范會(huì)芬，孫天杰，蘇偉華，肖付明，張 潔，王冬梅

(1.省部共建華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 邯鄲 056001)

大豆(Glycinemax)是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在世界食用油生產(chǎn)中占有重要地位[1]。提高產(chǎn)量并保障供應(yīng)，是大豆生產(chǎn)面臨的重要問(wèn)題。大豆的產(chǎn)量不僅受到氣候條件和土壤條件(鹽分、干旱和金屬污染)等環(huán)境因素的影響，還深受大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)等病原物的危害[2]。大豆花葉病毒侵染引起的大豆花葉病毒病頻繁流行，可導(dǎo)致大豆的株高和莢果數(shù)分別下降57%，68%，給大豆生產(chǎn)造成巨大損失[3]。因此，發(fā)掘抗病基因，提高大豆產(chǎn)量是保障大豆生產(chǎn)安全的關(guān)鍵。

過(guò)氧化氫(H2O2)作為活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的主要成員之一，在植物免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可利用其質(zhì)膜上的NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)氧化酶(又稱呼吸爆發(fā)氧化酶同系物RBOH)等在胞外產(chǎn)生H2O2。胞外H2O2可進(jìn)入胞質(zhì)，進(jìn)而氧化修飾胞內(nèi)蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以調(diào)控生物的生長(zhǎng)、發(fā)育及其對(duì)脅迫的響應(yīng)[4]。H2O2在植物防御病毒的侵染早期可引起寄主細(xì)胞局部壞死，也作為信號(hào)分子誘導(dǎo)抗病防御反應(yīng)[5]。有研究表明，煙草葉片受煙草花葉病毒侵染后，質(zhì)膜NADPH氧化酶蛋白表達(dá)量增加，H2O2水平升高，并且在壞死斑邊緣的細(xì)胞壁有胼胝質(zhì)的積累[6]。利用水楊酸處理煙草葉片，可激活ROS信號(hào)通路和誘導(dǎo)胼胝質(zhì)在胞間連絲上的沉積，抑制番茄花葉病毒(TMV)的擴(kuò)散[7]。Sun等[8]前期研究結(jié)果表明，在大豆與SMV互作體系的不親和組合中，H2O2主要分布在寄主的細(xì)胞壁及質(zhì)膜部位；預(yù)注射NADPH氧化酶抑制劑咪唑后，H2O2的產(chǎn)生和胼胝質(zhì)的沉積均明顯減少，說(shuō)明H2O2的產(chǎn)生可能主要依賴于NADPH氧化酶，通過(guò)參與調(diào)控胼胝質(zhì)在胞間連絲的沉積，完成對(duì)病毒胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的阻斷。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在植物細(xì)胞中，可調(diào)控ROS的產(chǎn)生和清除[9]，在植物應(yīng)對(duì)各種生物脅迫的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[10-11]。研究表明，過(guò)表達(dá)GhWRKY15基因的煙草植株通過(guò)調(diào)控ROS信號(hào)通路增強(qiáng)了對(duì)TMV和黃瓜花葉病毒(CMV)的抗性[9]。在大豆與赤霉菌互作過(guò)程中，GmWRKY40能夠與茉莉酸信號(hào)途徑抑制因子JAZ蛋白互作，通過(guò)激活H2O2合成途徑和抑制H2O2的清除，參與大豆抵抗大豆赤霉病的過(guò)程[10]。過(guò)表達(dá)CsWRKY50能夠提高H2O2的清除能力，增強(qiáng)黃瓜對(duì)霜霉病的抗性[12]。

Sun等[8]前期通過(guò)高通量測(cè)序構(gòu)建了清除H2O2前后大豆與SMV互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，從中篩選得到一個(gè)差異表達(dá)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員GmWRKY50，通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲得了其帶有6×His標(biāo)簽的純化蛋白并制備了多克隆抗體，利用制備的抗體檢測(cè)了GmWRKY50在大豆與SMV互作過(guò)程中的蛋白水平表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步闡明GmWRKY50在H2O2調(diào)控下參與大豆抵御SMV侵染的功能和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 大豆的種植 大豆(冀豆7號(hào))由光照強(qiáng)度為10 000 lx的高壓鈉燈進(jìn)行照射，溫度恒定在25 ℃，光周期為16 h/8 h(L/D)。挑選顆粒飽滿的冀豆7號(hào)種子，種植于裝有蛭石的塑料培養(yǎng)盆(直徑為15 cm)中，每盆種植16株。

1.1.2 病毒的繁殖和保存 病毒SMV株系N3的繁殖通過(guò)葉片進(jìn)行，將帶有N3的大豆花葉癥狀明顯的南農(nóng)1138-2葉片放入標(biāo)記好取樣日期的1.5 mL的Ep管中，液氮速凍，分批凍存于-80 ℃。葉片保存的時(shí)間越長(zhǎng)，病毒的活力越弱；通過(guò)保存葉片的方法保存病毒，并不能使病毒長(zhǎng)存，要及時(shí)更新并儲(chǔ)存新繁殖的病毒葉片；病毒的繼代繁殖可以通過(guò)接種大豆活體植株進(jìn)行。將具有明顯花葉癥狀的帶病毒葉片放入研缽中，輔以金剛砂的阻力，加入適量0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)進(jìn)行充分研磨，然后作為接種劑進(jìn)行摩擦接種，用無(wú)菌毛刷蘸取研磨液均勻刷在兩周齡的南農(nóng)1138-2植株的展開葉片及主莖中(增加繁殖效率)，每5 d進(jìn)行一次接種，接種3次，最后一次接種病毒1個(gè)月后，觀察新生葉片是否發(fā)生了花葉卷曲，并取卷曲葉片進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證葉片是否含有SMV-CP，驗(yàn)證無(wú)誤后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成 種植冀豆7號(hào)15 d，在3輪復(fù)葉接種SMV后48 h取樣，液氮速凍，研磨，并提取RNA(具體步驟參考說(shuō)明書)；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑反轉(zhuǎn)為cDNA待用。

1.2.2GmWRKY50基因生物信息學(xué)分析 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因ID為Glyma.17G224800.1在http：//soykb.org/網(wǎng)站進(jìn)行檢索，下載該基因編碼區(qū)序列；在NCBI在線搜索并分析該基因片段長(zhǎng)度，獲得該基因的核酸序列和蛋白質(zhì)序列具體信息；同時(shí)在NCBI BlastP中搜索大豆、水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等物種中具有相似序列的基因，并進(jìn)行序列篩選，下載并以FASTA形式保存篩選的序列，運(yùn)用ClustalW軟件進(jìn)行序列比對(duì)，保存比對(duì)結(jié)果；使用MEGA 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建發(fā)育樹，選擇泊松模型，校驗(yàn)參數(shù)為Bootstrap=500。

1.2.3GmWRKY50原核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)GmWRKY50的基因序列設(shè)計(jì)帶有BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的F-ggatccATGACAGACAAAATACCAAAACCACCAC和帶有Hand Ⅲ酶切位點(diǎn)的R-aagcttGGAAGAACTTGGATGAGTGTGGTTG擴(kuò)增目的基因(小寫字母為酶切位點(diǎn)序列)，用T4DNA連接酶連接至pCold Ⅱ并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株Top10中，通過(guò)Amp抗性培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行培養(yǎng)并提質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證后，送至北京華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將構(gòu)建成功的pCold Ⅱ-GmWRKY50質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌株中，Amp抗性培養(yǎng)基篩選出陽(yáng)性單克隆。

1.2.4 GmWRKY50重組蛋白的誘導(dǎo)及溶解性分析 將正確的單克隆菌株培養(yǎng)至OD600為0.3～0.4，置于4 ℃ 1 h，然后通過(guò)終濃度不同的IPTG，培養(yǎng)不同的時(shí)間，以確定最適合的誘導(dǎo)條件。吸取2 mL菌液以7 000 r/min離心后，加入蛋白裂解液(0.5 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH值8.0)60 μL重懸后加入6×Loading Buffer，煮沸10 min，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)量；并通過(guò)Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證誘導(dǎo)后的目的蛋白是否為帶有His標(biāo)簽的重組蛋白。檢測(cè)具體步驟參考麻楠等[13]的方法，以BSA為陰性對(duì)照，取純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE：①將電泳后的凝膠以90 V的電壓轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF)上，持續(xù)50 min；②清洗PVDF膜15 min，其間更換2次TBST緩沖液(2.42 g/L Tris，8.80 g/L NaCl，2 mL/L Tween 20)；③用含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h；④用Anti-GmWRKY50進(jìn)行孵育3 h，抗體稀釋比例為1∶6 000；⑤Anti-His孵育完畢后，用TBST緩沖液清洗PVDF膜15 min，其間更換2次緩沖液；⑥再使用HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG(為1∶6 000)孵育1 h后，用TBST緩沖液將PVDF膜清洗15 min，其間更換2次緩沖液，直至清洗干凈；并借助Immobilon Western HRP 底物于暗室進(jìn)行顯影。

根據(jù)上述探索的IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)，收集2 mL誘導(dǎo)后菌體，用400 μL裂解液(PMSF工作濃度為0.05 mmol/L)重懸，超聲波處理10 min(功率90 W，超聲30 s，間隔10 s)后4 ℃離心(12 377 r/min，15 min)，分離上清液和沉淀并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.5 GmWRKY50蛋白的純化 ①純化過(guò)程借助12 mL的親和層析柱，向柱中加入2 mL Ni-NTA SefinoseTMResin，用緩沖液(0.5 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tirs，pH值8.0)清洗后，使用配套的篩板對(duì)純化介質(zhì)進(jìn)行排氣，此過(guò)程緩沖液的高度高于篩板，將純化介質(zhì)壓平整，待用；②將樣品加入盛有純化介質(zhì)的柱子里，控制流速(約1 mL/min)；③分別使用不同咪唑濃度的洗脫緩沖液(表1)洗脫目的蛋白，每種濃度加2 mL，每1 mL收集為1管，分別標(biāo)記為1和2；④SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

表1 緩沖液的制備Tab.1 Buffer preparation mmol/L

1.2.6 收集純化的蛋白 將250 mmol/L咪唑洗脫下來(lái)的蛋白進(jìn)行收集，加入6×Loading Buffer，煮沸10 min，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)蛋白洗脫效果。用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行考染觀察，純化的總蛋白量大于2 mg后，送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行抗體的制備。

1.2.7 抗體特異性檢測(cè) 抗體特異性檢測(cè)具體步驟參考1.2.4，提取大豆葉片的總蛋白：將蛋白酶抑制劑(PMSF)終濃度為0.05 mmol/L的蛋白提取液(50 mmol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、0.5%NP-40，pH值8.0)加入研磨至粉末狀的樣品中，在渦旋振蕩器上進(jìn)行充分渦旋，每10 min渦旋1次，渦旋1次1 min，全程在冰上進(jìn)行，其間補(bǔ)加PMSF。蛋白檢測(cè)步驟如1.2.6，該步驟選用的Anti-GmWRKY50稀釋比例為1∶3 000，使用HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG的稀釋比例為1∶4 000。

1.2.8 GmWRKY50在大豆抵抗SMV侵染過(guò)程中的表達(dá)量變化 GmWRKY50在大豆抵抗SMV侵染過(guò)程中的表達(dá)量變化，即對(duì)大豆葉片蛋白的提取及表達(dá)量檢測(cè)：具體參考1.2.4和1.2.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmWRKY50基因的克隆及其生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)載體構(gòu)建

以大豆品種冀豆7號(hào)的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得GmWRKY50編碼序列(圖1-A)，并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示(圖1-B-E)，該基因CDS全長(zhǎng)為495 bp，編碼氨基酸165個(gè)，含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域；從氨基酸序列可以看出，WRKY結(jié)構(gòu)特征為WRKYGKK，鋅指結(jié)構(gòu)特征為C2H2(CX4-CX23-HXH)。

通過(guò)NCBI在線檢索GmWRKY50蛋白同源基因，選擇大豆、水稻、擬南芥、煙草、小麥等物種中的相似序列，利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明(圖1-E)，GmWRKY50與模式生物擬南芥AtWRKY50同源關(guān)系最近。

A.GmWRKY50基因的克?。籅.GmWRKY50的CDS序列；C.GmWRKY50的氨基酸序列；D.GmWRKY50結(jié)構(gòu)域；E.GmWRKY50系統(tǒng)發(fā)育樹分析；F.pCold Ⅱ-GmWRKY50重組質(zhì)粒的酶切前后對(duì)比。A.Cloning of GmWRKY50 gene； B.GmWRKY50 CDS sequence; C.GmWRKY50 amino acid sequence; D.GmWRKY50 domain;E.GmWRKY50 phylogenetic analysis; F.Comparison before and after restriction digestion of pCold Ⅱ-GmWRKY50 recombinant plasmid.

以大豆品種冀豆7號(hào)的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得GmWRKY50編碼序列，與pCold Ⅱ質(zhì)粒重組構(gòu)建原核表達(dá)載體后，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，均在495 bp(圖1-A、F)處有相應(yīng)大小的條帶，同時(shí)測(cè)序后序列比對(duì)完全正確，說(shuō)明pCold Ⅱ-GmWRKY50原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 GmWRKY50融合蛋白的誘導(dǎo)及可溶性分析

為分析GmWRKY50-6×His重組蛋白表達(dá)的優(yōu)化條件，使用不同終濃度的IPTG和不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行處理。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，IPTG終濃度為0.5 mmol/L、誘導(dǎo)4 h的重組蛋白表達(dá)效果良好，高效的表達(dá)出了分子量約為18.86 ku的GmWRKY50重組蛋白。以上述條件誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，收集菌體進(jìn)行超聲破碎并離心，分別取上清液及沉淀進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，重組蛋白在上清液和沉淀中均表達(dá)，取上清液中的重組蛋白進(jìn)行純化(圖2)。

A.IPTG誘導(dǎo)GmWRKY50的表達(dá)；B.檢測(cè)誘導(dǎo)的重組蛋白；C.GmWRKY50溶解性分析。A.IPTG induces the expression of GmWRKY50; B.Detection of induced recombinant protein; C.GmWRKY50 solubility analysis.

2.3 GmWRKY50融合蛋白的純化與富集

超聲破碎離心后，取上清液，使用Ni-NTA親和純化介質(zhì)進(jìn)行GmWRKY50重組蛋白的純化，以表1中純化緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明(圖3)，使用250 mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白純度相對(duì)較高，且洗脫較為完全。將250 mmol/L咪唑洗脫下來(lái)的蛋白進(jìn)行富集，向洗脫樣品中加入6×Loading Buffer，煮沸5 min，使用12%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE檢測(cè)蛋白洗脫效果，GmWRKY50的純度較高，且濃度達(dá)5 mg/mL以上，將考染后的條帶切下，送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行抗體的制備。

1-2.不同濃度咪唑的洗脫液1和洗脫液2。1-2.Eluent 1 and eluent 2 of different concentrations of imidazole.

2.4 GmWRKY50抗體的特異性檢測(cè)

提取大豆葉片總蛋白并進(jìn)行電泳，借助Western Blotting進(jìn)一步驗(yàn)證Anti-GmWRKY50抗體的特異性，結(jié)果顯示(圖4)，當(dāng)抗體稀釋比例為1∶3 000時(shí)，出現(xiàn)的條帶位置與GmWRKY50預(yù)期分子量大小以及誘導(dǎo)后使用Anti-His抗體(1∶6 000)雜交后的位置基本一致，表明該抗體能夠特異性識(shí)別GmWRKY50。

圖4 Anti-GmWRKY50抗體的特異性檢測(cè)Fig.4 Specific detection of Anti-GmWRKY50 antibody

2.5 GmWRKY50在大豆與SMV互作過(guò)程中的表達(dá)量檢測(cè)

為了進(jìn)一步分析大豆中GmWRKY50在抵抗SMV過(guò)程中的作用，對(duì)大豆葉片接種大豆花葉病毒N3后在0，12，24，48 h進(jìn)行取樣，并提取葉片總蛋白，檢測(cè)GmWRKY50在蛋白水平的表達(dá)量變化。結(jié)果表明(圖5)，SMV侵染12，24，48 h的樣品中GmWRKY50的蛋白水平表達(dá)量均高于0 h。說(shuō)明GmWRKY50受到了SMV侵染的誘導(dǎo)，進(jìn)一步說(shuō)明GmWRKY50在蛋白水平響應(yīng)SMV侵染過(guò)程。

GmWRKY50.Western Blotting檢測(cè)GmWRKY50；Rubsico.麗春紅染色檢測(cè)Rubsico。GmWRKY50.Western Blotting to detect GmWRKY50;Rubsico.Ponceau stain to detect Rubsico.

3 討論

WRKY類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的，具有1個(gè)或2個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域(約60個(gè)氨基酸)[14]。其分子結(jié)構(gòu)特征為具有保守的肽序列Trp-Arg-Lys-Tyr(WRKY)和鋅指結(jié)構(gòu)域C2HXH[15]，WRKY蛋白的核心序列是WRKYGQK。WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3個(gè)家族，將有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的分為Ⅰ族[14]；有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域且鋅指結(jié)構(gòu)為HXH的分別為Ⅱ族，為HXC的分為Ⅲ族[14]。Ⅱa-b、Ⅱc、Ⅱd-e是對(duì)Ⅱ族的進(jìn)一步分化；Ⅲ族分為Ⅲa和Ⅲb 2個(gè)亞家族。Ⅰ族的鋅指特征CX4-CX22-23HXH，Ⅱa/Ⅱb/Ⅱd/Ⅱe的保守序列為CX5-CX23-24HXH，Ⅱc與Ⅰ族的保守序列相同[15]，Ⅲa的保守序列為CX7-CX23-30HXC，而Ⅲb為CX6-9-CX23-30HXC[16]。

目前，擬南芥中已確定的WRKY家族成員有74個(gè)[17]，煙草中有164個(gè)[18]，水稻中有111個(gè)[19]，小麥中有171個(gè)[20]，大豆中有178個(gè)[21]。在不同作物中WRKY結(jié)構(gòu)域經(jīng)常發(fā)生變異。在大豆中，WRKYGQK中的Q優(yōu)先突變，而W、K和Y相對(duì)保守，WRKYGKK突變體較多，該突變影響蛋白質(zhì)與DNA的相互作用[21]；WRKYGKK大多數(shù)來(lái)自第Ⅱ組WRKY基因家族，這也說(shuō)明第Ⅱ組WRKY基因的生物學(xué)功能更加多樣化[21]。在小麥中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)突變體，分別是WRKYGKK(10)、WRKYGEK(11)和WSKYGQK(1)，10個(gè)突變?yōu)閃RKYGKK結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子分布在Ⅱc亞家族，11個(gè)突變?yōu)閃RKYGEK結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子分布在Ⅲ族，突變?yōu)閃SKYGQK結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子為TaWRKY157[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)GmWRKY50蛋白中結(jié)構(gòu)域的序列為WRKYGKK-CX4-CX23-HXH，而且在擬南芥中AtWRKY50結(jié)構(gòu)域?yàn)橥瑸閃RKYGKK-CX4-CX23-HXH[22]，在進(jìn)化發(fā)生關(guān)系的分析中發(fā)現(xiàn)GmWRKY50與AtWRKY50同源關(guān)系最近，同為Ⅱc家族的轉(zhuǎn)錄因子。

為了進(jìn)一步研究GmWRKY50基因的功能，將GmWRKY50蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，GmWRKY50蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為18.86 ku，帶6個(gè)His標(biāo)簽，其分子量約為0.84 ku，GmWRKY50-6×His相對(duì)質(zhì)量約為19.70 ku，與電泳檢測(cè)結(jié)果的大小基本一致，但還是有偏差，尤其是Western Blotting的結(jié)果，首先造成這種偏差的原因可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)翻譯水平后修飾造成了不同的折疊構(gòu)象，小麥的TCTP蛋白表達(dá)亦有類似情況發(fā)生[13]；出現(xiàn)該現(xiàn)象的另一種原因，可能是用來(lái)衡量蛋白質(zhì)分子量大小的蛋白質(zhì)Marker可能存在不同程度的偏差。本研究通過(guò)該技術(shù)獲得了純化蛋白并制備了多克隆抗體，進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法證明GmWRKY50在蛋白表達(dá)水平響應(yīng)SMV的侵染。本研究制備的特異性抗體為進(jìn)一步研究GmWRKY50在響應(yīng)SMV侵染過(guò)程中的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。