董書(shū)香，王 峻，陳向丹，丁 陽(yáng)

（湖北省獸藥監(jiān)察所，武漢 430070）

林可霉素（lincomycin）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種林可胺類(lèi)堿性抗生素，其作用機(jī)制與紅霉素非常相似，通過(guò)抑制微生物蛋白質(zhì)的合成而產(chǎn)生作用［1］。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌［2］，如葡萄球菌、溶血性鏈球菌和肺炎球菌作用較強(qiáng)，對(duì)厭氧菌如破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜芽孢桿菌也有抑制作用［3］；對(duì)支原體螺旋體有效，對(duì)弓形體也有一定作用，獸藥臨床上廣泛用于敏感菌所致的畜禽細(xì)菌性疾病的治療，且效果顯著［4］。鹽酸林可霉素在治療各種感染中得到了廣泛應(yīng)用，因此建立鹽酸林可霉素快速而有效的含量檢測(cè)方法尤為重要。目前，鹽酸林可霉素的含量測(cè)定方法有色譜法、質(zhì)譜法、光譜法［5，6］。獸用鹽酸林可霉素可溶性粉，收錄于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）化學(xué)藥品卷［7］，其中采用高效液相色譜法對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定。該方法使用的流動(dòng)相為0.05 mol/L硼砂溶液（用85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.0）-甲醇（4∶6，V/V），在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該流動(dòng)相中使用了高濃度硼砂鹽溶液，硼砂是含10個(gè)水分子的化合物，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易失水風(fēng)化，導(dǎo)致配制的流動(dòng)相中硼砂濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)濃度［8］，且高濃度鹽溶液對(duì)色譜柱和液相系統(tǒng)都有較大的損害，長(zhǎng)期處于高濃度鹽溶液環(huán)境中，將大大縮短色譜柱和儀器的使用壽命［9］。研究一種新的液相色譜方法來(lái)改善以上問(wèn)題，即可提高檢測(cè)效率，又可以延長(zhǎng)儀器和耗材壽命。本研究?jī)?yōu)化了高效液相色譜流動(dòng)相，探討了高效液相色譜法測(cè)定鹽酸林可霉素可溶性粉含量的方法，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

林可霉素對(duì)照品（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量：84.6%，批號(hào)：K0101503）；甲醇、乙腈（安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆樯V純；硼砂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）為分析純；磷酸氫二銨（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）為分析純；水為二次純化水；鹽酸林可霉素原料，輔料，10%鹽酸林可霉素可溶性粉樣品（批號(hào)為201905311、202005081、202005201）均由武漢某獸藥公司提供。

1.2 儀器

島津20AD高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器；Met?tler AE240電子天平；MILIPORE超純水處理器等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，4.6 mm×150 mm，粒徑5μm；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.3.2 溶液的配制 精密稱(chēng)取林可霉素對(duì)照品20 mg，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取鹽酸林可霉素可溶性粉供試品0.2 g，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

1.3.3 線性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取林可霉素對(duì)照品100 mg，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為4 mg/mL貯備液。分別精密量取貯備液適量，用流動(dòng)相分別稀釋至濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、4.0 mg/mL的溶液，各取10μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（mV）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按“1.3.1”色譜條件，分別取供試品輔料空白溶液、對(duì)照品溶液以及供試品溶液注入液相色譜儀，考察專(zhuān)屬性。

1.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（林可霉素0.8 mg/mL）10μL，按“1.3.1”色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察精密度。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)201905311）（林可霉素0.8 mg/mL），按“1.3.1”色譜條件，在不同時(shí)間（0、1、2、4、6、8、10、12、24 h）分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察穩(wěn)定性。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)201905311）（林 可 霉 素0.8 mg/mL）10μL，按“1.3.1”色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察重復(fù)性。

1.3.8 回收率試驗(yàn) 配制10%的鹽酸林可霉素可溶性粉，分別精密稱(chēng)取16、20和24 mg的林可霉素對(duì)照品及0.2 g的輔料置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算林可霉素的含量，計(jì)算回收率。

1.3.9 樣品的測(cè)定 分別取同一廠家不同批號(hào)的鹽酸林可霉素可溶性粉，按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品制備2份，計(jì)算樣品中林可霉素的含量，取平均值。同時(shí)與《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）化學(xué)藥品卷的色譜條件比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性試驗(yàn)

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸（圖1），得回歸方程：y=2×106x+473 55，R2=0.999 7?？梢?jiàn)在此色譜條件下林可霉素在0.1～4.0 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

圖1 林可霉素的線性回歸

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

色譜圖中林可霉素峰與各雜質(zhì)峰分離效果好，含量測(cè)定不受其他雜質(zhì)峰的干擾，色譜圖見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

圖2 林可霉素可溶性粉輔料空白溶液的HPLC圖

圖3 林可霉素對(duì)照品溶液（0.8 mg/mL）的HPLC圖

圖4 林可霉素可溶性粉供試品溶液（0.8 mg/mL）的HPLC圖

2.3 精密度試驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得林可霉素峰面積平均值為1 841 314，RSD為0.3%。該方法表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在不同時(shí)間（0、1、2、4、6、8、10、12、24 h）分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得林可霉素峰面積平均值為1 886 971，RSD為0.4%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得林可霉素峰面積平均值為1 890 536，RSD為0.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

加樣回收率考察結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，林可霉素峰平均回收率為99.5%，RSD為1.2%，表明該法符合試驗(yàn)分析要求，準(zhǔn)確度高。

表1 鹽酸林可霉素可溶性粉的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.7 樣品的測(cè)定

分別取同一廠家不同批號(hào)的樣品，采用“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。樣品測(cè)定結(jié)果中可以看出，該方法與其他兩個(gè)色譜條件測(cè)定的結(jié)果基本一致。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（標(biāo)示量//%，n=2）

2.8 耐用性

比較了InertSustain C18（4.6 mm×150 mm）和Agi?lent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱。結(jié)果表明，兩者均可使林可霉素分離度，理論塔板數(shù)良好，選擇溫度為25℃和35℃時(shí)，除出峰時(shí)間發(fā)生變化外，其余變化很??；將流動(dòng)相水相和有機(jī)相比例調(diào)整為（70∶30，V/V）和（80∶20，V/V）進(jìn)行測(cè)試，表明流動(dòng)相比例的微調(diào)也僅能影響出峰時(shí)間，對(duì)峰形和理論塔板數(shù)影響甚小。不同品牌的色譜柱、不同流動(dòng)相、有機(jī)相與水相比例以及不同溫度，均能滿足試驗(yàn)需要，該方法耐用性較好。

3 小結(jié)

在波長(zhǎng)選擇上，由于林可霉素在200 nm有最大吸收，但該處容易受溶劑干擾［10］，因此本研究沿用《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）化學(xué)藥品卷的214 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。該方法測(cè)定鹽酸林可霉素可溶性粉的含量，與《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）化學(xué)藥品卷方法比較，結(jié)果基本一致。該方法使用了溶解性較好的磷酸氫二銨作為水相溶質(zhì)，且配制流動(dòng)相時(shí)不需要調(diào)節(jié)pH，縮短了時(shí)效，減少了鹽溶液對(duì)色譜系統(tǒng)的污染，提高了色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，同時(shí)操作簡(jiǎn)便、快速，重現(xiàn)性好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為該制劑的含量測(cè)定方法的參考，特別是在獸藥企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量控制方面也有一定的指導(dǎo)作用。