張 紅，徐瑩莉，王超楠，黃志銀，范偉強(qiáng)，李 梅，張 斌

(1.天津科潤(rùn)蔬菜研究所，蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300381；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，天津 300384)

大白菜(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)是一種兩年生葉用蔬菜，隸屬十字花科蕓薹屬蕓薹種，其最早源于我國(guó)，并在我國(guó)栽培歷史久遠(yuǎn)，屬于目前我國(guó)蔬菜栽培中分布最廣、種植面積最大的蔬菜作物之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年大白菜的播種面積約達(dá)266.7 萬(wàn)hm2，占蔬菜總播種面積的15%左右[1]，產(chǎn)值超過(guò)600億元，是我國(guó)的主要出口創(chuàng)匯蔬菜之一。但近年來(lái)在大白菜栽培中由于土壤缺鈣或栽培管理不當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊懴拢环N白菜的生理性病害-干燒心病頻發(fā)且呈現(xiàn)日趨嚴(yán)重的趨勢(shì)，儼然已成為繼三大病害之后，又一嚴(yán)重阻礙大白菜生產(chǎn)的病害之一。該病發(fā)病后于外表難以察覺(jué)，但剖開(kāi)后內(nèi)部球葉呈現(xiàn)“夾葉爛”現(xiàn)象，對(duì)大白菜的產(chǎn)量及其結(jié)球品質(zhì)均造成極大影響，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致品種完全喪失商品性，進(jìn)而損害農(nóng)戶的利益。

在實(shí)際栽培中對(duì)常見(jiàn)病害的防治措施主要分為3種，即物理防治、化學(xué)防治和抗病育種防治[2-6]。干燒心病是由缺鈣引起的生理性病害，屬于不可逆的生理紊亂，農(nóng)耕等物理防治無(wú)法有效控制干燒心的發(fā)生，且改變復(fù)雜的栽培環(huán)境難度較大，使用化學(xué)藥劑防治成本高且易導(dǎo)致農(nóng)業(yè)環(huán)境污染，相較而言，抗病育種無(wú)疑是最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的預(yù)防措施。但采用傳統(tǒng)的育種方法培育抗病品種，選育周期相對(duì)較長(zhǎng)，耗費(fèi)人力地力，且大白菜干燒心病受環(huán)境影響較大，因此，單純依靠主觀經(jīng)驗(yàn)和田間觀察來(lái)篩選育種材料會(huì)相對(duì)困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，將表型鑒定與分子鑒定相結(jié)合來(lái)探究干燒心病抗病遺傳規(guī)律，挖掘相關(guān)的抗病基因，開(kāi)發(fā)連鎖緊密的分子標(biāo)記，進(jìn)而選育性狀優(yōu)良的抗病品種顯然是開(kāi)展干燒心抗病育種的最佳途徑。本試驗(yàn)探究了青麻葉H227中抗干燒心基因的遺傳規(guī)律，并設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了緊密連鎖的抗干燒心病分子標(biāo)記，同時(shí)結(jié)合F2及BC1F1的表型鑒定結(jié)果驗(yàn)證了標(biāo)記的適應(yīng)性，既為抗病篩選提供了有效工具，也為今后開(kāi)展干燒心病的高效抗病育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及分子標(biāo)記

以白麻葉大白菜的高代自交系G83作為干燒心感病親本和輪回親本，青麻葉H227作為抗病親本，兩親本材料均經(jīng)過(guò)3 a以上的田間表型嚴(yán)格篩選獲得，干燒心病抗感差異顯著。同步構(gòu)建200株樣本量的F2群體和100株樣本量的BC1F1群體，材料均由天津科潤(rùn)蔬菜研究所提供。

分子標(biāo)記基于已發(fā)表的抗干燒心分子標(biāo)記文章[7-13]和大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。引物由華大基因公司合成。

1.2 大白菜干燒心病表型鑒定方法

大白菜的室內(nèi)鑒定方法采用離體葉片扦插法[14-16]，即：將花泥均勻打孔，待大白菜生長(zhǎng)至五葉期時(shí)，采集植株自生長(zhǎng)點(diǎn)起的第2片真葉。用2% NaClO對(duì)離體葉片的葉柄消毒5 s，再用蒸餾水沖洗2遍。消毒后的葉片插入浸滿鑒定液(2 mmol/L EDTA-Na2，10 mg/L GA3(pH=6.0))的花泥中(圖1)。

圖1 大白菜干燒心病離體扦插鑒定Fig.1 Identification of Chinese cabbage dry burning heart disease in vitro cuttings

室溫下放置3 h后即轉(zhuǎn)入25 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)觀察每個(gè)葉片枯邊程度及1個(gè)視野中小黑點(diǎn)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，選取穩(wěn)定表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

白菜干燒心病病情調(diào)查方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考金秀卿等[7]所述，劃分為5個(gè)等級(jí)(表1)，按照0～7級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)單株發(fā)病情況(圖2)，再對(duì)病情分級(jí)加以整理，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算遺傳參數(shù)并繪制頻數(shù)分布直方圖。

表1 大白菜干燒心病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The grade standards of dry burning heart disease symptoms in Chinese cabbage

圖2 大白菜干燒心病離體葉片的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 The disease grading standard of isolated leaves of Chinese cabbage with dry burning heart disease

1.3 大白菜干燒心病的分子鑒定方法

采用改良后的堿裂解法[17]批量提取親本、F1、F2等待測(cè)大白菜基因組的DNA，利用分光光度計(jì)的OD260/280值對(duì)提取得到的大白菜基因組DNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。DNA呈現(xiàn)明顯單峰曲線，且OD260/280值介于1.8～2.0，表明DNA質(zhì)量較好。合格的DNA樣品濃度即可統(tǒng)一稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆没虿捎?0 μL的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和快速顯影法即可統(tǒng)計(jì)檢測(cè)電泳條帶多態(tài)性。

基于上述表型鑒定及分子鑒定方法，利用Join Map 4.0軟件整理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，將LOD設(shè)定為3.0，分析目標(biāo)基因與分子標(biāo)記間的連鎖關(guān)系，構(gòu)建連鎖圖譜，完成基因的初步定位，并在定位區(qū)間內(nèi)開(kāi)發(fā)篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜干燒心室內(nèi)表型鑒定結(jié)果與遺傳學(xué)分析

利用離體葉片扦插法對(duì)干燒心抗感親本H227和G83以及F1、F2群體，BC1F1群體進(jìn)行表型鑒定，根據(jù)表2的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，觀察小黑點(diǎn)和枯邊性狀在各單株中的表現(xiàn)情況，通過(guò)室內(nèi)表型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)并利用病情級(jí)數(shù)繪制頻率分布直方圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)H227和G83構(gòu)建的F1趨向于抗病，F(xiàn)2群體和BC1F1群體病情分級(jí)呈現(xiàn)出明顯的單峰分布，接近于正態(tài)分布，因此，分析大白菜干燒心抗病遺傳規(guī)律為數(shù)量性狀遺傳，與金秀卿等[7]的結(jié)論相符合。

表2 大白菜干燒心病室內(nèi)表型鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 Statistical results of laboratory phenotypic identification of dry burning heart disease in Chinese cabbage

圖3 大白菜干燒心病病情級(jí)數(shù)在F2和BC1F1中的頻率分布Fig.3 Frequency distribution of the dry burning heart diseaseprogression of Chinese cabbage in the F2 and BC1F1 generations

2.2 干燒心病抗性基因分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

根據(jù)室內(nèi)表型鑒定結(jié)果，從F2分離群體中選擇極抗(0級(jí))和極感(7級(jí))各12株構(gòu)建抗感池。天津科潤(rùn)蔬菜研究所大白菜課題組前期開(kāi)展了大量干燒心病相關(guān)研究，金秀卿[18]針對(duì)干燒心抗感雙親H227和B120構(gòu)建了DH群體，結(jié)合2 a的田間干燒心表型鑒定數(shù)據(jù)，利用MapQTL 5.0軟件進(jìn)行了QTL分析，初步獲得了貢獻(xiàn)率大于10%的主效QTL位點(diǎn)，且位點(diǎn)位于A07染色體上，得到與抗干燒心病共分離的分子標(biāo)記BrID10343和緊密連鎖的標(biāo)記BrID10349，因此，試驗(yàn)首先基于前期試驗(yàn)基礎(chǔ)及已公布的抗干燒心分子標(biāo)記在本試驗(yàn)父母本及F1間進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記在本試驗(yàn)雙親間缺乏多態(tài)性，分析可能標(biāo)記與基因的連鎖性稍差，需繼續(xù)對(duì)大白菜基因組開(kāi)展分子標(biāo)記篩選(圖4)。

圖4 分子標(biāo)記BrID10343對(duì)B120、H227、G83的電泳檢測(cè)Fig.4 Detection results of molecular marker BrID10343 on B120，H227，G83

首先確定抗病基因的染色體位置，根據(jù)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//brassicadb.cn/)的信息，選擇平均分布于10條染色體上的30對(duì)分子標(biāo)記在雙親H227和G83及F1間進(jìn)行多態(tài)性分子標(biāo)記的初步篩選，結(jié)果僅在A07染色體上獲得1對(duì)分子標(biāo)記BrID101105具有多態(tài)性，多態(tài)性標(biāo)記在24株極端抗感池驗(yàn)證，仍表現(xiàn)穩(wěn)定多態(tài)性。表明試驗(yàn)材料H227的抗源基因的確位于A07染色體上，與金秀卿等[7]的染色體定位結(jié)果相符(圖5)。

圖5 多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選Fig.5 Screening of polymorphic molecular markers

根據(jù)A07染色體上的大白菜序列信息，參考標(biāo)記BrID10343、BrID10349及多態(tài)性標(biāo)記BrID101105的位置，瞄定在物理區(qū)間25～27 cM設(shè)計(jì)緊密連鎖的分子標(biāo)記，利用Primer Primier 5.0軟件開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)引物4對(duì)(表3)，將新設(shè)計(jì)的引物在雙親、F1和極端抗感池中進(jìn)行篩選驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記BrIDCRT07具有穩(wěn)定多態(tài)性。采用JoinMap 4.0和Mapchart軟件對(duì)BrID10343、BrID10349、BrIDCRT07等標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜(圖6)，顯示該分子標(biāo)記介于BrID10343 和BrID10349之間，與BrID10343的遺傳距離為0.13 cM，與BrID10349的遺傳距離為0.78 cM。

圖6 分子標(biāo)記BrIDCRT07在A07染色體上的遺傳位置Fig.6 Genetic location of the molecular marker BrIDCRT07 on the A07 chromosome

表3 干燒心病引物序列信息Tab.3 Molecular marker sequence information of dry burning heart disease

2.3 干燒心病抗性基因分子標(biāo)記的驗(yàn)證

利用離體葉片扦插法和新設(shè)計(jì)的連鎖標(biāo)記BrIDCRT07對(duì)F2群體及BC1F1群體分別進(jìn)行分子鑒定和表型鑒定，結(jié)果如表4，5，F(xiàn)2群體內(nèi)各單株的分子鑒定與表型鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果基本一致，吻合率可達(dá)86.8%，BC1F1群體內(nèi)分子鑒定與表型鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果吻合率可達(dá)94.9%，表明該分子標(biāo)記今后可用于抗病材料H227抗病基因的篩選。

3 結(jié)論與討論

天津青麻葉類型是我國(guó)大白菜家族中一個(gè)具有代表性的類型，屬于天津特有的類型，本課題組多年的田間調(diào)查也發(fā)現(xiàn)青麻葉大白菜不僅自身優(yōu)良性狀眾多，對(duì)干燒心病也具有穩(wěn)定的抗性，因此，適于作為抗原材料研究。

表4 F2干燒心病分子鑒定和表型鑒定Tab.4 Molecular identification and phenotypic identification of F2 dry burning heart disease

表4(續(xù))

表4(續(xù))

表5 BC1F1干燒心病分子鑒定和表型鑒定Tab.5 Comparison of in vitro cutting and molecular identification results of BC1F1 dry burning heart

表5(續(xù))

本研究利用純合抗干燒心病的青麻葉骨干系材料H227作為母本，感病的白麻葉材料G83作為父本和輪回親本，分別構(gòu)建F2及BC1F1群體，為了解遺傳特征，采用離體葉片溶液扦插法作為干燒心病表型鑒定方法，進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，病情級(jí)數(shù)的頻數(shù)分布表現(xiàn)出明顯的單峰分布，接近于正態(tài)分布，遺傳規(guī)律表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳特征，獲得的結(jié)果與前人[19-20]的研究結(jié)果一致。

而自1946 年Shafer 等首次報(bào)道大白菜干燒病的癥狀表現(xiàn)及病因以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)此病開(kāi)展了大量研究，也普遍認(rèn)為干燒心病受到多基因控制[9-10]，抗病育種研究相對(duì)復(fù)雜。本研究相對(duì)金秀卿等[7]對(duì)干燒心基因采取的QTL定位方式不同，首次將植物中復(fù)雜的數(shù)量性狀通過(guò)分級(jí)轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的質(zhì)量性狀進(jìn)行考慮分析，以F2和BC1F1作為定位和驗(yàn)證群體，定向定位并開(kāi)發(fā)了相對(duì)連鎖的分子標(biāo)記，標(biāo)記普遍適用于本試驗(yàn)雙親所構(gòu)建的回交后代，可以為大白菜干燒心抗病育種提供有力的篩選工具。

但考慮到不同類型不同品種間抗病基因或抗病性會(huì)存在一定的差異[6-8]。若試驗(yàn)材料改變，可能會(huì)導(dǎo)致現(xiàn)有標(biāo)記的通用性降低，例如在開(kāi)發(fā)多態(tài)性標(biāo)記過(guò)程中，本試驗(yàn)基于前人[7]對(duì)同一抗病親本H227所開(kāi)發(fā)標(biāo)記BrID10343 和 BrID10349進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記在抗感親本H227和G83中不具有多態(tài)性?？赡苡捎谇叭说臉?biāo)記與抗性基因之間的連鎖尚不夠緊密，標(biāo)記的通用性有限，因此，在應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種時(shí)首先進(jìn)行通用性的驗(yàn)證十分必要。下一步也將對(duì)標(biāo)記的通用性持續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證，并在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上不斷開(kāi)發(fā)更緊密連鎖的分子標(biāo)記。