楊雪燕，段 勤，田飛宇，楊 屹，肯生葉

（云南養(yǎng)瑞科技集團(tuán)有限公司，昆明 650217）

加熱不燃燒卷煙（HNB）是利用特殊熱源對(duì)煙草材料進(jìn)行加熱后釋放煙氣，煙草材料只受熱并不燃燒的一種新型煙草制品［1，2］，相對(duì)于傳統(tǒng)卷煙（TC）很大程度上降低了煙草制品對(duì)人體的危害［3］。由于HNB和TC的主體原料、生產(chǎn)工藝及煙用香精香料存在差異，從而導(dǎo)致不同煙草制品的化學(xué)組成存在一定差異［4］。化學(xué)成分分析已成為評(píng)價(jià)煙草材料的一種輔助手段，但煙草材料的成分復(fù)雜，單靠化學(xué)成分分析難以對(duì)其進(jìn)行有效評(píng)價(jià)［5］。

指紋圖譜是一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，具有整體性和模糊性兩大重要特征，能從宏觀上整體反映表征樣品所含化學(xué)成分的種類及數(shù)量［6］，并可通過主成分分析（PCA）、聚類分析（HCA）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，對(duì)其含有的大量復(fù)雜信息進(jìn)行分析，得到一個(gè)客觀、可定量的結(jié)果［7］。近年來指紋圖譜技術(shù)在煙草行業(yè)及煙草制品品質(zhì)分析領(lǐng)域得到了較廣泛的應(yīng)用，李軍等［8］采用固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法建立了卷煙揮發(fā)性成分和半揮發(fā)性成分的特征指紋圖譜，用于真假卷煙的鑒別；余苓等［9］采用煙絲硅烷化氣相色譜指紋圖譜對(duì)不同工藝制備的卷煙產(chǎn)品進(jìn)行區(qū)分；曹建敏等［10］利用同時(shí)蒸餾萃取-GC/MS指紋圖譜結(jié)合系統(tǒng)聚類法能準(zhǔn)確識(shí)別出卷煙樣品所屬產(chǎn)區(qū)，并將不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品區(qū)分開來。前期報(bào)道主要以傳統(tǒng)卷煙作為研究對(duì)象，采用常規(guī)提取技術(shù)對(duì)特征成分進(jìn)行提取，很少借助熱分析技術(shù)對(duì)卷煙樣品進(jìn)行研究。熱裂解作為一種燃燒熱解產(chǎn)物分析技術(shù)，具有操作簡單、無需溶劑、樣品用量少、分析速度快、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。由于加熱時(shí)間短、二次反應(yīng)少，裂解產(chǎn)物能夠反映樣品的初始組成及特征［11，12］。用熱裂解技術(shù)對(duì)煙草材料進(jìn)行分析，可以全面反映煙草材料的特征，并簡化操作流程。

目前，鮮見將指紋圖譜技術(shù)與裂解-氣相/質(zhì)譜法相結(jié)合用于HNB及TC煙草制品對(duì)比分析研究的報(bào)道。因此，建立了國內(nèi)外HNB和TC煙草材料熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜（Py-GC/MS）指紋圖譜模型，并運(yùn)用相似度計(jì)算、聚類分析法對(duì)HNB和TC煙草材料的組成差異進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為不同煙草材料的區(qū)分提供判別依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

主要材料：9個(gè)國內(nèi)外電加熱型卷煙和國內(nèi)傳統(tǒng)卷煙產(chǎn)品。其中，HNB-A、HNB-B、HNB-C為國外稠漿法制備的不同品牌加熱不燃燒卷煙制品，HNB-D為國外造紙法制備的加熱不燃燒卷煙制品，HNB-E、HNB-F分別為國內(nèi)干法和輥壓法制備的加熱不燃燒卷煙制品，TC-A、TC-B、TC-C為國內(nèi)3家煙草公司生產(chǎn)的傳統(tǒng)卷煙產(chǎn)品。

主要儀器：MS204S型電子天平，瑞士Mettler To?ledo公司；7890B-5977A型GC/MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；Pyroprobe 5200型熱裂解儀，美國CDS公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品Py-GC/MS分析 將卷煙樣品中的煙草材料取出，剪碎為小于1 mm2的小碎片，稱?。?.0±0.1）mg樣品，置于熱裂解儀專用石英管中，用石英棉塞住裂解管兩端，然后將石英管轉(zhuǎn)入熱裂解儀中，按熱裂解條件進(jìn)行熱裂解。裂解條件和GC/MS分析條件如下。

裂解溫度：50℃，保持5 s，以20℃/s的升溫速率升至350℃，保持5 s。裂解氛圍：He氣。色譜柱：VF-WAXms（30 m×0.25 mm×0.25μm）；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比為50∶1；色譜柱流量1.0 mL/min；升溫程序：50℃，以4℃/min升至240℃，保持10 min；傳輸線溫度250℃；電離方式：EI；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；質(zhì)量掃描范圍35～550 amu。在裂解試驗(yàn)之間均穿插進(jìn)行空白試驗(yàn)，以觀察樣品是否脫附完全。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 Py-GC/MS數(shù)據(jù)由NIST11數(shù)據(jù)庫對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)譜圖檢索定性，并采用色譜峰面積歸一化法得到化合物的相對(duì)含量。將化合物的相對(duì)含量方差均一化處理，使所有化合物具有相同權(quán)重。采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”建立GC-MS指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，并采用IBM SPSSStatistics軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂解條件的確定

傳統(tǒng)卷煙的使用溫度為600～950℃，煙支燃吸時(shí)會(huì)發(fā)生高溫有氧裂解和燃燒反應(yīng)，而HNB煙草制品的使用溫度一般控制在250～350℃，主要發(fā)生揮發(fā)性物質(zhì)的蒸餾和較低程度的裂解反應(yīng)［13，14］。在無氧氛圍中，較低溫度條件下煙草材料成分主要通過蒸餾和弱的裂解反應(yīng)釋放出來［15，16］。由圖1可知，HNB煙草材料在He氛圍中4個(gè)溫度段（250、280、310、350℃）的蒸餾裂解產(chǎn)物變化不大（各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，色譜圖間的相似度大于0.95），證明在此溫度梯度范圍內(nèi)煙草材料的蒸餾裂解基本達(dá)到平衡。為了綜合考察HNB和TC煙草材料的初始組成成分特征，選擇在350℃條件下進(jìn)行無氧裂解。

圖1 HNB煙草材料在不同溫度下的裂解情況

2.2 色譜條件優(yōu)化

現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)煙草材料的熱裂解成分多采用弱極性的色譜柱（DB-5MS、Ultra 2）進(jìn)行檢測［17，18］，對(duì)于煙草材料體系中含量較大的多羥基醇溶劑（丙二醇、甘油）而言，弱極性的色譜柱易造成拖尾現(xiàn)象，且色譜峰重疊嚴(yán)重（圖2a），不利于有效成分的分析及定量。本研究選用極性較強(qiáng)的VF-WAXms色譜柱進(jìn)行分離，經(jīng)優(yōu)化升溫條件和分流比后，待測成分能夠得到較好分離（圖2b）。

圖2 HP-5MS和VF-WAXms色譜柱分離HNB裂解產(chǎn)物的色譜圖

2.3 煙草材料的Py-GC/MS成分分析

經(jīng)譜圖解析發(fā)現(xiàn)，煙草材料的裂解產(chǎn)物主要有煙堿、醇類、醛類、酮類、酯類、酸類、苯系物和雜環(huán)化合物。篩選確定出分離度較好、質(zhì)譜定性準(zhǔn)確且樣品中均可檢出的共有峰32個(gè)，計(jì)算各峰的相對(duì)百分含量。對(duì)Py-GC/MS譜圖的重復(fù)性進(jìn)行了考察，32個(gè)共有峰相對(duì)峰面積的RSD（n=6）均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

由表1可知，HNB卷煙中的乙酸甘油酯和甘油的相對(duì)含量明顯高于TC卷煙；而TC卷煙中的乙酸、糠醛、過氧化乙酰丙酮、5-甲基呋喃醛、4-環(huán)戊烯-1，3-二酮、糠醇、呋喃酮、吡喃酮、5-羥甲基糠醛的相對(duì)含量較高，與其中含有豐富的糖類物質(zhì)的裂解有關(guān)。

表1 HNB和TC煙草材料的熱裂解成分

2.4 煙草材料裂解產(chǎn)物指紋圖譜的建立及相似度計(jì)算

將9批煙草材料裂解產(chǎn)物的GC/MS色譜圖及百分比數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，選擇2～56 min內(nèi)的色譜圖進(jìn)行分析，得到煙草材料裂解產(chǎn)物的指紋圖譜（圖3）。以HNB-A樣品作為對(duì)照，經(jīng)多點(diǎn)校正和色譜峰自動(dòng)匹配后生成共有模式指紋圖譜，并計(jì)算得出煙草材料裂解產(chǎn)物的相似度。由表2可知，HNB之間、TC之間的相似度較高，分別在0.878～0.999和0.986～0.998范圍；且同由稠漿法制備的煙草材料HNB-A、HNB-B、HNB-C的相似度很高，均大于0.996；輥壓法制備的煙草材料HNB-F與其余HNB煙草材料的相似度也較高，在0.962～0.990；而造紙法制備的煙草材料HNB-D與其余HNB煙草材料的相似度相對(duì)較低，在0.878～0.964。此外，HNB與TC之間的相似度低，在0.304～0.703?？梢?，同種工藝制備的煙草材料相似度偏高，不同工藝制備的煙草材料相似度偏低；且HNB與TC之間的相似度差異大，這種差異可能是造成產(chǎn)品風(fēng)味特征（HNB產(chǎn)品煙熏香較弱）及有害成分差異（TC產(chǎn)品中苯系物含量更高）的重要原因。

表2 HNB和TC煙草材料的相似度

圖3 9種煙草材料的裂解-氣相色譜/質(zhì)譜指紋圖譜

2.5 煙草材料聚類分析（HCA）

采用IBM SPSSStatistics19.0軟件，將9種煙草材料的量化指紋特征（色譜峰峰面積數(shù)據(jù)）作為變量進(jìn)行“組間聯(lián)接”系統(tǒng)聚類分析，以歐式距離平方為度量標(biāo)準(zhǔn)，獲得煙草材料樣品的聚類分析結(jié)果（圖4），它直觀地顯示了樣品逐步合并的過程，橫坐標(biāo)為臨界值即為類間的距離，縱坐標(biāo)為樣品編號(hào)。臨界值越小，表示譜圖越相似。分析結(jié)果顯示，當(dāng)臨界值為10時(shí)，樣品分為兩大類，HNB煙草材料聚為一類，TC煙草材料聚為一類；當(dāng)臨界值為5時(shí)，樣品分為三類，HNB-A、HNB-B、HNB-C、HNB-F聚為一類，HNB-D、HNB-E聚為一類，TC單獨(dú)聚為一類。

圖4 9種煙草材料的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，輥壓法制備的煙草材料HNB-F與稠漿法制備的煙草材料HNB-A、HNB-B、HNB-C聚為一類，這與指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果中HNB-F在與其他煙草材料的對(duì)比中，和HNB-A的相似度最高相互印證。造紙法制備的煙草材料HNB-D與干法制備的煙草材料HNB-E聚為一類，與指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果中，HNB-D和HNB-E間的相似度在與其他煙草材料對(duì)比中相似度最高結(jié)果相互印證。

2.6 HNB和TC煙草材料化學(xué)成分差異的原因分析

對(duì)煙草材料熱裂解產(chǎn)物的指紋圖譜分析及聚類分析評(píng)價(jià)表明，HNB與TC卷煙煙草材料區(qū)別明顯，HNB之間不同制備工藝的煙草材料有一定區(qū)別。分析其主要原因?yàn)椋孩偌訜釋?duì)象不同，TC卷煙的加熱對(duì)象主要為切絲煙葉；而HNB卷煙的加熱對(duì)象為煙草薄片，煙草薄片是利用煙梗、煙末等物料通過重組加工形成的產(chǎn)品［19］，其主要成分為煙粉、膠黏劑、保潤劑（丙二醇和甘油）、增強(qiáng)劑、水、纖維和調(diào)配香精，本質(zhì)上二者的化學(xué)成分差異明顯。②制備工藝不同，TC卷煙材料是基于整個(gè)煙葉組織進(jìn)行晾曬、烘烤、加料、加香等工藝環(huán)節(jié)制成；而HNB卷煙使用的煙草薄片，可以由輥壓法、稠漿法、造紙法和干法等制作工藝制成，煙草原料的化學(xué)成分脫離了煙葉組織細(xì)胞的束縛。輥壓法與稠漿法都是先將煙草原料預(yù)混后抄片，而造紙法與干法是先將煙草物質(zhì)浸提后涂布、分散于纖維基片上，這也可能是造成輥壓法與稠漿法裂解產(chǎn)物相似度高，造紙法與干法裂解產(chǎn)物相似度高的重要原因。③致香機(jī)理不同，TC卷煙燃吸可通過低溫蒸餾、高溫有氧裂解和燃燒等復(fù)雜反應(yīng)使前體物質(zhì)裂解產(chǎn)生上千種小分子物質(zhì)，達(dá)到致香效果［20］；而HNB煙草材料需要在較低的加熱溫度下使有效成分迅速從基體中釋放出來，以滿足其特有的抽吸特征，其感官質(zhì)量的提升主要是由保潤劑攜帶出的添加劑賦予抽吸滿足感［21］。以上這些因素造成了煙草材料在加熱狀態(tài)下的煙氣組成、煙氣狀態(tài)、煙香特征不同，并對(duì)煙草材料的熱裂解成分特征造成影響。

3 小結(jié)

由于HNB和TC卷煙煙草材料的加熱對(duì)象、制備工藝及致香機(jī)理不同，導(dǎo)致其熱裂解產(chǎn)物有較大差異。通過熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合指紋圖譜技術(shù)得到裂解指紋圖譜，并篩選出32個(gè)共有峰?；谀Ｊ阶R(shí)別對(duì)樣品進(jìn)行判別分析，可以較好地區(qū)分HNB和TC卷煙及不同制備工藝的HNB卷煙。該方法能夠簡化大量復(fù)雜的成分信息，并為HNB及TC卷煙煙草材料區(qū)分及不同制備工藝的HNB卷煙材料的區(qū)分提供判別依據(jù)。本研究樣本量相對(duì)較小，后期需要通過增加樣本量，不斷優(yōu)化模型，以提高樣本分析預(yù)判的準(zhǔn)確性。