張錦錦，王云平，王 筱，張書(shū)興，王學(xué)敏

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.北京匯誠(chéng)綠洲園林工程有限公司，北京 100125)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中廣泛存在，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[1]、水稻(OryzasativaL.)[2]、大豆(GlycinemaxL.)[3]、玉米(ZeamaysL.)[4]、小麥(TriticumaestivumL.)[5]、棉花(GossypiumhirsutumL.)[6]等植物中均已發(fā)現(xiàn)多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與了多種生物學(xué)過(guò)程，例如種子萌發(fā)[7-8]、植物生長(zhǎng)和發(fā)育[9]、植物衰老[10]等。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與了植物體內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[7，11-14]，例如生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)，植物免疫應(yīng)答和病原體防御[15-16]。WRKY基因的結(jié)構(gòu)域是由60個(gè)氨基酸殘基所組成的，由于所有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子都有一段高度保守的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域，所以被統(tǒng)稱為WRKY轉(zhuǎn)錄因子[17]。研究表明，高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域是WRKY轉(zhuǎn)錄因子最主要的特征，使其能特異識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)的W-box(C/TTGACC/T)作用元件，直接或間接結(jié)合參與植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程基因的順式作用元件，從而誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，調(diào)控植物各種發(fā)育與生理過(guò)程。研究證明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控干旱、低溫、鹽堿等脅迫響應(yīng)途徑中發(fā)揮重要作用[18-19]。例如，在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtWRKY25、AtWRKY33基因可提高植株的耐鹽性[20]；擬南芥中過(guò)表達(dá)大豆GsWRKY20基因可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性[21]；在擬南芥中過(guò)表達(dá)小麥TaWRKY79，當(dāng)植株受到NaCl和ABA的誘導(dǎo)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性[22]；將大豆GmWRKY21在擬南芥中異源表達(dá)，與野生型植株相比，GmWRKY21轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性增強(qiáng)[23]。綜上所述，WRKY蛋白是植物抗非生物脅迫的關(guān)鍵因子，但WRKY家族成員眾多，參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也十分復(fù)雜，人們對(duì)該家族基因的蛋白表達(dá)方面了解甚少。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種重要的豆科牧草，在世界各地廣泛種植，因其良好的飼用價(jià)值，成為畜牧業(yè)的首選青飼料之一[24]。但紫花苜蓿產(chǎn)量嚴(yán)重受鹽堿、干旱、溫度等環(huán)境條件的制約[25]。紫花苜蓿對(duì)非生物逆境的響應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，目前多從生理生化及分子生物學(xué)等角度對(duì)其進(jìn)行解析[26-27]。蛋白質(zhì)是植物各種生理變化的執(zhí)行者，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者更注重蛋白質(zhì)在植物體中的作用研究。相對(duì)于擬南芥、大豆等作物中的WRKY基因的研究，對(duì)紫花苜蓿WRKY轉(zhuǎn)錄因子在蛋白水平的研究鮮有報(bào)道。在前期的轉(zhuǎn)錄組高表達(dá)差異基因研究中發(fā)現(xiàn)，MsWRKY33基因在多種非生物逆境中均出現(xiàn)高豐度差異表達(dá)，推測(cè)其可能參與到非生物逆境的響應(yīng)途徑中，但是具體功能還有待進(jìn)一步研究。為在蛋白水平上探索紫花苜蓿MsWRKY33基因的生物學(xué)功能，本研究以中苜1號(hào)紫花苜蓿為材料，對(duì)MsWRKY33蛋白結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并基于抗原-抗體的特異性免疫識(shí)別，通過(guò)免疫印跡技術(shù)分析了多種逆境和ABA處理?xiàng)l件下MsWRKY33蛋白的表達(dá)特征。該研究豐富了對(duì)MsWRKY33基因功能的認(rèn)識(shí)，并初步分析了MsWRKY33蛋白在紫花苜蓿響應(yīng)多種非生物逆境中的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

中苜1號(hào)紫花苜蓿為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 使用ExPASy(https：//web.expasy.org/)對(duì)MsWRKY33蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)用于預(yù)測(cè)MsWRKY33保守功能結(jié)構(gòu)域；使用TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白跨膜序列；PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽等二級(jí)結(jié)構(gòu)；用BEPITOPE軟件對(duì)MsWRKY33蛋白進(jìn)行免疫原性預(yù)測(cè)。確定該蛋白的免疫原性、可溶性、信號(hào)肽及跨膜區(qū)域等影響蛋白表達(dá)的區(qū)域。

1.2.2 MsWRKY33抗原序列的克隆 使用普洛麥格公司的RNA提取試劑盒提取中苜1號(hào)紫花苜?？俁NA；利用Trans Script Green One-Step qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。以cDNA為模板，引物MsWRKY33-F：5′-TCAGGGATCCGGTAGTCATAATCATCCT-3′；MsWRKY33-R：5′-CGTAGTCGACTTAAACATTGTTGTTGTTG-3′，高保真酶TaqPolymerase(TaKaRa)擴(kuò)增MsWRKY33抗原序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增的目的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。用SaIⅠ/BamHⅠ雙酶切該目的片段和連接載體pET-SUMO，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 蛋白制備與純化 將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-MsWRKY33轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取含重組質(zhì)粒的單菌落至1 mL LB(Kan，50 μg/mL)中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取10 μL菌液加入相同的250 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，取50 μL液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.5 mmol/L作為試驗(yàn)組，兩組繼續(xù)在37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h。取菌體1 mL，10 360 r/min離心30 s收獲沉淀，用100 μL 1%SDS重懸，混勻，100 ℃ 10 min。10 360 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析。

大量表達(dá)蛋白則取2 mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液加入2 L LB(Kan，50 μg/mL)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6，降低溫度到30 ℃。加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.5 mmol/L作為試驗(yàn)組，30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h。收集發(fā)酵液，10 360 r/min離心10 min收集菌體，由于重組蛋白端C具有His標(biāo)簽，可以進(jìn)行鎳柱親和純化。因此誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體可懸浮于50 mL預(yù)冷的親和層析NTA-0緩沖液中，冰浴超聲波破碎細(xì)菌，控制功率為300 W，超聲4 s，暫停4 s，超聲90次。10 360 r/min 4 ℃離心30 min，收集上清以及沉淀。取少量樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測(cè)，剩余上清及沉淀置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將Ni-NTA樹(shù)脂裝入合適的層析柱，用10倍柱床體積的NTA-0 Buffer沖洗。將剩余樣品加到層析柱中，流速控制在0.5 mL/min左右，收集穿透部分。層析用10倍柱床體積的NTA-0 Buffer沖洗，流速控制在1 mL/min左右。分別用10倍柱床體積的NTA-20，NTA-60，NTA-200，NTA-500 Buffer洗脫，流速控制在1 mL/min左右，收集各洗脫峰。SDS-PAGE檢測(cè)各組分。純度達(dá)到要求的組分，置于透析帶中，4 ℃以1×PBS透析(換液2次)。4 ℃超濾濃縮透析產(chǎn)物。

1.2.4 多克隆抗體的制備與純化 將重組pET-MsWRKY33蛋白作為抗原(2 μg/mL)，乳化后進(jìn)行兔子免疫，總共經(jīng)過(guò)6次免疫，每次免疫中間隔14 d，最后一次免疫3～5 d后心臟取血，4 ℃析出血清，獲得含抗體的血清后用PBS洗滌純化，使用Millipore蛋白濃縮管濃縮到所需體積，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)純度，-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。同時(shí)，重組蛋白作為抗原(2 μg/mL)，100 μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中，4 ℃放置過(guò)夜。次日傾去孔內(nèi)的液體，PBS洗滌3次。加100 μL/孔TBST，室溫放置30 min，PBS洗滌3次。加入含待測(cè)抗體的抗血清(取血4 ℃過(guò)夜后5 980 r/min離心10 min得上清)，將血清按1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000……進(jìn)行倍比稀釋(以空白血清做陰性對(duì)照)，每孔100 μL，再加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶10 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的吸光度值，陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。

1.2.5 樣品處理 選取健康飽滿的中苜1號(hào)紫花苜蓿種子，用砂紙輕輕擦出劃痕以除硬實(shí)，置于預(yù)先鋪好濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，待種子露白后，轉(zhuǎn)移至1/2 MS液體培養(yǎng)基中，在人工智能溫室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照16 h，溫度25 ℃，光強(qiáng)400 μmol/(m2·s)；黑暗8 h，溫度23 ℃。

①干旱處理：將紫花苜蓿苗置于含15% PEG 6000的1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液中，于處理的0，6，12，24，48 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②鹽處理：將紫花苜蓿苗置于含150 mmol/L NaCl的1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液中，于處理的0，6，12，24，48 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

③低溫處理：將紫花苜蓿苗置于4 ℃環(huán)境中，于處理的0，6，12，24，48 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

④脫落酸(Abscisic acid，ABA)處理：將紫花苜蓿苗置于含0.1 mmol/L ABA的1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液中，于處理的0，6，12，24，48 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 蛋白提取 將上述凍存的苜蓿樣品在液氮中充分研磨，每100 mg樣品加入1 mL蛋白質(zhì)提取液(62.5 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4)、10%甘油、0.1% SDS、2 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF和5%β-巰基乙醇)，立即混勻置于冰上30 min，每隔10 min渦旋振蕩1次，10 360 r/min 4 ℃離心20 min，取上清即為總蛋白質(zhì)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 免疫印跡分析(Western Blotting，WB) 將各個(gè)處理的蛋白樣品從-20 ℃冰箱中取出，沸煮5 min，10 360 r/min離心30 s。用DYCZ-24K型電泳儀(北京六一生物科技有限公司，北京)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離蛋白質(zhì)，電泳完成后，將膠取下來(lái)，依據(jù)膠的大小剪取聚氧亞乙烯膜(PVDF)。PVDF膜用100%甲醇處理5 min。用DYCZ-24K型電轉(zhuǎn)儀(北京六一生物科技有限公司，北京)進(jìn)行膜轉(zhuǎn)移：膜心黑色面(負(fù)極)在下，按照海綿、3層濾紙、膠、膜、3層濾紙、海綿的結(jié)構(gòu)放置，過(guò)程中用玻璃棒趕凈氣泡，放入下槽，在下槽側(cè)面放置冰盒，加含SDS的轉(zhuǎn)移Buffer至刻度線位置，電壓100 V，1 h冰上轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜取出，置于TBST緩沖液，室溫封閉12 h。在封閉好的膜中加入一抗(MsWRKY33多抗)(1∶1 000)20 μL，室溫孵育5 h，然后用TBST溶液洗3次，每次10 min，再加入二抗(羊抗兔IgG(H+L)-HRP)(1∶10 000)，室溫振蕩孵育2 h，用TBS溶液洗膜3次，每次10 min，再用TBS洗10 min，用吸水紙吸干膜上的TBS緩沖溶液，用ECL化學(xué)發(fā)光劑孵育膜2 min，使用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)發(fā)光成像，檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果，并利用圖像處理軟件Image J讀取WB條帶灰度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsWRKY33蛋白生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站ExPASy對(duì)MsWRKY33蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，該蛋白全長(zhǎng)511 aa，蛋白分子式為C1129H1788N320O371S10，理論分子量為57.16 ku，理論等電點(diǎn)為7.02，不穩(wěn)定指數(shù)為50.6，預(yù)測(cè)是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。此外，該蛋白含有21個(gè)酸性氨基酸殘基和21個(gè)堿性氨基酸殘基，平均疏水性為-0.314，由此說(shuō)明MsWRKY33蛋白可能是一個(gè)親水性蛋白。使用SMART預(yù)測(cè)MsWRKY33蛋白在200～450 aa的位置有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域(圖1-A)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示MsWRKY33蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)組成，不具有信號(hào)肽(圖1-B)和跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1-C)，不屬于分泌型蛋白。

免疫原性預(yù)測(cè)顯示，該蛋白免疫原性較強(qiáng)(圖1-D)。該蛋白全長(zhǎng)序列較長(zhǎng)，一般情況下，蛋白的分子量越大，蛋白的表達(dá)難度越大。結(jié)合序列的特異性以及B細(xì)胞表位覆蓋度，將序列截?cái)?，選用247～457 aa區(qū)域重組蛋白制備多抗，確定的表達(dá)序列如圖1-E所示。

2.2 MsWRKY33抗原序列的克隆

以中苜1號(hào)紫花苜?？俁NA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，MsWRKY33-F/R為引物，用PCR的方法擴(kuò)增出長(zhǎng)度為654 bp(247～457 aa)的抗原序列(圖2-A)。將該片段克隆到pET-SUMO表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆，利用引物MsWRKY33-F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2-B)。將陽(yáng)性克隆送北京華大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序，克隆的MsWRKY33抗原序列與圖1-E中的蛋白序列相符，沒(méi)有突變發(fā)生，表明載體已經(jīng)構(gòu)建成功。

2.3 蛋白制備與純化

將重組質(zhì)粒pET-MsWRKY33轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21后，未誘導(dǎo)的作為對(duì)照組，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的作為試驗(yàn)組，收獲沉淀后取上清進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3-A，得到小量表達(dá)的MsWRKY33蛋白。原核表達(dá)的蛋白分為可溶性蛋白和包涵體2種，可溶性蛋白存在于菌體破碎后的上清部分，包涵體為沉淀中的不可溶性蛋白。為獲得較多的可溶性MsWRKY33蛋白，進(jìn)行了大量表達(dá)。使用超聲破碎離心，分離得到上清和沉淀，分別將其純化后再進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3-B所示，未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照樣品中沒(méi)有信號(hào)，而在上清、沉淀和純化蛋白質(zhì)樣品中均出現(xiàn)分子量符合預(yù)期的特異信號(hào)，表明插入的外源基因片段已經(jīng)成功在大腸桿菌中表達(dá)。再經(jīng)Ni-NTA樹(shù)脂層析柱純化后獲得純化重組蛋白，如圖3-C所示，只檢測(cè)出單一的且分子量符合的目標(biāo)信號(hào)，表明已成功獲得了純化重組蛋白。

2.4 多克隆抗體的制備與純化及抗體WB檢測(cè)

以純化的MsWRKY33蛋白為免疫原，免疫兔子，得到抗血清，經(jīng)純化后獲得多克隆抗體。以MsWRKY33純化蛋白包被96孔板，以未免疫的正常兔血清為對(duì)照，酶標(biāo)儀測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)OD450值為2.5時(shí)，抗體的稀釋倍數(shù)約為16 000左右，即利用這一濃度可以有效地檢測(cè)到抗原，表明制備的抗體具有很高的檢測(cè)靈敏度。純化后的多克隆抗體經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)其純度，結(jié)果如圖5-A所示。為驗(yàn)證多克隆抗體的特異性，采用WB進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5-B所示：樣品中沒(méi)有可見(jiàn)的背景信號(hào)，以天然蛋白(天然蛋白質(zhì)的分子量為56 ku)作為對(duì)照，重組蛋白有分子量為48 ku(23 ku MsWRKY33目的蛋白+25 ku標(biāo)簽)的特異條帶。上述結(jié)果說(shuō)明，所獲得的MsWRKY33抗體具有較強(qiáng)的特異性。

A.小量表達(dá)重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)：1.Marker；2.轉(zhuǎn)化pET-MsWRKY33未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白；3.轉(zhuǎn)化pET-MsWRKY33經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白。B.大量表達(dá)重組蛋白SDS-PAGE檢測(cè)：4.Marker；5.轉(zhuǎn)化pET-SUMO空載體的總蛋白；6.轉(zhuǎn)化pET-MsWRKY33未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白；7.轉(zhuǎn)化pET-MsWRKY33經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白沉淀；8.轉(zhuǎn)化pET-MsWRKY33經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白上清。C.純化重組蛋白：9.純化后pET-MsWRKY33蛋白；10.Marker；黑色箭頭表示重組蛋白所在位置。

圖4 抗體效價(jià)檢測(cè)Fig.4 Antibody titer determination

A.MsWRKY33多克隆抗體；B.WB檢測(cè)結(jié)果：1.天然蛋白；2.重組蛋白；紅色圓圈表示目標(biāo)蛋白所在位置。

2.5 MsWRKY33蛋白在逆境脅迫下的表達(dá)特征

為了解MsWRKY33在鹽、低溫、干旱3種逆境條件和ABA處理下蛋白水平的表達(dá)情況，本試驗(yàn)對(duì)中苜1號(hào)紫花苜蓿進(jìn)行了這4種處理，在處理后的0，6，12，24，48 h分別采集了樣品。提取蛋白后用制備的MsWRKY33多克隆抗體進(jìn)行WB試驗(yàn)。如圖6所示，用NaCl脅迫處理后，在6，12 h樣品泳道中對(duì)應(yīng)48 ku位置幾乎沒(méi)有可見(jiàn)條帶，在24 h樣品泳道目標(biāo)區(qū)域有明顯的條帶，說(shuō)明處理24 h后蛋白表達(dá)量顯著增加，處理48 h蛋白表達(dá)豐度又大幅降低(圖6-A)，說(shuō)明鹽脅迫可以誘導(dǎo)MsWRKY33蛋白在紫花苜蓿中的表達(dá)。4 ℃、PEG和ABA處理后，MsWRKY33蛋白的表達(dá)也均在24 h顯著增加，說(shuō)明這3種處理也可以誘導(dǎo)MsWRKY33蛋白在紫花苜蓿中的表達(dá)。同時(shí)利用Image J軟件分析了4個(gè)處理下WB條帶的灰度值，從圖6-E可以發(fā)現(xiàn)，NaCl處理下MsWRKY33蛋白在24 h的表達(dá)豐度明顯強(qiáng)于其他3個(gè)處理，高出其他3個(gè)處理2～5倍，表明NaCl處理下的蛋白表達(dá)高于其他3個(gè)處理。在48 h時(shí)，只有NaCl處理下MsWRKY33蛋白還有較高的表達(dá)，其余3個(gè)處理MsWRKY33蛋白的表達(dá)均已同0 h一致，說(shuō)明MsWRKY33蛋白對(duì)鹽處理更加敏感且持續(xù)。

A.NaCl處理；B.4 ℃處理；C.PEG處理；D.ABA處理；E.WB的灰度值分析；紅色箭頭表示MsWRKY33蛋白被脅迫誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)出現(xiàn)的位置；不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05 水平差異顯著。

3 討論與結(jié)論

在過(guò)去幾十年中，研究者運(yùn)用原核表達(dá)的重組蛋白免疫鼠、兔等動(dòng)物來(lái)制備抗體已經(jīng)表達(dá)了數(shù)百種重組蛋白[28]。通過(guò)原核表達(dá)獲得大量的抗原蛋白，既可用于蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能研究，也可用于蛋白質(zhì)的相互作用等生化功能研究[29]。本研究中，將MsWRKY33抗原序列克隆到原核表達(dá)載體上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了MsWRKY33融合蛋白的高效表達(dá)。融合蛋白經(jīng)Ni-NTA親和柱親和層析洗脫后，得到了滿足抗體制備需要的高純度抗原，經(jīng)免疫小鼠，純化抗血清后得到了效價(jià)較高且特異性好的多克隆抗體，該抗體不僅可以識(shí)別在大腸桿菌原核表達(dá)的MsWRKY33融合蛋白，而且還可以特異識(shí)別紫花苜蓿總蛋白中的MsWRKY33蛋白。多克隆抗體的成功制備為進(jìn)一步研究紫花苜蓿MsWRKY33蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

WB技術(shù)由Burnette[30-31]在1981年提出，其原理主要是提出組織總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，分離出大小不同的蛋白質(zhì)，通過(guò)抗原抗體特異結(jié)合轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，最后用ECL發(fā)光信號(hào)檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)情況。本研究利用制備的MsWRKY33多克隆抗體進(jìn)行WB試驗(yàn)，成功檢測(cè)到分子量接近于50 ku的重組蛋白。并且研究了鹽、低溫、干旱和ABA這4種脅迫下紫花苜蓿組織中MsWRKY33蛋白的表達(dá)情況，初步研究發(fā)現(xiàn)MsWRKY33蛋白表達(dá)受4種逆境誘導(dǎo)，但在高鹽條件下紫花苜蓿中的MsWRKY33蛋白表達(dá)豐度明顯高于其他處理，表明MsWRKY33蛋白在植物響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中可能具有較為重要的作用。馮光燕等[32]在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)了鹽脅迫下中苜1號(hào)紫花苜蓿中MsWRKY33的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MsWRKY33的表達(dá)量在處理前8 h均較低，在處理12 h達(dá)到最高水平，后又緩慢降低，在本試驗(yàn)中，MsWRKY33蛋白水平表達(dá)在24 h達(dá)到最高水平，可以看出，蛋白表達(dá)峰值的到來(lái)要晚于轉(zhuǎn)錄水平。這主要是因?yàn)檎婧嘶虮磉_(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔，其次在轉(zhuǎn)錄后，又會(huì)有轉(zhuǎn)錄后加工，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯，甚至翻譯后加工及修飾等。所以導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平不完全一致，可能在MsWRKY33蛋白達(dá)到峰值的時(shí)候mRNA已經(jīng)開(kāi)始降解，或者在mRNA達(dá)到峰值的時(shí)候MsWRKY33蛋白量還在增加中。

通常植物的耐逆途徑是由多個(gè)基因控制，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子不僅可以參與多個(gè)抗逆途徑，某個(gè)耐逆途徑也可以由多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[33]。近幾年，越來(lái)越多的研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在傳導(dǎo)逆境信號(hào)、調(diào)控逆境相關(guān)基因中扮演關(guān)鍵角色[15]。本研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子蛋白參與多種非生物逆境脅迫，對(duì)鹽脅迫尤其敏感，而鹽脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要通過(guò)至少2種途徑：ABA依賴和非ABA依賴信號(hào)傳導(dǎo)途徑[34]。馮光燕等[32]在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)了ABA處理后中苜1號(hào)紫花苜蓿中MsWRKY33的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MsWRKY33的表達(dá)量在處理12 h達(dá)到峰值，且表達(dá)豐度較低，在本研究中，經(jīng)ABA處理后MsWRKY33蛋白的表達(dá)豐度也較低，僅在24 h有微弱表達(dá)。說(shuō)明MsWRKY33參與的鹽脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能不依賴于ABA信號(hào)途徑或ABA信號(hào)途徑不是主要途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)MsWRKY33蛋白不具有信號(hào)肽，有較強(qiáng)的蛋白免疫原性，并根據(jù)其蛋白特性克隆了MsWRKY33抗原序列，制備了MsWRKY33多克隆抗體。通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MsWRKY33蛋白對(duì)鹽脅迫響應(yīng)較為敏感，且可能通過(guò)非ABA依賴信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與鹽脅迫調(diào)控。