù)用于統(tǒng)計(jì)48h效果）。對(duì)照組：50 μ l線蟲液B，10 μ l丙酮液+1 mL無(wú)菌水，3個(gè)重復(fù)。

1.5 計(jì)數(shù)方法

處理24h，48h后，用NaOH溶液刺激法判斷大豆孢囊線蟲是否死亡并計(jì)數(shù)記錄。用Excel軟件計(jì)算校正死亡率[5]。24h致死率%=（24h線蟲存活數(shù)-初始線蟲數(shù)）/初始線蟲數(shù)*100%；48h致死率%=（48h線蟲存活數(shù)-初始線蟲數(shù)）/初始線蟲數(shù)*100%。殺線蟲強(qiáng)弱分級(jí)[6]：校正死亡率≤10，無(wú)活性“－”；10.1%≤校正死亡率≤30%，弱活性“＋”；30.1%≤校正死亡率≤50%，中等活性“＋＋”；50.1%≤校正死亡率≤80%，較強(qiáng)活性“＋＋＋”；80.1%≤校正死亡率，強(qiáng)活性“＋＋＋＋”。

2 博落回提取物對(duì)大豆孢囊線蟲的抑制作用

2.1 博落回粗提物對(duì)大豆孢囊線蟲的致死效果

根據(jù)博落回提取物對(duì)大豆孢囊線蟲的測(cè)定結(jié)果（表1）。24h處理后，M1、M3、M5、M6部殺蟲效果較弱。M4、M7、M8部對(duì)大豆孢囊線蟲的致死能力較強(qiáng)強(qiáng)，活性強(qiáng)度為“＋＋＋”。48h處理后，M1、M5、M6部致死率有所提升，達(dá)50%以上，M3和M8部校正死亡率降低，M4和M7部對(duì)致死效果略微提升，活性強(qiáng)度為“＋＋＋”。

表1?博落回粗提物對(duì)大豆孢囊線蟲24h及48h致死效果

2.2 博落回二次提純粗提物對(duì)大豆孢囊線蟲的致死效果

依據(jù)粗提物的藥效結(jié)果，將M4進(jìn)行二次提純，共分得10個(gè)段，M4-1~M4-10（配置藥劑前，M4-1發(fā)霉，故不進(jìn)行試驗(yàn)）。根據(jù)博落回二次純化提取物對(duì)大豆孢囊線蟲的測(cè)定結(jié)果，具體測(cè)定結(jié)果見表2。

表2?二次提純博落回粗提物對(duì)大豆孢囊線蟲致死效果

24h處理后，M4-2、M4-3、M4-5~M4-10對(duì)大豆胞囊線蟲致死活性較弱，M4-4對(duì)大豆胞囊線蟲的致死效果極強(qiáng)，活性強(qiáng)度達(dá)“＋＋＋＋”。48h處理后，M4-2、M4-5、M4-8、M4-9致死效果下降，M4-3和M4-6活性不變，M4-7，活性略微提升，活性強(qiáng)度“＋＋＋”，M4-4活性穩(wěn)定，活性強(qiáng)度“＋＋＋＋”。

3 結(jié)語(yǔ)

目前約有102科226屬316種植物被報(bào)道具有殺線蟲或抑制線蟲活性[7]，但大多未被開發(fā)成防治藥劑。博落回是一種常見植物，作為殺蟲藥劑來(lái)源，具有資源豐富，低毒高效的優(yōu)勢(shì)，目前已有農(nóng)藥公司利用博落回提取物開發(fā)出1%血根堿可濕性粉劑（5%博落回生物堿）用于防治菜青蟲等害蟲[8，9]。根據(jù)本研究結(jié)果，可知博落回提取物M4具有較高的殺蟲活性，其二次分離得到的M4系列的提取物中，M4-4具有極強(qiáng)殺蟲活性，且具有長(zhǎng)效性。

因此，博落回主莖粉末提取物對(duì)大豆孢囊線蟲有較強(qiáng)致死作用，博落回粗提物中存在對(duì)大豆胞囊線蟲具有致死活性的物質(zhì)，具有開發(fā)成防治大豆孢囊線蟲的潛力。今后，隨著對(duì)博落回提取物進(jìn)一步分離并對(duì)其單體化合物的殺線蟲活性的深入試驗(yàn)研究，有望將其開發(fā)成一種新型防治大豆孢囊線蟲的生物農(nóng)藥。