徐金銘，金 戈，李 超，于曉明

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林 132101）

0 引言

作物的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)，離不開氮肥的生產(chǎn)和利用，甚至作物產(chǎn)量的50%左右都受到氮素的影響。玉米是高需氮作物，氮的吸收利用效率與玉米的產(chǎn)量直接相關?？赏ㄟ^發(fā)掘有效氮響應基因和繁育低氮耐受玉米品種，提高貧瘠地區(qū)玉米產(chǎn)量[1]，氮肥的合理使用會極大為玉米生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，最終會決定作物的總產(chǎn)量[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常存在的現(xiàn)象是氮肥施用量大造成浪費。使用的大量的氮肥不僅沒有使產(chǎn)量有實質(zhì)的提升，相反的是造成了極大的資源浪費和對環(huán)境有了惡劣影響，這并不不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。據(jù)統(tǒng)計，全球的氮肥消耗量中，中國超過1/3，且氮肥的使用嚴重超標，更嚴重的是氮肥利用率偏低，只有30%左右[4]。分析玉米低氮耐受性形成的機理，提高玉米氮利用效率，是解決上述問題的關鍵。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究使用的試驗材料為玉米自交系B73和Mo17。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米低氮處理。對玉米在水培條件下進行低氮條件培養(yǎng)（硝酸鹽作為唯一氮源）。挑選大小一致、子粒飽滿的種子，置于濕潤濾紙上25℃發(fā)芽48 h；芽生長至0.5 cm左右時，選擇出芽一致的種子去除胚乳，移入裝有改良的Hoagland營養(yǎng)液（KNO3濃度為5 mM）中培養(yǎng)5天，電動氣泵每天通氣12 h；再分別以無氮（0mM KNO3）、低氮（0.5 mM KNO3）和正常（5 mM KNO3）營養(yǎng)液培養(yǎng)15天，然后稱量玉米植株的干重、氮含量等。

1.2.2 玉米生理指標測定。我們檢測了在低氮（0.5 mM KNO3）和正常氮（5 mM KNO3）條件下生長的B73和Mo17的不同生理指標，包括：總氮含量、硝酸還原酶（NR）活性、亞硝酸還原酶（NiR）活性。用Elementar isprime 100 vario EL（Elementar，German）測量總氮的量，使用Smartchem 450自動化學分析儀（Unitscience，USA）測定硝酸鹽的含量。硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性檢測分別使用NR和NIR分析試劑盒（Plant）（Jonln，China）完成。

1.2.3 基因表達分析。對V1期玉米植株進行正常氮（5 mM KNO3）和低氮處理（0.5 mM KNO3）24 h，提取植株總RNA。使用熒光實時定量PCR法，檢測玉米硝酸還原酶基因ZmNNR1和ZmNNR2。反轉(zhuǎn)錄和熒光實時定量PCR反應參照Meng等人方法[5]，使用的內(nèi)參基因為ZmACT1。

2 結果與分析

2.1 不同氮濃度條件下玉米自交系的表型分析

對發(fā)芽后5天的玉米植株進行不同濃度的氮處理：正常氮（5mM KNO3）、低氮（0.5mM KNO3）、無氮（0mM KNO3）處理，處理15天后比較兩個自交系之間的生物量和側根長。結果發(fā)現(xiàn)，外源氮素的減少影響了B73和Mo17生物量的積累（圖1A）。值得注意的是，在正常氮和無氮條件下，自交系B73與Mo17的干重之間無明顯差異；而在低氮的情況下，自交系Mo17的干重顯著高于B73（圖1）。上述結果表明，Mo17在低氮條件下比B73具有更快的物質(zhì)積累速度。

2.2 不同氮濃度條件自交系的生理分析

硝酸鹽是植物可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素合成的重要氮素來源，葉片總氮可以作為植物整體氮代謝狀態(tài)的評價指標[7]。本研究對玉米葉片總氮含量檢測發(fā)現(xiàn)，在低氮（0.5mM KNO3）條件下，自交系Mo17與B73的總氮含量有顯著差異（P<0.05）；在正常氮（5mM KNO3）條件下，Mo17與B73的差異不顯著（圖1B）。

圖1?不同氮濃度條件下的玉米干重、硝酸還原酶活性與基因表達分析

我們進一步分析了Mo17和B73中的硝酸還原酶活性，結果如圖1C所示，在正常氮條件下，Mo17與B73中的硝酸還原酶活性的差異不顯著；而在低氮條件下，Mo17的硝酸還原酶活性顯著高于B73。對亞硝酸還原酶活性的檢測發(fā)現(xiàn)，在低氮（0.5mM KNO3）條件和正常氮（5mM KNO3）條件下，Mo17與B73無顯著差異（圖1D）。上述結果表明，Mo17具有更高硝酸還原酶活性，從而使Mo17具有更高的氮利用效率。

2.3 不同氮條件下關鍵氮響應基因表達分析

因為Mo17中具有較高的硝酸還原酶活性，因此我們檢測了Mo17和B73中的硝酸還原酶基因ZmNNR1和ZmNNR2的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，在正常氮和低氮條件下，Mo17中的ZmNNR1和ZmNNR2表達水平都顯著高于B73（圖1E，F(xiàn)）。這個結果表明，Mo17中硝酸還原酶活性的提高可能是ZmNNR1和ZmNNR2的高表達造成的。

3 結語

玉米是我國最重要的大田糧食作物之一，也是一種研究較多的遺傳模式植物。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米在低氮環(huán)境條件下，自交系Mo17的耐受性比B73明顯提高。在低氮條件下，Mo17體內(nèi)積累了更多的氮素，而且Mo17的干物質(zhì)積累速度也均快于B73。

植物根部吸收外源的硝酸根后，進行還原反應的第一步是在硝酸還原酶的作用下將硝酸根還原成亞硝酸根。本研究進一步的生理分析發(fā)現(xiàn)，Mo17在低氮條件下具有更高的硝酸還原酶活性，這可能是Mo17對低氮的耐受性強于B73的主要原因。而且，對ZmNNR1和ZmNNR2基因表達的分析發(fā)現(xiàn)，Mo17中的ZmNNR1和ZmNNR2表達也顯著高于B73。因此，我們認為Mo17表現(xiàn)出更強的低氮耐受性是由于其具有更高的硝酸還原酶基因表達水平，增強了體內(nèi)的硝酸還原酶活性，從而提高了Mo17的氮吸收效率。