蔡兆明，程春紅，傅 敏，王殿東

(長(zhǎng)江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100)

生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)環(huán)境適應(yīng)方面具有重要作用，如參與調(diào)控植物器官發(fā)育、對(duì)生物逆境脅迫和非生物逆境脅迫的響應(yīng)等[1-3]。生長(zhǎng)素主要通過(guò)一系列蛋白組成的生長(zhǎng)素信號(hào)通路發(fā)揮功能，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游主要包含3個(gè)基因家族成員，即TIR1/AFB生長(zhǎng)素受體家族蛋白、AUX/IAA家族蛋白和生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF家族蛋白[4]。當(dāng)植物內(nèi)源生長(zhǎng)素含量升高時(shí)，生長(zhǎng)素分子結(jié)合并激活生長(zhǎng)素受體TIR1/AFB，被激活的TIR1/AFB可與AUX/IAA蛋白結(jié)合并通過(guò)泛素-26S蛋白酶體途徑將其降解，隨著AUX/IAA蛋白的降解，該蛋白對(duì)ARF轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用被解除，進(jìn)而引發(fā)對(duì)下游生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，激活生長(zhǎng)素信號(hào)通路[5]。

ARF家族基因作為生長(zhǎng)素信號(hào)通路的組分之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的許多方面均具有調(diào)控作用。在擬南芥中，共有23個(gè)ARF基因被鑒定出來(lái)，不同的ARF基因所發(fā)揮的功能也具有多樣性。如ARF1和ARF2可調(diào)節(jié)擬南芥葉片衰老和花的凋謝，且在功能上存在冗余[6]。ARF3通過(guò)與細(xì)胞分裂素信號(hào)的互作調(diào)控?cái)M南芥花原基的形成[7]。ARF8可影響擬南芥中茉莉酸的含量并在調(diào)節(jié)下胚軸伸長(zhǎng)、頂端優(yōu)勢(shì)和側(cè)根形成方面發(fā)揮功能[8]。在番茄中，相比于野生型番茄，ARF4基因缺失突變體對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性增強(qiáng)[9]。在楊樹(shù)中，過(guò)表達(dá)ARF1可以增加植株對(duì)木霉菌侵染的響應(yīng)[10]。

莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)為十字花科蕓薹屬植物，是重慶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，其膨大莖是制作中國(guó)名特產(chǎn)品“涪陵榨菜”的主要原料。榨菜產(chǎn)業(yè)可貢獻(xiàn)很大的經(jīng)濟(jì)效益，僅重慶涪陵區(qū)2020年的榨菜產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值為120億元，為大量莖瘤芥種植農(nóng)戶帶來(lái)收益。為實(shí)現(xiàn)重慶地區(qū)的優(yōu)勢(shì)榨菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，重慶蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展“十三五”規(guī)劃中把強(qiáng)化科技創(chuàng)新，注重研發(fā)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的榨菜加工專用品種作為工作重點(diǎn)。在莖瘤芥栽培過(guò)程中，瘤莖產(chǎn)量低、鹽脅迫和根腫菌脅迫等問(wèn)題仍對(duì)榨菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)?；谏L(zhǎng)素在調(diào)控植物器官發(fā)育、植物抵御生物和非生物逆境脅迫中的多方面作用，本研究以生長(zhǎng)素信號(hào)通路中的重要組分ARF家族基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)這些基因在莖瘤芥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和逆境條件下的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)，挖掘出一些在瘤莖中特異表達(dá)的以及對(duì)鹽脅迫和根腫菌脅迫有響應(yīng)的ARF基因成員，為進(jìn)一步研究它們的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為研發(fā)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)莖瘤芥品種提供潛在的基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用莖瘤芥材料為重慶地區(qū)栽培品種永安小葉。將種子播種在含蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土(3∶1)的花盆中，在植物培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗。對(duì)生長(zhǎng)至生育期的植物各組織(根、莖、葉、花、種莢)進(jìn)行取樣，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)表達(dá)檢測(cè)試驗(yàn)。鹽脅迫處理方法為：選取培養(yǎng)室中培養(yǎng)2周齡的莖瘤芥幼苗，用200 mmol/L的氯化鈉灌根處理0，6，12，24，48 h后對(duì)幼苗根系進(jìn)行取樣，其中以灌根處理的0 h的幼苗根系作為對(duì)照；根腫菌脅迫處理方法為：選取2周齡的莖瘤芥幼苗，用5 mL根腫菌休眠孢子提取液(OD600=0.07)灌根處理0，12，24，36，72 h后對(duì)幼苗根系取樣，其中以灌根處理的0 h的幼苗根系作為對(duì)照，根腫菌休眠孢子的提取參照杜艷等[11]的試驗(yàn)方法。每個(gè)處理的樣品各取3株材料混樣，取樣進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

1.2 生物信息學(xué)分析

在蕓薹屬基因組網(wǎng)站(http：//brassicadb.cn/#/)中的莖瘤芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(BrassicajunceaV1.5)中下載莖瘤芥ARF家族基因，基因ID參照Li等[12]發(fā)表的文章。利用DNAMAN和MEGA 7軟件將莖瘤芥ARF家族蛋白與擬南芥ARF蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，依據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)莖瘤芥ARF家族基因重新命名，以便直觀顯示與擬南芥ARF家族各成員高度相似的莖瘤芥基因。通過(guò)莖瘤芥基因組網(wǎng)站提供的信息統(tǒng)計(jì)莖瘤芥ARF的基因組長(zhǎng)度、蛋白編碼序列(CDS)長(zhǎng)度、氨基酸長(zhǎng)度及外顯子數(shù)目。采用在線軟件ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)蛋白等電點(diǎn)及分子量。采用TBtools軟件進(jìn)行基因串聯(lián)重復(fù)分析以及計(jì)算ARF片段復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks值[13]。選擇莖瘤芥ARF家族各基因“ATG”上游2 kb序列作為啟動(dòng)子，采用在線分析軟件PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。

1.3 莖瘤芥總RNA提取及基因的qPCR檢測(cè)

采用SimGEN公司(杭州，中國(guó))的植物總RNA提取試劑盒，參照試驗(yàn)方法說(shuō)明對(duì)莖瘤芥材料的總RNA進(jìn)行提取，使用全式金公司(北京，中國(guó))的TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將提取出的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄加入模板RNA的用量為500 ng。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍用于qPCR檢測(cè)。采用羅氏(Roche)Light Cycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR分析，使用全式金公司TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒配制10 μL反應(yīng)體系：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix，5 μL；cDNA 0.5 μL；正向引物(10 μmol/mL)0.5 μL；反向引物(10 μmol/mL)0.5 μL；ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；(94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)；運(yùn)行溶解曲線程序。qPCR反應(yīng)所用，內(nèi)參基因?yàn)榍o瘤芥Bju18SrRNA(BjuA046942)[14]，所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 BjARF基因qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qPCR for BjARF genes

表1(續(xù))

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCT方法對(duì)qPCR結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。使用Heml軟件對(duì)ARF基因在莖瘤芥不同組織中表達(dá)的qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行熱圖分析，利用SigmaPlot 10.0(Systat Software，Inc.，Chicago，IL，United States)軟件對(duì)鹽脅迫和根腫菌侵染脅迫的莖瘤芥根中ARF基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析并作圖，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行基因表達(dá)水平比較，選擇One-way ANOVA的Duncan方法進(jìn)行基因表達(dá)差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為不同樣本間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖瘤芥ARF基因基本信息分析

通過(guò)蛋白序列比對(duì)分析了莖瘤芥ARF蛋白與擬南芥ARF蛋白的序列一致性，并根據(jù)序列一致性的高低分別對(duì)莖瘤芥ARF基因重新命名(表 2)。結(jié)果表明，莖瘤芥中與擬南芥ARF5序列相似度較高的基因數(shù)目最多，為6個(gè)，分別命名為BjARF5A～BjARF5F，用同樣的方法也對(duì)其他基因進(jìn)行了重新命名。基因長(zhǎng)度分析結(jié)果表明，莖瘤芥ARF基因長(zhǎng)度在1 685(BjARF17B)～4 814 bp(BjARF7C)，CDS長(zhǎng)度在1 167(BjARF13C)～3 594 bp(BjARF7C)，蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度在388(BjARF13C)～1 197 aa(BjARF7C)。對(duì)蛋白等電點(diǎn)的分析結(jié)果表明，莖瘤芥ARF蛋白等電點(diǎn)大小在5.19(BjARF17A)～8.55(BjARF17B)，其中大部分等電點(diǎn)小于7，呈弱酸性。蛋白分子量分析結(jié)果表明，莖瘤芥ARF蛋白分子量在44.44(BjARF13C)～132.64 ku(BjARF7C)。

表2 莖瘤芥ARF基因信息及蛋白理化性質(zhì)Tab.2 Gene information and protein physicochemical properties of ARF genes of tuber mustard

表2(續(xù))

通過(guò)采用TBtools軟件在莖瘤芥全基因組進(jìn)行搜索并未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)的ARF基因?qū)?，但存在多個(gè)片段復(fù)制的ARF基因?qū)Γ瑫r(shí)對(duì)這些基因?qū)Φ腒a/Ks值進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果表明，除BjARF4A∶BjARF4B基因?qū)Φ腒a/Ks值沒(méi)有得出外，其他16個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，說(shuō)明莖瘤芥ARF基因在進(jìn)化過(guò)程中受到純化選擇壓力的影響(表3)。

表3 莖瘤芥ARF片段復(fù)制基因?qū)a/Ks分析Tab.3 Analysis of Ka/Ks in ARF fragment replication gene pairs in tuber mustard

2.2 莖瘤芥ARF基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

為預(yù)測(cè)莖瘤芥ARF基因在響應(yīng)鹽脅迫和病原菌脅迫方面可能發(fā)揮的功能，對(duì)ARF各基因啟動(dòng)子所含有的相關(guān)順式作用元件進(jìn)行了分析。結(jié)果表明(圖1)，主要包含2種響應(yīng)生長(zhǎng)素相關(guān)的順式作用元件(ARFAT和CATATGGMSAUR)，一種響應(yīng)生長(zhǎng)素和水楊酸的順式作用元件(ASF1MOTIFCAMV)，2種響應(yīng)病原菌相關(guān)的順式作用元件(GCCCORE和MYB1LEPR)，一種響應(yīng)病原菌侵染和鹽脅迫相關(guān)的順式作用元件(GT1GMSCAM4)。其中，35個(gè)ARF基因啟動(dòng)子含有ARFAT元件，27個(gè)啟動(dòng)子含有CATATGGMSAUR元件，這2個(gè)元件是受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)表達(dá)的基因通常含有的，說(shuō)明大部分莖瘤芥ARF基因均與生長(zhǎng)素信號(hào)通路密切相關(guān)。所有ARF基因均含有2個(gè)以上GT1GMSCAM4元件，其中多個(gè)基因啟動(dòng)子上該元件數(shù)目超過(guò)10個(gè)，這些基因可能在莖瘤芥響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中具有功能。響應(yīng)病原菌侵染的順式作用元件GCCCORE和MYB1LEPR僅在少數(shù)ARF基因啟動(dòng)子上存在，且只含有一個(gè)，而響應(yīng)效應(yīng)子和病原菌侵染的順式作用元件ELRECOREPCRP1則在25個(gè)啟動(dòng)子上被預(yù)測(cè)到，由于莖瘤芥主要病害根腫菌的效應(yīng)子在其侵染莖瘤芥過(guò)程中具有重要作用，因此，啟動(dòng)子含有多個(gè)該元件的ARF基因，如BjARF9C(5個(gè))、BjARF3D(3個(gè))、BjARF13B(3個(gè))可能在莖瘤芥抵御根腫菌過(guò)程中發(fā)揮功能。

圖1 莖瘤芥ARF啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.1 Analysis of cis-elements in the promoter of ARF genes of tuber mustard

2.3 莖瘤芥ARF基因在不同器官中的表達(dá)分析

為探究不同ARF基因在莖瘤芥各個(gè)組織中可能發(fā)揮的功能，采用qPCR的方法對(duì)莖瘤芥根、莖、膨大莖、葉、花和種莢中的基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，并利用2-ΔΔCT法計(jì)算了各個(gè)ARF基因相對(duì)于內(nèi)參基因Bju18SrRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明，相比于其他基因，BjARF1A、BjARF3D、BjARF4B和BjARF18B在檢測(cè)的6個(gè)組織中相對(duì)表達(dá)量均較高(圖2)，推測(cè)這4個(gè)基因在莖瘤芥的各個(gè)組織中可能類似看家基因一樣具有廣泛的調(diào)控作用。BjARF1B、BjARF2A、BjARF2B、BjARF2C、BjARF2D、BjARF3A、BjARF4A、BjARF5E、BjARF5F、BjARF13A、和BjARF17D則至少在1個(gè)組織中具有較高的表達(dá)水平，說(shuō)明這些基因可能對(duì)1個(gè)或幾個(gè)組織生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用均有貢獻(xiàn)。其他所檢測(cè)的基因在各組織中的表達(dá)水平差異不大。通過(guò)組織表達(dá)水平檢測(cè)還鑒定到一些在某一特定器官中具有高表達(dá)的基因，如相比于其他組織，BjARF1A和BjARF4B在葉中表達(dá)水平高，BjARF7C在根中表達(dá)水平高，BjARF2B和BjARF2C在種莢中表達(dá)水平最高；而B(niǎo)jARF6A雖然在各組織中的表達(dá)水平均較低，但其在膨大莖中的表達(dá)水平要高于其他5個(gè)組織，類似的BjARF7A在花組織中有特異的表達(dá)。這些在單一組織中具有特異表達(dá)模式的ARF基因值得進(jìn)一步對(duì)其在調(diào)控該組織生長(zhǎng)發(fā)育中的功能進(jìn)行研究。

圖2 莖瘤芥ARF基因在不同器官中的表達(dá)模式檢測(cè)Fig.2 The investigation of expression patterns of ARF genes in different organs of tuber mustard

2.4 莖瘤芥ARF基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)分析

為鑒定出可能參與莖瘤芥響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮功能的ARF基因，對(duì)200 mmol/L的NaCl處理0～48 h的莖瘤芥根中的ARF基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，相比于對(duì)照，BjARF1B和BjARF2B在鹽處理3 h后受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)，分別是未處理對(duì)照的40，303倍(圖3)，推測(cè)這2個(gè)基因在莖瘤芥響應(yīng)鹽脅迫的最初期可能發(fā)揮較大作用。此外，BjARF13E在鹽脅迫處理6 h后表達(dá)水平上調(diào)14倍，BjARF9A在鹽脅迫處理6 h后表達(dá)水平上調(diào)6倍，這2個(gè)基因也很可能在鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮功能。同時(shí)，還檢測(cè)到多個(gè)基因在鹽脅迫處理48 h內(nèi)持續(xù)下調(diào)表達(dá)，如BjARF2D、BjARF3A、BjARF6B、BjARF6C、BjARF10B和BjARF13A，其中BjARF2D和BjARF6B在鹽處理3～48 h持續(xù)顯著下調(diào)，而另外4個(gè)基因則在鹽處理3 h后即顯著下調(diào)，后期則在某一時(shí)間點(diǎn)有所恢復(fù)(圖3)。這些鑒定到的受鹽脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)或抑制表達(dá)的ARF基因可能參與莖瘤芥根系對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)及可塑性發(fā)育，值得作為研究重點(diǎn)進(jìn)一步研究它們?cè)谇o瘤芥抗鹽方面的功能。

2.5 莖瘤芥ARF基因在根腫菌脅迫條件下的表達(dá)分析

為鑒定出可能參與莖瘤芥響應(yīng)根腫菌侵染過(guò)程中發(fā)揮功能的ARF基因，對(duì)根腫菌休眠孢子處理0～72 h的莖瘤芥根中的ARF基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，相比于對(duì)照，BjARF3A和BjARF3D的表達(dá)水平分別在根腫菌侵染12，24 h后顯著上調(diào)，如BjARF3D在72 h的表達(dá)水平為對(duì)照的4.6倍，在24 h的表達(dá)水平則達(dá)到對(duì)照的82倍(圖4)，這2個(gè)強(qiáng)烈受根腫菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)的基因很可能在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BjARF13B在根腫菌處理6～72 h的表達(dá)量連續(xù)下調(diào)，且趨勢(shì)逐漸加強(qiáng)，在處理72 h后，表達(dá)量已下降至0 h對(duì)照的2%，說(shuō)明莖瘤芥很可能通過(guò)抑制該基因的表達(dá)完成對(duì)根腫菌侵染的響應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在莖瘤芥抵抗根腫病中的作用有重要意義。BjARF17C和BjARF18A在根腫菌處理12～72 h顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明這2個(gè)基因可能在這幾個(gè)時(shí)間段發(fā)揮重要功能。這些在根腫菌侵染過(guò)程中表達(dá)顯著變化的基因，無(wú)論受到誘導(dǎo)還是抑制作用，均可能在此過(guò)程中發(fā)揮作用，其具體生物學(xué)功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 莖瘤芥ARF基因在根腫菌脅迫處理?xiàng)l件下表達(dá)模式檢測(cè)Fig.4 The investigation of expression patterns of ARF genes in tuber mustard under Plasmodiophora brassicae stress treatment

3 討論

在進(jìn)化上，片段重復(fù)、串聯(lián)重復(fù)和基因組重復(fù)是基因擴(kuò)張的主要方式[15]。莖瘤芥是白菜(Brassicarapa)和黑芥(B.nigra)雜交所得的異源四倍體進(jìn)化而來(lái)，基因組加倍是莖瘤芥ARF基因數(shù)目增加的主要?jiǎng)恿16]。同時(shí)，在莖瘤芥中存在多個(gè)ARF片段復(fù)制基因?qū)Γ沂艿郊兓x擇壓力的影響，這也是ARF基因進(jìn)化的動(dòng)力之一。但是，在莖瘤芥中不存在串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)生的ARF基因?qū)?，與之相似，在大麥(Hordeumvulgare)和谷子(Setariaitalica)中也未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)的ARF基因?qū)17-18]。啟動(dòng)子上的順式作用元件對(duì)于基因的表達(dá)具有重要作用，經(jīng)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，BjARF3D啟動(dòng)子含有3個(gè)響應(yīng)病原菌和效應(yīng)子的ELRECOREPCRP1元件，基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)該基因在根腫菌侵染24 h后其表達(dá)水平上調(diào)82倍，充分利用生物信息學(xué)分析與表達(dá)檢測(cè)分析可為挖掘有價(jià)值的基因進(jìn)行后續(xù)功能研究提供重要依據(jù)。已有研究表明，在大豆GmARF啟動(dòng)子上同樣發(fā)現(xiàn)6個(gè)與生長(zhǎng)素密切相關(guān)的CATATGGMSAUR作用元件，且該基因在下胚軸的表達(dá)受到生長(zhǎng)素2，4-D的顯著誘導(dǎo)[19]，由該順式作用元件在不同物種ARF基因啟動(dòng)子中被發(fā)現(xiàn)這一情況可推測(cè)其對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)通路基因發(fā)揮功能具有重要意義。

基因的組織表達(dá)模式通常和它們所發(fā)揮的功能密切相關(guān)，在莖瘤芥中鑒定到一些在某一特定組織中高表達(dá)的基因，如BjARF1A和BjARF4B在葉中的表達(dá)水平高于其他組織，說(shuō)明這2個(gè)基因與莖瘤芥葉的發(fā)育及功能相關(guān)。已有研究報(bào)道，在棉花(Gossypiumraimondii)和桐油樹(shù)(Physicnut)的葉組織中也檢測(cè)到ARF4的高表達(dá)[20-21]，這些證據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明ARF4在調(diào)控葉片功能方面在多個(gè)物種中相對(duì)保守。生長(zhǎng)素在調(diào)控植物根的可塑性發(fā)育方面發(fā)揮作用，其中ARF7和ARF19在植物側(cè)根發(fā)育和根的向地性方面具有較大貢獻(xiàn)，擬南芥arf7arf19雙重缺失突變體表現(xiàn)為側(cè)根發(fā)育受抑制的表型[22]。在莖瘤芥中，BjARF7C在根中的相對(duì)高表達(dá)水平預(yù)示著該基因在莖瘤芥根系發(fā)生發(fā)育過(guò)程中可能也具有類似的調(diào)控作用。此外，莖瘤芥是一種莖食作物，其膨大莖的生長(zhǎng)狀況與其產(chǎn)量密切相關(guān)，通過(guò)基因表達(dá)模式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BjARF6A在膨大莖中的相對(duì)表達(dá)水平較高，可對(duì)該基因進(jìn)一步深入研究以明確其調(diào)控瘤莖發(fā)育的具體功能，可為培育優(yōu)質(zhì)莖瘤芥品種提供潛在的基因資源。

鹽脅迫是主要的非生物逆境脅迫之一，也是莖瘤芥栽培過(guò)程中面臨的主要逆境，在莖瘤芥中挖掘一些影響植物耐鹽相關(guān)的ARF基因可為緩解莖瘤芥因鹽脅迫造成減產(chǎn)的現(xiàn)狀提供幫助。在甘薯(Ipomoeabatatas)中，ARF5基因在鹽脅迫處理2～48 h之間受到誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)在擬南芥中過(guò)表達(dá)該基因可增加植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[23]。在本研究中，4個(gè)莖瘤芥ARF基因受鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，預(yù)測(cè)它們也很有可能在莖瘤芥抗鹽過(guò)程中發(fā)揮正調(diào)控作用。而在番茄(Solanumlycopersicum)中，抑制ARF4的表達(dá)則可增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[9]，莖瘤芥中有7個(gè)ARF基因的表達(dá)水平受到鹽脅迫的抑制作用，說(shuō)明它們調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫的方式可能與番茄ARF5類似。同為生長(zhǎng)素信號(hào)通路的ARF基因，在鹽脅迫條件下有的被誘導(dǎo)，而有的被抑制，可能是由于它們的結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致發(fā)揮功能的方式上存在差異，產(chǎn)生這種情況的可能是由于ARF作為轉(zhuǎn)錄因子，一些具有轉(zhuǎn)錄激活活性，一些具有轉(zhuǎn)錄抑制活性有關(guān)[24]。

生長(zhǎng)素信號(hào)通路基因通常參與到植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)中，如木薯對(duì)炭疽病的響應(yīng)和擬南芥對(duì)丁香假單胞菌的抗性[25-26]。在單子葉植物慈竹(Bambusaemeiensis)中也發(fā)現(xiàn)，受害蟲(chóng)脅迫后，多個(gè)ARF基因上調(diào)表達(dá)[27]。在根腫菌處理?xiàng)l件下，在莖瘤芥中鑒定出2個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的ARF基因(BjARF3A和BjARF3D)，目前，已知ARF3在調(diào)控雌蕊發(fā)育中發(fā)揮功能且該功能在十字花科不同物種中保守[28]，但其在其他方面的功能還未見(jiàn)報(bào)道，深入對(duì)它們?cè)谇o瘤芥響應(yīng)根腫菌方面的功能研究可增加對(duì)該基因功能的認(rèn)識(shí)。目前，在芥菜類植物中鑒定到的抗病相關(guān)的ARF基因仍然較少，在芥菜(Brassicajuncea)中過(guò)表達(dá)來(lái)源于白芥(Sinapisalba)的ARF10可增強(qiáng)芥菜對(duì)脫落酸的敏感性和對(duì)甘藍(lán)鏈格孢菌(Alternariabrassicicola)的抗性[29]。在莖瘤芥中采用過(guò)表達(dá)或基因沉默的方法可進(jìn)一步驗(yàn)證這些受根腫菌侵染誘導(dǎo)或抑制表達(dá)的ARF基因在莖瘤芥抗根腫病方面的相關(guān)功能。